一种即用型培养装置的制备及灭菌方法与流程

本发明涉及卫生检验细菌学检测技术领域，特别是涉及一种大肠菌群、耐热大肠菌群及大肠埃希氏菌最可能数(mpn)检测的即用型培养装置的制备及灭菌方法。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

水、食品、化妆品和公共场所等公共产品的卫生微生物指标中大肠菌群、耐热大肠菌群(粪大肠菌群)及大肠埃希氏菌检测包括多管发酵最可能数(mpn)法、滤膜法、平板计数法、酶底物法等。而其中多管发酵最可能数(mpn)法以其技术难度低、试剂成本低、检测范围宽等优点获得了广泛应用，特别是在小型实验室应用中优势突出。在我国《gb/t5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标》中总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌的检验，《gb4789.3-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》，《gb4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》，《gb/t18204.10-2000游泳池水微生物检验方法大肠菌群测定》，《水和废水监测分析方法(第四版)》中水中总大肠菌群的测定和水中粪大肠菌群的测定等中多管发酵最可能数(mpn)法均为第一法；在《化妆品安全技术规范(2015版)》中粪大肠菌群检验，《gb4789.39-2013食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数》，《gb/t18204.4-2013公共场所卫生检验方法第四部分：公共用品用具微生物》中大肠菌群多管发酵法，《gb-18466-2005医疗机构水污染物排放标准》附录a(规范性附录)医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法中多管发酵最可能数(mpn)法等中均为唯一方法。

多管发酵最可能数(mpn)法的基本实验流程包括初发酵、平板分离和复发酵，以大肠菌群能发酵乳糖产酸产气的生化特征为基础，通过培养大肠菌群一段时间后观察产酸产气现象。现在的检测过程中一般采用内置小倒管(倒置杜汉氏管)的含乳糖类培养基(如乳糖蛋白胨培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖胆盐发酵培养基(含中和剂)、煌绿乳糖胆盐肉汤、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)、乳糖肉汤、现隐肉汤等)的试管培养受试样本，观察产酸产气的效果，培养所用试管需要使用前实验室自制，即实验室自行配制培养基、将杜汉氏管倒置装入试管中、分装培养基、高压灭菌除气、培养后洗刷杜汉氏管等过程，程序复杂，耗费大量人工。制约该培养管即用型商品化的技术瓶颈在于目前使用的杜汉氏管如图1所示，在细长的培养管中倒置一只小试管，若生产商制备后的成品培养管，经运输等震荡后空气易进入小倒管，而小倒管口径较小且与发酵试管呈180夹角倒置状态，使用前气体排出较难，需要依靠熟练的实验人员选取好合适的角度，缓慢充入液体，压出气体，每支管均需谨慎操作，要较长的时间。发明人为了解决上述瓶颈技术在本申请同日提交的专利中提供了一种用于最可能数法检测菌群的即用型培养装置，采用外置型的产气管，通过弯接管与主管连接，是产气管的内径与倒置角度选择自由度变大，可以显著的降低排除产气管中气泡的难度。

技术实现要素：

本申请涉及的培养管具有硬质主管与硬质产气管，通过弯接管连接，采用封闭的硬质产气管代替现有技术中的内置小倒管，不再置于发酵管内部，不再受内置管径限制和倒置位置限制；从而使硬质产气收集管的内径和倒置角度选择自由度变大，使发酵用硬质主管与硬质产气收集管的管道连接更为通畅，便于气体排出。该培养管应用于工业生产，制造商在生产完毕后装入干粉培养基后密封包装即可，技术人员使用时只需打开包装加入适当溶剂的水即可使用，快速高效、省时省力。

针对以上技术方案，本申请进一步提供该即用型发酵培养管的制备方法及灭菌方法，采用本申请中的灭菌方法可以实现一次性大批量的灭菌，节约生产步骤。

为了实现以上技术效果，本申请提供以下技术方案：

本申请第一方面，提供一种培养管，该培养管包括主管，弯接管及产气管；所述主管为筒状构件，所述弯接管为弯折一定角度的筒状构件，产气管为一端封闭的筒状构件，所述主管、弯接管及产气管首尾依次连接，主管长度大于产气管的长度，主管内径大于产气管内径。

