一种对胚胎培养液进行DedscRRBS-PGS分析的方法与流程

本发明涉及生物医学和分子细胞生物学领域，具体涉及一种对胚胎培养液进行dedscrrbs-pgs分析的方法。

背景技术：

试管婴儿技术诞生于1978年，是一项对人类生育史具有跨时代意义的医疗发明，被认为是“现代医学发展的里程碑”，2010年其开创者robertg.edwards获得诺贝尔医学与生理学奖。四十年来，全球已有数百万试管婴儿诞生，为无数生育困难的家庭带来了福音。

试管婴儿技术涉及到妇产科学、男科学、生殖生理学、遗传学、胚胎学及发育生物学等多个学科，同时也必须依赖实验室技术与临床学科。目前筛选胚胎的主要依据是形态学标准，但是临床结果表明，尽管进行了形态学筛选，胚胎移植成功率也只有40％左右。因此，第三代试管婴儿应运而生，该技术可全面筛查胚胎中可能异常的染色体，挑选优质的胚胎进行宫腔内移植，减少胚胎停育、流产风险，大大提高了试管婴儿的成功率，但总体依然达不到人们的期望，目前第三代试管婴儿成功率一般只有60％左右。

目前第三代试管婴儿采用的胚胎植入前染色体筛查(pgs)分析技术，是从囊胚滋养层切取3-5个细胞作为活检的起始材料。尽管该方法能够有效提供胚胎染色体变异情况，但是在活检取材过程中，会对胚胎造成一定的伤害，属于有创检测。虽然目前尚未发现该检测对人类胚胎造成不利影响，毕竟该技术使用时间尚短，但在动物模型如小鼠的研究中发现，这种取滋养层细胞活检的操作，会对后代的神经系统发育等造成不良影响。因此，人们一直都在试图寻找一种无创的pgs分析方法。2016年，shamonki等(shamonki,etal.,http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2016.07.1112)报道了采用培养5天的囊胚培养液，进行胚胎染色体异常的检测，在52个胚胎培养液中，检测到2个与胚胎活检相同的样本，直接提供了通过囊胚培养液检测胚胎染色体异常的案例。国内也有人做相关的研究，上海亿康医疗科技有限公司的陆思嘉等对此已提出了发明专利申请(申请公布号cn1053368936a)，并于2016年3月2日公布。同时，相关的文章也已经发表在pnas上(xuetal.,www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1613294113)，采用d5囊胚培养液做pgs分析的准确性已可以达到80％以上，并有经该检测的健康婴儿出生。

另一方面，采用第三代试管婴儿技术，仍然有染色体正常、形态学优质的胚胎移植失败。其主要原因可能是辅助生殖体外受精后，胚胎要在体外经历3-6天非母体环境培养，其表观遗传状况受到干扰，从而影响胚胎的发育潜能。其中，dna甲基化作为重要的“表观遗传学标记”，在人早期胚胎发育过程中恰恰经历着过山车似的动态变化(guoetal.nature.2014jul31；511(7511):606-610)，极有可能受到外界环境的影响而发生异变，进而导致一些形态学优质、染色体状态正常的胚胎移植失败。而目前的植入前筛查中，都没有对胚胎的表观遗传状况进行分析。

