一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法与流程

本发明涉及寄生虫扩增检测技术领域，特别是指一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法。

背景技术：

寄生虫病的诊断在经历了普通病原学、免疫学诊断后，近年来随着分子生物学诊断技术的不断提高，以目标dna序列为检测对象的核酸检测法已能准确地对寄生虫做出诊断和检测。其中，尤以pcr技术发展最快，同时，以pcr为基础的实时定量pcr、多重pcr、巢式pcr等将这一技术发展到更高的水平。但是，由于核酸的检测过程往往需要昂贵的仪器设备、专业的技能型人才、复杂的操作过程、冗长的试验周期等，不能适应基层及现场的快速检测需求，限制了相关技术的推广应用。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种快速、简单、灵敏、特异且成本低的非pcr核酸扩增方法。当前，lamp已经广泛应用于医疗卫生、食品安全、胚胎鉴定、动植物检验检疫、转基因产品等多个领域的病毒、微生物、寄生虫等病原体的分子检测。ortleppascarissinensis是寄生于扬子鳄胃肠道内的一种蛔目线虫，能对扬子鳄胃肠壁造成一定损伤，也是扬子鳄肠道内的优势寄生虫。蛔目线虫在扬子鳄肠道内大量繁殖将导致扬子鳄因消化道内寄生大量蛔虫而出现食欲不振、体格消瘦，甚至大量死亡。由于扬子鳄是我国特有的珍稀野生动物，也是世界上现存23种鳄中最濒危的物种之一，不可能采取定期剖杀来检查肠道内寄生线虫情况，且传统的粪样形态学检测操作复杂、容易漏检，分子检测又需要专业的仪器才能进行。因此，开发出一种对扬子鳄蛔目线虫ortleppascarissinensis的检测方法是目前急于解决的技术问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法，以解决现有技术中全部或者部分不足。

基于上述目的本发明提供的一种扬子鳄线虫环介导等温扩增方法，包括如下步骤：

1)线虫o.sinensis基因克隆：采用上下游引物对线虫o.sinensis基因的内转录间隔区its进行pcr扩增，pcr产物纯化后，连接到载体pmd19-t上，然后转化至大肠杆菌中表达，筛选阳性克隆进行测序鉴定，得克隆扩增的线虫o.sinensisits序列，其中，上下游引物序列分别为：

nc5：5`-gtaggtgaacctgcggaaggatcatt-3`；

nc2：5`-ttagtttcttttcctccgct-3`；

2)lamp(环介导等温扩增)引物设计：将克隆扩增的线虫o.sinensisits序列分为六个独立的区域，采用引物软件分别设计lamp反应所需的6条引物，其中，包括外引物，f3：5`-gcagacacattgagcact-3`；

b3：5`-ggagctcgataacgaaagc-3`；

内引物，fip：

5`-acgaccctcagccagacgtgaagactttgaacgcgcattg-3`；

bip：5`-ggcgtcatcgcgttgatacgtctgagcgtagtatcctgaa-3`；

环引物，lb：5`-aacgggaaagaacccgat-3`；

lf：5`-cgtgctatcagaaatgcaagt-3`；

3)lamp反应：根据设计的6条lamp引物，以线虫o.sinensis基因组dna质粒为模板，进行lamp反应；

4)lamp反应结果检测：分别采用tvr显色法和浊度法来检测结果。

可选的，所述(1)的pcr扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，46℃～56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃终延伸10min。

可选的，所述(1)中pcr产物纯化采用1％琼脂糖电泳和dna胶回收试剂盒纯化。

可选的，所述(1)中pcr反应总体积为25μl，含2.5μl10×buffer、2.0μl的2.5mol/lmgcl2、4.0μl的2.5mm/leachdntps、10μmol/l上下游引物各0.5μl、100ng模板基因组dna和0.25μl的5u/μltaqdna聚合酶，加无菌水补足。

可选的，所述(3)lamp反应的体系25μl：ph8.8，20mmtris-hcl、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、0.8mbetaine、8mmmgso4、1.4mmeachdntp、8ubstdnapolymerase、40pmolfip和bip，5pmolf3和b3，20pmollb和lf。