优选的，所述主管、产气管为硬质材料制备而成。

优选的，该主管、产气管的材料为合成树脂、有机玻璃、高硼硅玻璃、聚丙烯中的一种。

优选的，所述产气管包括延伸部及密封部，所述延伸部为筒状构件，所述密封部与延伸部一体成型，构成为封闭的空腔。

进一步优选的，所述密封部为沿延伸部向外突出的半球型构造。

进一步优选的，所述密封部为片状对延伸部一端进行封闭。

优选的，所述产气管包括延伸部及密封部，所述延伸部为筒状构件，所述密封部为可拆卸的塞子。

进一步优选的，所述塞子为不透气材质制备而成。

优选的，所述弯接管为软质材料制备而成。进一步优选的，该弯接管为硅胶、橡胶、塑料或树脂材料的软质空腔管路。

优选的，所述主管、弯接管、产气管一体成型，构成一端封闭的一段连续空腔。

优选的，所述弯接管的弯折角度为35度至180度。

优选的，所述主管及产气管的内径为0.6-4cm，长度为3-25cm。

优选的，所述培养管还具有管帽，所述管帽尺寸与主管尺寸相配合，用于盖合主管。

进一步优选的，所述管帽为隔水透气硅胶、橡胶、塑料或树脂材料制备而成。

本申请第二方面，一种应用于mpn检测方法的即用型培养管，该即用型培养管为上述培养管中加入培养基制备而成。

通过对上述培养管构造的描述，本申请中的培养管具有连续的空腔及缩颈构造，主管及产气管呈一定的夹角，样品在发酵过程中生成的气体聚集于产气管顶部形成一段肉眼可见的空腔，从而完成检测的过程。该构造的培养管可以显著降低排气难度，生产商可以在完成培养管的生产后向管中充入培养基，制备成为一种撕开包装即可使用的培养管。

本申请第三方面，提供上述培养管的制备方法，该制备方法包括分体式培养管制备方法及一体式培养管制备方法：

所述分体式培养管通过注塑或吹塑制备主管和产气管，采用有机硅胶材料通过模压成型法制备弯接管；

优选的，所述弯接管硬度40-70度。

针对该分体式培养管，采用分离的主管、弯接管及产气管通过拼接的方式连接。本申请研究发现采用有机硅材料制备的弯接管无毒无味、具有稳定的化学性能及机械强度，且该有机硅材料的吸附性能够使该分体式培养管的连接更为牢固。

所述一体式培养管的制备方法包括产气管为一体的培养管的制备方法及产气管密封部为塞子的培养管的制备方法；

所述产气管为一体的培养管通过吹塑法制备，选择相应规格的模具，吹塑成型后脱模；

本申请研究发现针对该构造的培养管采用吹塑的方式制备相比注塑具有更好的密封部成形效果，

所述产气管密封部为塞子的培养管通过注塑加工的方式制备，通过模具注塑成型后抽芯脱模。将热塑树脂原料注入对开模具中，通过通入压缩空气使管壁贴紧模型内壁，可通过控制气流获取相应构造的密封部，节约工厂开模的费用。

优选的，上述培养管的主管内径0.6-4cm，长度为3-25cm，产气管内径0.6-4cm，长度为3-10cm；弯接管部分夹角度数为0-135度，与主管相连接处内腔直径0.7-4.1cm，与产气管相连接处内腔直径0.7-4.1cm，壁厚0.1-0.5cm。

根据国标检测标准，通常一只培养管中的培养基体积为10ml左右，本申请中的培养管主管与产气管呈现一定的夹角，且使用前需要将产气管中的气体排空，采用上述尺寸的培养管能够保证培养管中的培养基达到有效液面高度，完成检测。

优选的，将上述培养管加入干粉或液体培养基后盖好管帽，放入包装袋中进行密封。

优选的，所述加入液体培养基的培养管为聚丙烯材质培养管。

本申请第四方面，提供上述即用型培养管的灭菌方法，其特征在于，将装有干粉培养基的培养管加盖塞子及管帽，装入独立包装袋中，在未封口的状态下经通过伽马射线灭菌，封口后通过环氧乙烷对外包装进行灭菌；

或按照样本检测标准配置相应的单料、双料或三料培养基液体培养基，并加入到聚丙烯材质的培养管中，加聚丙烯材质的塞子及硅橡胶管帽，经高温蒸汽灭菌后装入独立包装袋，对独立包装袋进行封口之后采用环氧乙烷对外包装进行灭菌。

通常状况下，因不同部件对灭菌条件要求的不同，生产厂商在制备过程中需要将培养管灭菌后进行组装，组装过程中产品可能再次染菌，因此在包装前及密封后还需要重复进行灭菌的过程，采用本申请的方法，可以节约灭菌步骤，并且灭菌效果满足国家标准规定。

由于液体培养基不适用于环氧乙烷灭菌及辐照灭菌的方式，需要采用高压蒸汽灭菌，本申请采用耐高压的聚丙烯材料制备液体培养基的培养管，可直接将液体培养基充入培养管中，对培养基整体进行高压蒸汽灭菌，节约灭菌的步骤。

该培养管中充入干粉培养基后进行密封，在未封口的状态下先采用伽马射线灭菌，针对该干粉状态的培养管能够实现良好的穿透效果，灭菌效果彻底。由于包装封口通常采用热熔或胶粘的方式，本申请研究发现采用伽马射线对外包装进行灭菌会影响包装密封效果，环氧乙烷可在低温条件下进行灭菌，对本品外包装进行灭菌，灭菌效果良好且不会影响包装的质量。

优选的，所述伽马射线的剂量为17～19kgy，进一步优选的，为18kgy。

采用该剂量的伽马射线进行辐照，可瞬时完成灭菌的过程，能够完好的穿透管壁对内部进行灭菌，且不会影响包装的质量。剂量低则难以彻底灭菌，剂量高则有可能会产品本身造成破坏作用。