目前，单细胞水平上的dna甲基化高通量测序技术主要包括:单细胞全基因组重亚硫酸盐测序(single-cellwholegenomebisulfitesequencing，scwgbs)和单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序(single-cellreduced-representationbisulfitesequencing，scrrbs)。以新一代高通量测序平台为基础，结合基因组重亚硫酸盐处理和生物信息数据分析绘制基因组dna甲基化图谱；同时，dna甲基化测序数据可以用来评估大范围的染色体拷贝数变异(cnv)，甚至是单碱基分辨率的单核苷酸突变(snv)。关于dna甲基化测序在辅助生殖领域中的研究已有报道。北医三院乔杰研究组与基因组研究所刘江研究组合作发现，囊胚滋养层细胞的甲基化状态可以反应整个胚胎的甲基化状态，同时和囊胚质量相关，dna异常甲基化可能是导致胚胎发育失败的一个重要因素(lietal.,journalofgeneticsandgenomics,2017oct20；44(10):475-481.)，该项研究指出优质胚胎总体dna甲基化水平集中在特定范围之内，而绝大多数低质量胚胎总体dna甲基化水平表现为过高或者过低；同时，dna异常甲基化区域与胚胎发育途径相关。北大汤富酬课题组发表了人早期胚胎单细胞dna甲基化研究(zhupetal.naturegenetics.2018jan；50(1):12-19.)，研究结果显示，早期胚胎中染色体拷贝数一旦增加，全基因组整体的dna甲基化水平会降低，相反，染色体拷贝数减少则整体dna甲基化水平上升。因此，在传统的pgs的基础上，加上甲基化检测不仅能提高染色体非整倍性筛查的准确性，同时能获得表观遗传学信息，进一步提高胚胎移植成功率。

综上所述，目前评价技术仍有不足之处：

(1)活检取样对胚胎对操作技术要求较高，即便操作良好，也会对胚胎造成一定的损伤，若是操作失误，很可能会伤及胚胎，导致严重后果；同时，滋养层细胞可能存在嵌合的情况，所取少数3-5个细胞可能不能完全代表胚胎，进而造成误判；

(2)传统pgs仅仅从染色体状态进行评估，忽略了在胚胎早期十分重要的表观遗传变化，不能为更全面评估胚胎发育潜能提供更多的参考；cn105368936a采用胚胎培养后的废液为材料，试图做到无创检测，但仍然只是对染色体状态进行分析；

(3)无论是单细胞全基因组重亚硫酸盐测序(scwgbs)还是单酶切(mspi)处理为基础的简化表达亚硫酸盐测序(scrrbs)所得基因组覆盖率都比较低，获得的有效数据量相对较少；而且进行pgs分析时，sd值较大，不能获得较为明确的染色体非整倍性结果；

(4)在胚胎及te细胞等方面甲基化研究颇多，但在培养液中来自胚胎的dna的甲基化研究尚未有正式的报道。

因此，急需一种无创且简便、高效、经济的培养液dna甲基化高通量测序方法，以获得更高的基因组匹配率，更广的基因组覆盖率，更加全面的cpg位点信息；同时对培养液染色体非整倍性状况及dna甲基化状况进行双重分析，提供多角度参考检测胚胎发育潜能。

技术实现要素：

为了实现对胚胎培养液进行简化代表性重亚硫酸盐测序和染色体非整倍性状况分析，使分析时胚胎无创伤，且多角度评估胚胎发育潜能。

本发明的一个目的是提供一种构建用于胚胎植入前染色体筛查的测序文库的方法。

本发明提供的方法，包括以下步骤：

1)将囊胚培养液作为样本构建dna文库；

所述构建dna文库的过程中采用两种限制性内切酶对所述囊胚培养液的基因组dna酶切以富集cpg位点；

2)将所述dna文库利用重亚硫酸盐进行ct转化，得到转化产物；

3)将转化产物用于制备甲基化测序文库，得到测序文库。

上述方法中，所述胚胎植入前染色体筛查为检测dna甲基化和染色体非整倍性状况。

上述方法中，所述囊胚培养液按照如下方法制备：将离体受精卵在卵裂球培养基中培养到卵裂球期(培养3天)，然后转移至囊胚培养基中培养至囊胚成熟阶段(培养到第5天或第6天)，收集囊胚培养液。

上述收集囊胚培养液为在显微镜下刺激囊胚使囊胚皱缩5-15min，使囊胚腔内液排出到培养液，得到囊胚培养液作为样本。囊胚培养液也可以是“试管婴儿”操作中的医疗废弃物。

上述方法中，所述两种限制性内切酶为mspi/apeki、mspi/taqαi、mspi/xmai、xmai/taqαi、xmai/apeki、apeki/taqαi中的任意一种组合。