可选的，所述(3)lamp反应的温度为60～67℃，时长55～65min。

可选的，所述(3)lamp反应结束前需要在80℃灭活10min。

一种lamp检测扬子鳄线虫的方法，将收集的阳性粪样冻存灭活虫卵，然后提取线虫o.sinensisdna，测定o.sinensis质粒dna的浓度，然后做10倍比梯度稀释，进行所述lamp反应，分别采用所述tvr显色法和浊度法来检测结果。

可选的，所述冻存的温度为零下75～85℃。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法，根据线虫o.sinensis的靶序列its建立了lamp反应体系，在线虫o.sinensis成虫和感染该线虫的扬子鳄粪样中扩增到了特异性产物，检测到成虫基因组dna的敏感性为3.46pg/μl，是pcr法检测敏感性的10倍，并且与人蛔虫、裂头绦虫、大片吸虫、日本血吸虫、旋毛虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫、异尖线虫、cucullanuselongatus均未出现交叉反应，在临床上，可从感染线虫o.sinensis的扬子鳄粪样中扩增出特异性dna。本方法无需昂贵仪器，仅需一个水浴锅，利用具有链置换活性的bstdna聚合酶，在64℃条件下，保温1h，即可完成核酸扩增反应，反应后加入核酸染料即可观察结果，且与其它寄生虫未出现交叉反应，缩短了现场检测时间，有利于在基层卫生机构、床边检测和流行病学调查等领域推广使用。

附图说明

图1为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应引物实时浊度仪结果示意图；

图2为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应温度实时浊度仪结果示意图；

图3为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应敏感性实时浊度仪检测结果示意图；

图4为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应敏感性tvr染料检测结果示意图；

图5为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应敏感性pcr检测结果示意图；

图6为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应特异性实时浊度仪检测结果示意图；

图7为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应特异性tvr染料检测结果示意图；

图8为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应特异性pcr检测结果示意图；

图9为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应粪样实时浊度仪检测结果示意图；

图10为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应粪样tvr染料检测结果示意图；

图11为本发明实施例基于its基因的线虫o.sinensislamp反应粪样pcr检测结果示意图。

图4～5中：1-34.60ng/μl，2-3.46ng/μl，3-0.346ng/μl，4-34.60pg/μl，5-3.46pg/μl，6-0.346pg/μl，7-.双蒸水；

图7～8中：1-os(ortleppascarissinensi)，2-al(ascarislumbricoides)，3-an(anisakissp.)，4-tsp(trichinellaspiralis)，5-ce(cucullanuselongatus)，6-ts(taeniasolium)，7-ta(taeniaasiatica)，8-li(ligulasp.)，9-fg(fasciolagigantica)，10-sj(schistosomajaponicum)，11-双蒸水；

图10～11中：1～6分别为f1～f6粪样标本，7～10分别为f7～f10阴性粪样标本，11-双蒸水。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

lamp法核糖核酸扩增试剂盒(dnaamplificationkit)，日本荣研化学株式会社(eikenchemicalco.,ltd,tochigi,japan)；lamp反应管(reactiontube)，日本荣研化学株式会社；可视染料(tevisualreagent,tvr)，天津捷易特生物科技有限公司；质粒pmd19-t载体、菌种e.colidh5α购自上海生工生物工程有限公司。组织基因组dna提取试剂盒使用(tianampgenomicdnakit)，北京天根生化科技有限公司；粪便基因组dna提取试剂盒(tianampgenomicdnakit)，北京天根生化科技有限公司；实时浊度仪la-320c，日本荣研化学株式会社；分光光度计nanodropnd-1000，美国赛默飞世尔公司。

扬子鳄线虫ortleppascarissinensis收集于安徽扬子鳄国家级自然保护区(30°94′n,118°79′e)，即中国鳄鱼湖(zhaoetal.,2014)。用于lamp特异性实验对照的线虫人蛔虫(ascarislumbricoides)、裂头绦虫(ligulasp.)、大片吸虫(fasciolagigantica)和日本血吸虫(schistosomajaponicum)由皖南医学院医学寄生虫学教研室提供，旋毛虫(trichinellaspiralis)由郑州大学医学寄生虫学教研室提供，猪带绦虫(taeniasolium)和亚洲带绦虫(taeniaasiatica)由云南大理大学医学寄生虫学教研室提供，异尖线虫(anisakissp.)和cucullanuselongatus由美国加州大学圣芭芭拉分校提供。所有线虫采用组织基因组dna提取试剂盒提取，严格按照说明书操作进行。