优选的，所述环氧乙烷灭菌浓度为700～800mg/l，温度55℃～60℃，相对湿度60％～80％，作用时间3～4h。

环氧乙烷灭菌通常采用灭菌仓的形式，针对本申请中的即用型培养管，采用上述参数进行环氧乙烷灭菌可以实现一单位灭菌仓内的即用型培养管得到彻底的灭菌效果。温度过高过湿的条件会降低密封性，过低则不利于全部包装的彻底灭菌。

优选的，所述独立包装材料为低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯。

本申请研究表明，选用上述材料制备的包装能够满足良好密封性能。

优选的，所述液体培养基高温蒸汽灭菌的条件为121℃，灭菌15min。

本发明的有益效果

本申请提供了一种产气管外置的培养管，克服了现有技术中杜汉氏管使用前排气困难的技术缺陷，并提供了该培养管的制备方法及灭菌方法，针对本申请中不同形式的培养管提供了相应的制备和灭菌方法，依照本申请中灭菌方法制备的产品符合《gb16352-1996一次性医疗用品γ射线辐照灭菌标准》，应用于工业生产能够显著节约生产步骤。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为现有技术中采用的杜汉氏发酵培养管；

图2为实施例1中的即用型培养管；

其中，11为管帽，12为主管，13为弯接管，14为产气管，141为密封部，142为延伸部，a1为使用状态的培养液。

图3为实施例2中的即用型培养管；

其中，11为管帽，12为主管，13为弯接管，15为产气管，151为延伸部，152为密封部，a1为使用状态的培养液。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

我国现行大肠菌群检测标准中采用杜汉氏培养管对样品进行初发酵培养，该培养管在使用前需要将内置小倒管中的气泡完全排出，操作费时费力。本申请提供了一种产气管外置的培养管，大大降低了使用前排气的难度，生产商可直接充入培养基制备成为一种即用型的培养管，本申请针对该即用型的培养管提供了一种制备方法及灭菌方法。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。

实施例1

本实施例中的培养管如附图2所示，该培养管包括主管12，弯接管13及产气管14；所述主管12为筒状构件，所述弯接管13为弯折一定角度的筒状构件，产气管14为一端封闭的筒状构件，所述主管12、弯接管13及产气管14顺序连接，一体成型，构成一端封闭的一段连续空腔。

该主管12、产气管14的材料为合成树脂。

所述产气管14包括延伸部142及密封部141，所述延伸部142为筒状构件，所述密封部141与延伸部142一体成型，构成为封闭的空腔。

所述密封部141为沿延伸部向外突出的半球型构造。

所述弯接管的弯折角度为60度。

主管12及产气管14的内径分别为2cm及0.6cm，长度分别为20cm及10cm。

所述培养管还具有管帽11，管帽11盖合于主管12上。

所述管帽11为隔水透气硅胶制备而成。

a1为使用状态的培养基。

实施例2

本实施例中的培养管如附图3所示：该培养管包括主管12，弯接管13及产气管15；所述主管12为筒状构件，所述弯接管13为弯折一定角度的筒状构件，产气管15为一端封闭的筒状构件，所述主管、弯接管及产气管顺序连接。

该主管12、产气管15的材料为合成树脂。

产气管15包括延伸部151及密封部152，所述延伸部151为筒状构件，所述密封部152为可拆卸的塞子，所述塞子为不透气材质制备而成。

所述弯接管13的弯折角度为120度。

所述主管12及产气管15的内径分别为3cm和1cm，长度分别为23cm和5cm。

所述培养管还具有管帽11，用于盖合主管。所述管帽11为塑料制备而成。

a1为使用状态的培养基。

实施例3

本实施例中提供一种分体式培养管的制备方法及灭菌方法，分别开主管、产气管及弯接管模具，通过注塑制备主管和产气管，采用有机硅胶材料通过模压成型法制备弯接管；弯接管硬度为50度。之后将主管、弯接管、产气管依次拼接组装成为培养管。

向拼接好的培养管中加入乳糖胆盐发酵干粉培养基，盖好管帽后装入低密度聚乙烯独立包装袋中，通过18kgy的伽马射线灭菌，通过热熔对包装进行封口，之后将包装袋放入环氧乙烷灭菌仓中对外包装进行灭菌；环氧乙烷灭菌浓度为750mg/l，温度58℃，相对湿度75％，作用时间3.5h。

实施例4

本实施例中提供一种一体式培养管的制备方法及灭菌方法，首先开模具，将聚丙烯热塑材料吹塑成型后脱模。向制备完毕的聚丙烯培养管中充入使用浓度的双料乳糖胆盐发酵液体培养基，加配聚丙烯管帽后在高温蒸汽灭菌锅中完成对液体培养基的灭菌，高温蒸汽灭菌的条件为121℃，灭菌15min。

将灭菌完毕后的培养管装入独立包装袋中进行封口，将密封后的包装袋置于环氧乙烷灭菌仓中完成灭菌，环氧乙烷灭菌浓度为800mg/l，温度60℃，相对湿度80％，作用时间4h。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。