上述方法中，两种限制性内切酶为mspi/apeki。

上述方法中，步骤1)中，所述将囊胚培养液作为样本构建dna文库包括如下步骤：

a)裂解所述囊胚培养液获得基因组dna；

上述裂解采用的裂解酶选自蛋白酶k、qiagenprotease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶及溶菌酶中的一种或多种，所用酶浓度为1-30mg/ml；裂解缓冲液buffera包括2-200mmtris-edta、1-50mmkcl、0.1wt％-5wt％的表面活性剂(优选tritonx-100、sds、tween-20、np40中的一种或多种)。

上述裂解酶孵育温度为37-65℃，时间为30min到12h，失活温度为不超过80℃，时间为10-45min。

b)用mspⅰ和apeki酶切所述基因组dna，得到酶切产物；

上述2种限制酶酶切体系中缓冲液为bufferb，主要成分包括：10-40mmtris-acetate，1-10mmmagnesiumacetate,1-100mmpotassiumacetate，0.1-1mg/mlbsa(以下步骤所用bufferb均为此成分)，作为参照dna的非甲基化λdna加入量为样本中dna质量的大约1％；

上述酶切的温度37-75℃，时间1-6小时，失活温度60-80℃，时间10-30min。

c)对所述酶切产物依次进行末端修复和接甲基化接头，得到dna文库。

上述末端修复使用的dna聚合酶为klenowfragmentexo-，缓冲液为bufferb；

上述末端修复体系包括dna聚合酶klenowexo-、bufferb、末端修复dntp(datp、dgtp、dctp)；

上述末端修复的反应温度为37℃，修复时间为20-60min，60-80℃失活5-30min。

上述接头连接使用甲基化接头，用t4dna连接酶连接；

上述连接体系包括：t4dnaligase、bufferb、atp、甲基化接头；

上述连接条件如下：16℃预连接30min，然后4℃连接过夜或不低于8小时，连接完成后50-75℃处理20min使酶失活。

上述方法中，所述将所述dna文库利用重亚硫酸盐进行ct转化包括如下步骤：为将dna文库在重亚硫酸盐转化试剂中进行ct转化。

上述重亚硫酸盐转化试剂优选使用invitrogenmethylcodekit或ezdnamethlyation-directkit。

上述方法中，所述将转化产物用于制备甲基化测序文库为将所述转化产物扩增，得到扩增产物即为甲基化测序文库；

和/或，所述扩增具体包括如下步骤：

1)用universalprimer和indexprimer对所述转化产物进行第一次扩增，得到第一次扩增产物；

2)以所述第一次扩增产物为模板，用universalprimer和indexprimer进行第二次扩增。

上述第一次扩增体系包括：2×kapahifiu+mastermix(kapabiosystems，kk2802)、universalprimer、indexprimer和转化产物；

上述第一次扩增反应：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，6个循环；72℃，5min；4℃保存。

上述第二次扩增体系包括：5xkapahififidelitybuffer、dntpmix、kapahifihotstartdnapolymerase、universalprimer、indexprimer和第一次扩增产物；

上述第二次扩增反应：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，18个循环；72℃，5min；4℃保存。

上述universalprimer的核苷酸序列为5′-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatc-s-t-3′；

上述indexprimer的核苷酸序列为5′-caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-s-t-3′，xxxxxx代表不同的碱基。

上述扩增使用kapahifiu+mastermix、phusionhigh-fidelity(hf)pcrmastermixwithhfbuffer、kapahififridelitybuffermsuppliedwithpolymerase的一种或两种。

本发明的另一个目的是提供一种对胚胎培养液进行简化代表性重亚硫酸盐测序和染色体非整倍性状况分析的方法。

本发明提供的方法，包括以下步骤：a)按照权利要求1-6任一所述方法制备甲基化测序文库；b)将所述甲基化测序文库进行高通量测序，根据测序结果分析dna甲基化和染色体非整倍性状况。

上述测序前，将所述扩增产物回收大小为200-450bp片段作为测序样本。

上述方法中，所述高通量测序为ngs测序。上述使用ngs测序，主要仪器为xten、next-seq、highseq-2500等illumina系列及相应的试剂耗材，参照仪器及试剂耗材sop进行操作。