为了解决现有技术中的全部或者部分不足，本发明实施其一目的是提供的一种扬子鳄线虫环介导等温扩增方法，包括如下步骤：

1)线虫o.sinensis基因克隆：采用上下游引物对线虫o.sinensis基因的内转录间隔区its进行pcr扩增，pcr产物纯化后，连接到载体pmd19-t上，然后转化至大肠杆菌中表达，筛选阳性克隆进行测序鉴定，得克隆扩增的线虫o.sinensisits序列，其中，上下游引物序列分别为：

nc5：5`-gtaggtgaacctgcggaaggatcatt-3`；

nc2：5`-ttagtttcttttcctccgct-3`；

2)lamp(环介导等温扩增)引物设计：将克隆扩增的线虫o.sinensisits序列分为六个独立的区域，采用引物软件分别设计lamp反应所需的6条引物，其中，包括外引物，f3：5`-gcagacacattgagcact-3`；

b3：5`-ggagctcgataacgaaagc-3`；

内引物，fip：

5`-acgaccctcagccagacgtgaagactttgaacgcgcattg-3`；

bip：5`-ggcgtcatcgcgttgatacgtctgagcgtagtatcctgaa-3`；

环引物，lb：5`-aacgggaaagaacccgat-3`；

lf：5`-cgtgctatcagaaatgcaagt-3`；

3)lamp反应：根据设计的6条lamp引物，以线虫o.sinensis基因组dna质粒为模板，进行lamp反应；

4)lamp反应结果检测：分别采用tvr显色法和浊度法来检测结果。

本发明实施其二目的是提供的一种lamp检测扬子鳄线虫的方法，将收集的阳性粪样冻存灭活虫卵，然后提取线虫o.sinensisdna，测定o.sinensis质粒dna的浓度，然后做10倍比梯度稀释，进行所述lamp反应，分别采用所述tvr显色法和浊度法来检测结果。

(1)线虫ortleppascarissinensisits基因克隆及质粒建立

扩增内转录间隔区its(its1,5.8sribosomalrdna,andits2)，采用的上下游引物分别为：nc5：5`-gtaggtgaacctgcggaaggatcatt-3`，nc2：5`-ttagtttcttttcctccgct-3`。pcr反应总体积为25μl，含2.5μl10×buffer、2.0μl的2.5mol/lmgcl2、4.0μl的2.5mm/leachdntps、10μmol/l上下游引物各0.5μl、100ng模板基因组dna和0.25μl的5u/μltaqdna聚合酶，加无菌水补足。pcr反应条件是：95℃预变性5min；95℃变性30s，46℃～56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃终延伸10min。pcr产物用1％琼脂糖电泳和dna胶回收试剂盒纯化后，连接到载体pmd19-t上，转化至大肠杆菌(dh5α感受态细胞)中，通过蓝白斑筛选，将阳性克隆进行测序鉴定，作为lamp反应灵敏性和特异性的标准阳性对照。

(2)lamp引物设计

针对本研究已成功克隆扩增的线虫o.sinensisits859bp序列(登录号：genbankkm891739)，根据引物软件网址(http://primerexplorer.jp/e/)进行特异性lamp引物设计，将待扩增的序列分为六个独立的区域，分别设计lamp反应所需的6条引物，其中包括外引物(f3、b3)、内引物(fip、bip)和环引物(lb、lf)，优选设计1套扩增效率好，扩增速度快的lamp引物，用于特异性的扩增靶基因。引物合成由北京擎科生物科技有限公司合成并纯化。其中，6条引物见表1所示。

表1基于its基因的线虫o.sinensislamp反应引物

(3)lamp反应体系的初步建立

根据lamp引物，以线虫o.sinensis基因组dna质粒为模板，进行lamp反应。反应体系25μl：20mmtris-hcl(ph8.8)、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、0.8mbetaine、8mmmgso4、1.4mmeachdntp、8ubstdnapolymerase、40pmolfip和bip，5pmolf3和b3，20pmollb和lf。将混合物置于60～67℃恒温反应60min。以双蒸水为阴性对照。80℃灭活10min，lamp反应结束。

(4)lamp反应结果检测

实时浊度仪检测：lamp在反应过程中发生以下反应式：

(dna)n-1+dntp→(dna)n+p2o7^4-

p2o7^4-+2mg²⁺→mg2p2o7↓

其中mg2p2o7即焦磷酸镁，为白色沉淀。依据这个原理，日本荣研化学株式会社开发出实时浊度仪la-320c，每隔6s测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性。

