基于破坏革兰氏阴性菌外膜蛋白组装复合物BAM的抗菌多肽的制作方法

本发明属于生物化学领域中的多肽药物技术领域，具体涉及基于破坏革兰氏阴性菌外膜蛋白组装复合物bam的抗菌多肽。

背景技术：

自青霉素的问世到如今，抗生素一直以来都是人类对抗细菌感染疾病的首选药物。但几十年以来，临床抗生素的频繁使用以及各种抗生素的不正常使用导致全球范围内耐药菌出现的频率大大增加，而每年死于耐药细菌感染的人数也在持续的增加。

阳离子抗菌肽是自然界天然进化而成、具有抗致病微生物感染的生物活性大分子，存在于不同物种的免疫系统内，长度较短一般为10-80个氨基酸。其结构特征为：①携带正电荷，富含碱性氨基酸，此特性被认为是与抗菌肽结合携带负电荷的细菌细胞膜结构有关。②二级结构通常为α螺旋结构。③具有两亲性。阳离子抗菌肽可以通过与细胞内的靶点特异性结合来对细菌产生影响最终导致细菌死亡。而细菌较难通过靶点的突变对抗菌肽产生耐药，因此抗菌肽有希望成为临床治疗重症耐药细菌感染的新型抗生素。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供基于破坏革兰氏阴性菌外膜蛋白组装复合物bam的抗菌多肽，其氨基酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示，或者其氨基酸序列与seqidno.1或seqidno.2所示的序列具有至少70%的同源性。

本发明根据大肠杆菌中诸多外膜蛋白都需要通过外膜上的bam桶蛋白折叠系统来完成修饰和安插到外膜上正确位置的机制，根据文献《structuralbasisofoutermembraneproteininsertionbythebamcomplex》中对bam桶蛋白系统的介绍得知该蛋白系统有五个蛋白质亚基分别为a、b、c、d、e且该系统具有两种构型bamabcde和bamacde，而在两种构型中bama和bamd为必不可少的蛋白质亚基，针对这两种蛋白质亚基设计了七种能与之结合的特异性多肽，通过后续实验设计来测试在干扰了相对应的蛋白亚基情况下是否会对细菌生长存活产生影响。在最后的实验验证中发现有两种短肽具有显著的杀菌效果，分别简称bama-h7（氨基酸序列如seqidno.1所示）和bamd-h7（氨基酸序列如seqidno.2所示）。

本发明中的两种多肽都是对耐药细菌具有较高抑制活性的多肽，而且两种多肽长度比较短，全长分别为9个氨基酸和25个氨基酸，大大的降低了合成的成本。两种多肽的全序列分别为：bama-h7：缬氨酸-丙氨酸-甲硫氨酸-色氨酸-精氨酸-酪氨酸-亮氨酸-酪氨酸-丝氨（vamwrylys）。bamd-h7：丙氨酸-苏氨酸-赖氨酸-精氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-精氨酸-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-谷氨酸-酪氨酸-丝氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-酪氨酸-苏氨酸-谷氨酸（atkrlvflkdrlakyeysvaeyyte）。

体外抗菌实验结果表明，本发明的两种多肽在通过处理进入细胞内部后可以对革兰氏阴性细菌表现出良好的杀菌效果。杀菌曲线结果表明，bama-h7在实验时间内能杀灭99.9%实验菌株，直到8小时候才有所恢复。而bamd-h7同样能在实验时间内杀灭大部分细菌，但恢复时间则为4小时。所述的实验菌株为革兰氏阴性细菌大肠杆菌。

本发明还提供了含有导肽的基于破坏革兰氏阴性菌外膜蛋白组装复合物bam的抗菌多肽，其氨基酸序列如seqidno.4或seqidno.5所示，或者其氨基酸序列与seqidno.4或seqidno.5所示的序列具有至少70%的同源性。

本发明在bama-h7或bamd-h7的氨基端融合上能特异性穿透细胞膜的导肽，导肽的氨基酸序列为kffkffkffkgsg(seqidno.3)，融合多肽bama-h7的氨基酸序列为：kffkffkffkgsgvamwrylys(seqidno.4)；融合多肽bamd-h7的氨基酸序列为：kffkffkffkgsgatkrlvflkdrlakyeysvaeyyte(seqidno.5)。实验结果显示，在两段多肽的前端偶联上能特异性穿透细胞膜的导肽，融合后能直接进行杀菌。

附图说明

图1是bama-h7和bamd-h7的初步杀菌实验结果。

图2是液体培养持续杀菌效果实验所测od值的原始数据。

图3是两种多肽液体培养持续杀菌曲线图。

图4是两种多肽偶联特异性穿透细胞膜的导肽后杀菌效果的测试结果。

图5是两种抗菌多肽在相应介质中的杀菌实验结果。

图6是两种抗菌多肽的浓度梯度杀菌实验结果。

实施例1

抗菌多肽的制备

氨基酸序列为seqidno.1，no.2，no.3，no.4和no.5的多肽由杭州丹港生物科技有限公司合成，多肽经过严格质量检测，含质谱分析报告和hplc分析报告，多肽的纯度在80%以上。