本发明第3个目的是提供一种试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括限制性内切酶为mspⅰ和apeki、所述ct转化采用的重亚硫酸盐转化试剂、universalprimer和indexprimer；

所述试剂盒为具有如下1)和/或2)功能：

1)构建用于胚胎植入前染色体筛查的测序文库；

2)对胚胎培养液进行简化代表性重亚硫酸盐测序和染色体非整倍性状况分析。

上述试剂盒还包括记载上述方法的可读载体。

上述试剂盒在制备对胚胎或胚胎培养液进行dna甲基化和染色体非整倍性状况分析产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述试剂盒在制备胚胎植入前筛查产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述试剂盒在制备胚胎发育研究产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述试剂盒在制备评估胚胎的发育潜能中的应用也是本发明保护的范围。

或，上述方法在对胚胎或胚胎培养液进行dna甲基化和染色体非整倍性状况分析中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述方法在对胚胎植入前筛查中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述方法在评估胚胎的发育潜能中的应用也是本发明保护的范围。

上述培养至囊胚成熟阶段的时间为5-6天。

其中，第一次扩增程序如下：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，6-12个循环；72℃，5min；4℃保存；第二次扩增程序如下：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，15-21个循环；72℃，5min；4℃保存。

上述方法和应用均用于非诊断目的。

本发明是对现有技术进行的全新的改进，运用双酶切(可选用mspⅰ/apeki、mspⅰ/xmai、mspⅰ/taqαi、xmai/taqαi、xmai/apeki、taqαi/apeki等多种酶切组合)进行单细胞简化表达亚硫酸盐测序(dedscrrbs)，引进表观遗传学分析方法，利用囊胚培养液对胚胎的染色体状况及甲基化状况同时进行分析，不但对胚胎无创伤，样本获取简单，而且从多角度评估胚胎发育潜能，更加简便、高效、经济、安全可靠。

本发明采用“试管婴儿”操作中的医疗废弃物(囊胚培养液)为原料，可同时对胚胎的染色体非整倍性状况及dna甲基化状况进行双重分析，该分析结果可以用于多种目的，既可用于胚胎植入前筛查，也可用于实验室中对胚胎发育的相关研究等。与目前主流的滋养层细胞活检相比，具有对胚胎无创安全的优势；与正在研发中的利用培养液进行染色体状况(染色体非整倍性)的无创pgs分析相比，在提供同样的染色体非整倍性检测分析的同时还可以从dna甲基化的角度分析，从而从表观遗传及胚胎与培养环境的反应的全新角度评估胚胎的发育潜能，为在辅助生殖中选择“正确”的胚胎提供了新的参考，对提高“试管婴儿”周期的成功率提供了强力支持。

附图表说明

图1为培养液dedscrrbs-smpgs分析(上)获得与对应胚胎te细胞sureplex-veriseqpgs分析相同的阳性结果。

图2为培养液dedscrrbs-smpgs分析(上)获得与对应用胚胎te细胞sureplex-veriseqpgs分析相同的阴性结果。

图3为多种酶切建库测序结果进行统计分析,包括mxt:mspi/xmai/taqi、m/t:mspi/taqi、ma:mspi/apeki、m:mspi单酶切；t-test进行分析,*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中10×buffera的配方如下：500mmtris-edta、50mmkcl、5wt％tritonx-100；

下述实施例中10×bufferb的配方如下：40mmtris-acetate，10mmmagnesiumacetate,100mmpotassiumacetate，1mg/mlbsa。

实施例1、dedscrrbs-pgs测序分析染色体状态及dna甲基化状态

取单精子注射胚胎样本，分别对对应的囊胚滋养层活检细胞及囊胚培养液进行pgs和dedscrrbs-pgs测序分析染色体状态及dna甲基化状态，具体操作如下：

1、囊胚培养液的获得：

具体操作由医院辅助生殖中心胚胎实验室参照标准流程进行：

选取合格的mⅱ期人成熟卵细胞(提供者知情，由中信湘雅生殖与遗传专科医院获得)，尽可能将附着于卵细胞外的颗粒细胞彻底拆除，再选取人健康的精子(提供者知情，由中信湘雅生殖与遗传专科医院获得)，采用单精子注射获得受精卵，在g1培养基(卵裂球培养基，williamacookaustrialiaptyltd)中培养3天至卵裂球期，将卵裂球于新鲜g2培养基(囊胚培养基，williamacookaustrialiaptyltd)内洗涤数次以去除可能的残留颗粒细胞，然后转入10-25μl新鲜的g2培养基微滴中，每个微滴培养一个胚胎。