基于tvr颜色改变检测：lamp反应结束后，每25μl反应体系加1μltvr染液，混匀后肉眼直接观察结果，反应液变为亮绿色为阳性(图中颜色深的)，无色为阴性。

在设计的8对引物中，在同样的反应条件下，在27min内出现4个曲线，表明这4对引物能够成功的扩增靶序列。但os6能够最先扩增出靶序列，本研究将os6引物作为lamp反应的引物来检测线虫o.sinensis(图1、表1)。

对引物进行最佳温度筛选，温度从60～67℃，梯度为1℃，从图2可以看出64℃、65℃、66℃时先发生了lamp反应，并且从65℃到67℃表现出强烈的扩增，由于65℃最先发生了lamp反应，所以将最佳温度选为65℃。每个温度反应的靶序列dna浓度为0.346ng。

(5)lamp检测感染线虫o.sinensis扬子鳄粪样

将收集的阳性粪样在-80℃冻存1周灭活虫卵。粪便dna的提取按照粪便dna提取试剂盒操作进行。每次称取0.1g粪样，同一标本不同部位取样2份同时提取dna。提取的dna-20℃备用。共收集阳性粪样6份(f1～f6)，阴性粪样3份(f7～f10)。

以6个感染线虫o.sinensis的扬子鳄粪样dna为模板，经lamp法扩增，结果显示f1～f66个感染线虫o.sinensis的扬子鳄粪样lamp后均为阳性，f7～f104个未感染该线虫的扬子鳄粪样dna经lamp反应，结果为阴性，pcr检测结果相同(图9～11)。

(6)lamp特异性检测

以线虫o.sinensis质粒dna为阳性样本，对照样本人蛔虫、裂头绦虫、大片吸虫、日本血吸虫、旋毛虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫、异尖线虫、cucullanuselongatus及双蒸水作为对照，然后进行lamp反应，分别采用tvr显色法和浊度法来检测结果。

分别以线虫o.sinensis、人蛔虫、裂头绦虫、大片吸虫、日本血吸虫、旋毛虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫、异尖线虫、cucullanuselongatus的dna为模板，评价lamp法检测线虫o.sinensis的特异性。度仪检测结果显示，线虫o.sinensislamp反应管出现阳性扩增曲线，而其他对照组寄生虫未见扩增曲线(图6)。进一步在线虫o.sinensislamp反应管加入tvr染料后呈现亮绿色(图中颜色较深的)，而人蛔虫、裂头绦虫、大片吸虫、日本血吸虫、旋毛虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫、异尖线虫、cucullanuselongatus反应管均呈无色(图中颜色浅的)(图7)。

(7)lamp敏感性检测

为了验证its-lamp方法的检测灵敏度，测定o.sinensis质粒dna的浓度，然后做10倍比梯度稀释，并以双蒸水作为阴性对照。然后进行lamp反应，分别采用tvr显色法和浊度法来检测结果。同时用pcr方法检测线虫o.sinensis的灵敏度。

以10倍梯度稀释(共6个稀释度)的核酸为模板(34.60ng/μl、3.46ng/μl、0.346ng/μl、34.6pg/μl、3.46pg/μl、0.346pg/μl)用于lamp反应。实时浊度仪检测结果发现，lamp能检测到第5个稀释度，即34.60ng/μl～3.46pg/μl每个反应(图3)。经dna浓度测定，lamp法最低可检测模板浓度为3.46pg/μl。可见在lamp反应结束加入tvr荧光染料后，阳性管反应液为亮绿色(图中颜色深的)，而0.346pg/μl和双蒸水对照管反应液为无色(图4)，而pcr最低可检测到的浓度为34.6pg/μl(图5)。