实施例2

杀菌效果的初步测试

1、配置20mllb液体培养基，并按1：100向培养基内接入200μl的平台期大肠杆菌，放入摇床培养2个小时至od值为0.6左右。

2、取培养好的对数期的大肠杆菌分装至ep管中，一支100μl，在5000xg4℃的条件下离心10分钟并收集菌体。

3、用0.9%nacl重悬菌体，并在5000xg4℃条件下离心十分钟，重复2次洗去残余的lb培养基。

4、弃上清后用100μl的1mmedta、20mmtirs、0.4m蔗糖混合溶液以及本发明的多肽bama-h7（浓度10nmol/l1ul）或bamd-h7浓度（10nmol/l1ul）混合处理，时间为60min。

5、处理完毕后取一部分进行稀释点平板观察结果，取剩下的部分接入新鲜lb培养基中进行培养观察。

结果如图1所示，在五倍稀释点平板的情况下可以发现bama-h7的杀菌效果非常好，能达到5-6个数量级，而bamd-h7也有2-3个数量级的杀菌效果，推测在干扰了bama和bamd的相关功能后，使得外膜蛋白不能正确的折叠修饰，错误折叠的蛋白不断在细胞内积累对细胞产生毒害，最后导致细胞死亡。

在后续的液体培养实验中通过测量液体培养的od值，以培养时间为横坐标、od值为纵坐标绘制杀菌曲线，每一次测量均是两次平行实验测量，误差允许范围内取其平均值，并与实验对照（不加入多肽的样品）和空白对照（不加入多肽且未经实验处理的样品）比较观察其折线图趋势。

从图2-3结果可以看出，两种抗菌多肽都具有十分明显的杀菌效果，其中bama-h7处理过的菌液接入新鲜lb培养基后培养了8个小时后细菌仍然没有生长起来，而bamd-h7在相同的情况下培养了4个小时才生长起来。这表明了bama-h7号抗菌肽在处理时就能杀灭99.99%的细菌，而在随后的培养中仍然能持续杀菌直至多肽消耗完毕。

实施例3

含有导肽的融合多肽的灭菌实验

在bama-h7或bamd-h7的氨基端融合上能特异性穿透细胞膜的导肽，导肽的氨基酸序列为kffkffkffkgsg，融合多肽bama-h7的氨基酸序列为：kffkffkffkgsgvamwrylys；融合多肽bamd-h7的氨基酸序列为：kffkffkffkgsgatkrlvflkdrlakyeysvaeyyte。

在两段多肽的前端偶联上能特异性穿透细胞膜的导肽，融合后能直接进行杀菌。

1、配置20mllb液体培养基，并按1：100向培养基内接入200μl的平台期大肠杆菌，放入摇床中培养2个小时至od值0.6左右。

2、取培养好的对数期大肠杆菌100μl装一只ep管，13000g离心3分钟，去除上清。

3、收集沉淀后用0.9%nacl重悬，然后13000g离心3分钟，去上清，收集沉淀。

4、将偶联上导肽的bama-h7溶解在nacl、生理盐水、pbs等三种介质中，100μl介质中加入1μl多肽溶液。将偶联上导肽的bamd-h7也同样溶解在三种介质中，同理100μl中加入1μl。

5、用提前溶解好的多肽溶液去重悬沉淀，将重悬起来的菌液放置在37°培养箱中处理5分钟。

6、将处理完的菌液进行稀释点平板实验观察杀菌结果。

图4结果显示，两种融合多肽在三种不同的介质中杀菌效果是不一样的，其中bama-h7在三种介质中都有比较明显的结果，而bamd-h7在三种介质中的生理盐水和双蒸水中具有杀菌效果，在pbs中则没有效果。

实施例4

以nacl为介质的融合多肽bama-h7的灭菌实验、以双蒸水为介质的融合多肽bamd-h7灭菌实验

根据实施例2的实验结果，针对两种融合多肽选取了不同的两种介质，即bama-h7选择0.9%nacl作为介质，而bamd-h7选择双蒸水作为介质。

多肽的终浓度依次设置为5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l的梯度浓，其它实验步骤同实施例3，结果如图5和图6所示。

图5显示，与本发明的多肽偶联的导肽在两种介质中也具有杀菌效果，但跟两种多肽有着明显的区别，映证在对应的溶解介质中本发明的多肽的杀菌效果是真实有效的而非导肽的穿透毒性导致的。

图6显示，融合多肽bama-h7以及bamd-h7，随着浓度的增加，其杀菌效果也有明显的增加，说明本发明遵循浓度梯度杀菌规律，即在正常实验条件下所用多肽浓度越大其杀菌效果越好。

序列表

<110>福建师范大学

<120>基于破坏革兰氏阴性菌外膜蛋白组装复合物bam的抗菌多肽

<130>2018

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>9

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

valalamettrpargtyrleutyrser

15

<210>2

<211>25

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

alathrlysargleuvalpheleulysaspargleualalystyrglu

151015

tyrservalalaglutyrtyrthrglu

2025

<210>3

<211>13

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

lysphephelysphephelysphephelysglysergly

1510

<210>4

<211>22

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

lysphephelysphephelysphephelysglyserglyvalalamet

151015

trpargtyrleutyrser

20

<210>5

<211>38

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

lysphephelysphephelysphephelysglyserglyalathrlys

151015

argleuvalpheleulysaspargleualalystyrglutyrserval

202530

alaglutyrtyrthrglu

35