在g2培养基中培养到第5天或第6天直至囊胚成熟，在显微镜下刺激囊胚使囊胚皱缩5-15min，使囊胚腔内液排出到培养液中，得到囊胚培养液作为样本。

将上述囊胚转入新的g2培养基取滋养层细胞做对照活检。

2、dedscrrbs-pgs的dna文库构建

1)裂解细胞释放dna

根据上述囊胚培养液的体积(10ul)，加入10×buffera(终浓度为1×)，20mg/ml的裂解酶(qiagen，19155，终浓度1mg/ml)，用nf水补至总体积12.5ul，混匀后离心收集于管底；置于在pcr仪中，50℃1.5h裂解细胞释放dna，75℃30min使蛋白酶失活，得到裂解产物。

2)酶切富集cpg位点

向上述1)得到的裂解产物中加入0.9ulmspⅰ(fermentas，er0541，10u/ul)、1ulapeki(neb，r0643l，5u/ul)、10×bufferb(终浓度为1×)、样本dna，用nf水补至27ul。样本置于pcr仪中，37℃2h，75℃2h，得到酶切产物。

以加入样本中dna质量的1％左右非甲基化λdna(thermoscientific，sd0021)作为计算转化率的内参。

3)末端修复

向上述酶切产物中加入1.5uldna聚合酶klenowexo-(fermentas，p7010-lc-l，5u/ul)；10×bufferb(终浓度为1×)、末端修复dntp(终浓度40μmdatp；30μmdgtp；30μmdctp)；充分混匀，稍离心收集于管底，pcr仪上37℃40分钟，75℃15分钟，得到修复产物。

4)接甲基化接头

向上述修复产物中加入1.5ult4dnaligase(fermentas,el0013,30u/ul)、10×bufferb(终浓度为1×)、0.25ulatp(thermoscientific，r0441)、1ul甲基化接头(neb，e7535l)，混匀后，置于pcr仪上，16℃30分钟，4℃过夜或不低于8小时，完成后，65℃，20min使酶失活，得到连接产物。

甲基化接头为环状，故加入1μluser(neb，e7535l)到每个连接产物中，pcr仪上37℃，30min，酶切断开环状结构，形成双链dna，以便进行pcr反应。

3、dedscrrbs-pgs的甲基化测序文库的构建

1)重亚硫酸盐转化混合物(ct)转化

参照ezdnamethlyation-directkit(zymoresearch，d5021)说明书操作，进行ct转化：ct转化试剂(试剂盒中)在使用前，加入790μlm-solubilization,160μlm-reactionbuffer,300μldilutionbuffer到一个ct试剂管中，涡旋振荡10分钟充分溶解混匀，得到ct转化混合物。

向39ul上述2得到的连接产物中加入0.5μlcarrierrna(roche，10109517001，1μg/μl)和ct转化混合物至总体积150μl，混匀后稍离心收集于管底，pcr仪上98℃，变性10分钟，64℃，重亚硫酸盐转化2.5小时，4℃放置至20小时继续转化，得到转化产物。

参考ezdnamethlyation-directkit(zymoresearch，d5021)说明书操作，将上述转化产物经离心柱结合、洗涤、纯化洗脱回收，收集24μl洗脱液，得到纯化后转化产物。

2)扩增

(1)将上述纯化后转化产物用于第一次pcr扩增，采用50μl体系，加入2×kapahifiu+mastermix(kapabiosystems，kk2802)25μl，15μmuniversalprimer及indexprimer(neb，e7535l)各0.5μl，24μl纯化后转化产物。

参照如下反应扩增：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，6个循环；72℃，5min；4℃保存。