(8)pcr检测线虫o.sinensis

利用its-f3和its-b3作为pcr扩增的上、下游引物，pcr反应总体积为25μl，含2.5μl10×buffer、2.0μllmgcl2(2.5mol/l)、4.0μldntps(2.5mm/leach)、上下游引物(10μmol/l)各0.5μl、100ng模板基因组dna和0.25μltaqdna聚合酶(5u/μl)，加h2o补足。pcr反应条件是：94℃预变性1min；94℃变性25s，56℃退火及延伸5min，35个循环；72℃终延伸10min。pcr扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，观察pcr扩增产物有无预期大小的目的dna片段。

lamp方法需要根据靶基因设计4条或6条特异引物，在链置换dna聚合酶(bstdnapoymerase)的作用下，不需要模板的热变性，恒温水浴下，30～60min内即可将靶核酸进行扩增(notomietal.,2015)。这种核酸扩增方法具有许多优势：①扩增效率极高：60min内扩增产物可达到靶基因的10⁹～10¹⁰倍；②操作简单，耗时短，无需昂贵仪器，成本低，整个扩增反应只需在60℃～65℃恒温条件下孵育几十分钟即可，不需要复杂的温度变化过程；③灵敏性高：扩增模板只需10个拷贝或更少；④特异性高：设计4条或6条引物可识别靶基因上6个不同区域；⑤结果判定简单：既可以通过反应副产物直接肉眼观察，也可以通过浊度仪实时监控，无需电泳。该方法特别适用于基层和现场的快速检测，对临床检测具有一定意义，可开发成lamp检测试剂盒，便于广大基层医疗卫生单位检验人员使用，发展前景非常广阔。

lamp已经广泛应用于医疗卫生、食品安全、胚胎鉴定、动植物检验检疫、转基因产品等多个领域的病毒、微生物、寄生虫等病原体的分子检测。目前在寄生虫分子诊断方面，lamp方法已用于原虫、吸虫、绦虫和线虫方面的快速诊断。如han等(hanet,watanaber,sattabongkotj,etal.detectionoffourplasmodiumspeciesbygenus-andspecies-specificloop-mediatedisothermalamplificationforclinicaldiagnosis.journalofclinicalmicrobiology,2007,45(8):2521-2528.)根据18srrna建立的lamp方法对4种疟原虫进行了临床诊断，并与显微镜检和巢式pcr进行对比。结果发现，lamp的检测准确性与巢式pcr完全相符，但耗时更短，不需要复杂的过程，只需热处理过血样即可作为模板。nkouawa等(nkouawaa,sakoy,nakaom,etal.loop-mediatedisothermalamplificationmethodfordifferentiationandrapiddetectionoftaeniaspecies.journalofclinicalmicrobiology,2009,47(1):168-174.)根据绦虫组织蛋白酶样半胱氨酸肽酶(clp)和细胞色素c氧化酶亚基1(cox1)基因设计了lamp引物，建立了检测绦虫的lamp方法。郑洋妹等(郑洋妹,陈信忠,龚艳清,等.简单异尖线虫环介导等温扩增(lamp)鉴定方法的建立和应用.国际医学寄生虫病杂志,2010,37(3):141-144.)根据简单异尖线虫its保守区域序列设计引物建立了快速鉴定该虫的lamp方法，灵敏度可达到10拷贝/μl，且对照均无交叉反应。总体上来说，目前在原虫检测上应用lamp方法较多，而在线虫的检测上应用相对较少。

本发明实施例提供的一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法，根据线虫o.sinensis的靶序列its建立了lamp反应体系，在线虫o.sinensis成虫和感染该线虫的扬子鳄粪样中扩增到了特异性产物，检测到成虫基因组dna的敏感性为3.46pg/μl，是pcr法检测敏感性的10倍，并且与人蛔虫、裂头绦虫、大片吸虫、日本血吸虫、旋毛虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫、异尖线虫、cucullanuselongatus均未出现交叉反应，在敏感性上，可从感染线虫o.sinensis的扬子鳄粪样中扩增出特异性dna，本方法无需昂贵仪器，仅需一个水浴锅，利用具有链置换活性的bstdna聚合酶，在64℃条件下，保温1h，即可完成核酸扩增反应，反应后加入核酸染料即可观察结果，且与其它寄生虫未出现交叉反应，缩短了现场检测时间，有利于在基层卫生机构、床边检测和流行病学调查等领域推广使用。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>皖南医学院

<120>一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法

<130>2019-2-12

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>nc5(上游引物)

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<210>2

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<212>dna

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<210>4

<211>19

<212>dna

<213>b3(外引物)

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<212>dna

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acgaccctcagccagacgtgaagactttgaacgcgcattg40

<210>6

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<212>dna

<213>bip(内引物)

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<210>7

<211>18

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<213>lf(环引物)

<400>8

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