得到第一次扩增产物用0.8×xp磁珠纯化pcr产物，以33μl水洗涤。

(2)第二次pcr扩增

采用50μl体系，加入5xkapahififidelitybuffer(kapabiosystems，kk2502)至终浓度1×，10mmdntpmix(kapabiosystems，kk2502)1.5μl，1u/ulkapahifihotstartdnapolymerase(kapabiosystems，kk2502)1ul，每个文库中加入与第一次扩增相同的universalprimer及indexprimer各2.5μl，32.5μl第一次扩增产物。

参照如下反应扩增：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，18个循环；72℃，5min；4℃保存。

得到第二次扩增产物。

上述universalprimer的核苷酸序列为5′-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatc-s-t-3′；

上述indexprimer的核苷酸序列为5′-caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-s-t-3′，xxxxxx代表不同的碱基。

将上述第二次扩增产物对大小为200-700bp目标dna片段进行回收，优选采用磁珠分两步回收纯化：第一步用0.5xxpbeads，去除过大的dna；第二步在第一步的上清液中再加0.5xxpbeads，最后回收dna长度为200-450bp，得到dedscrrbs-pgs测序文库。

4、测序

将上述3得到的测序文库采用illumina550sequencingsystem高通量测序系统进行测序，有效数据3m左右，测序长度75bpreads。

获得的数据采用甲基化分析流程解析数据，获得样本的dna甲基化状态；同时数据采用通用pgs分析流程，分析样本的染色体非整倍性状态。

对照组：对照活检采用主流pgs分析体系sureplex-veriseq进行检测测序。

结果如图1、图2、表1和表2所示：

图1和图2展示了对囊胚培养液采用dedscrrbs测序进行pgs分析的散点图，可以清楚的发现，囊胚培养液dedscrrbs数据可以进行pgs分析，而且与对照活检采用主流pgs分析体系sureplex-veriseq获得结果完全一致，散点图比sureplex-veriseq检测te细胞的结果还要集中，这表明该方法不仅仅可以达到主流产品的等效性能，还在检测精确度及准确性上更有优势。

实施例2、不同酶切选择的摸索

方法与实施例1基本相同，不同的是建库时采用的酶切位点为将mspi、xmai(neb，r0180l)、taqi(thermoscientific^tm，er0671)进行多种组合：

酶切组合包括mspi/xmai/taqi、mspi/taqi以及mspi单酶切。

多种酶切组合测序数据结果如表1所示。图3为将表1的多种酶切建库测序结果进行统计分析，其中基因组比对率、冗余度比例、每m(million)数据量覆盖基因组比例均反映了在相同测序通量下，获得有效数据的能力；sd值代表以正常细胞为标准建立基线所得标准差，sd值越小，表明与标准基线越为接近，所得结果越准确。采用t-test进行分析,*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

从上述结果可以看出，与其他酶切方式相比，采用mspi/apeki酶切进行pgs分析的优势在于:基因组比对率高，冗余序列比例低，在相同测序通量下覆盖的基因组比例高，因此获得的有效数据量大；同时sd值小，检测精度高。

本发明对囊胚培养液样本进行有效数据3m左右75bpreads测序，可获得大于1-3m的cpg位点(表2)，这与文献报道的数据相比，具有更高的效率，同时可以对全基因组甲基化水平进行评估(表2)。图3对比统计了每个reads上覆盖的cpg位点以及每个有效reads上覆盖的cpg位点:从平均值来看，获得的cpg位点m>ma>mxt>mt；但用t-text检验分析，pvalue均大于0.05，差异不显著，说明ma获取cpg位点的能力不比其他酶切方法差，与单酶切更为接近。

表1icsi胚胎d5/6培养液样本dedscrrbs-smpgs分析

表2icsi胚胎d5/6培养液样本dedscrrbs甲基化信息分析

综上所述，本发明提出的以mspi/apeki酶切为基础的dedscrrbs在染色体拷贝数分析(pgs)方面具有显著优势，而在甲基化数据分析方面基本接近于以mspi单酶切为基础的dedscrrbs。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其它各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

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<110>北京中科遗传与生殖医学研究院有限责任公司

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