一种天然抗菌肽Alligatorin4及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种天然抗菌肽Alligatorin4及其在抗菌方面的应用。本发明的抗菌肽Alligatorin4来源于扬子鳄。通过检索扬子鳄基因数据库，筛选分析获得抗菌肽成熟肽序列，其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所示。通过对比分析，该天然抗菌肽Alligatorin4与目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明显差异，属于一种新型抗菌肽。抗菌实验结果表明，本发明的抗菌肽Alligatorin4对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌具有极强的抗菌活性，抗菌作用广谱高效，此外具有溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好等特点，可应用于制备抗菌、抑制细菌生长的药物、防腐剂、兽药、动物饲料以及化妆品中。
【专利说明】-种天然抗菌肽Al I igator in4及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种天然抗菌肽及其应用，更具体的说，涉及一种来源于扬子鳄的天 然抗菌肽Alligatorin4及其应用，属于生物医学【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 传统抗生素在治疗细菌性感染疾病方面取得了显著效果，但是近年来，随着传统 抗生素在医学和养殖业等领域的滥用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，同 时也出现了一些耐药性极强的超级细菌，微生物耐药问题已成为严重威胁人类健康的难 题。一直以来微生物耐药性的应对手段是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性 的抗微生物制剂，而这种新的抗生素使用一段时间后，微生物会进一步对这种新的抗生素 产生耐药性，因此这就需要持续开发新的抗微生物制剂。开发出一种新型抗菌机制药物是 解决微生物耐受性问题的一个新方向。
[0003] 抗菌肽是一种小分子多肽，对细菌、真菌、病毒和原虫等均具有杀灭作用。抗菌肽 具有分子量小、结构简单、杀菌活性强等特点。大多数抗菌肽的杀菌机制是通过作用于细菌 细胞膜上的磷脂双分子层，破坏细胞膜完整性并在细胞膜上形成跨膜通道，造成细胞内容 物溶出而导致细胞死亡。这种独特的杀菌机制一般不易引起微生物耐药性。而且抗菌肽对 哺乳动物正常细胞和组织一般没有毒害性，不存在残留问题，因此抗菌肽有望成为一种新 型的高效的抗菌药物，具有广阔的开发应用前景。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是为解决传统抗生素的不足之处，提供了一种来源于扬子鳄的天然抗 菌肽Alligatorin4,另外提供了该抗菌肽的氨基酸序列以及其在抗菌方面的应用。扬子鳄 抗菌肽Alligatorin4具有广谱高效的抗菌作用，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真 菌具有极强的抗菌活性，且具有分子量小、合成简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热 稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
[0006] 本发明中天然抗菌肽Alligatorin4来自于爬行动物扬子鳄体内的一种抗菌肽， 抗菌肽Alligatorin4由38个氨基酸组成，分子量为4402. 5Da，等电点为12. 78。氨基酸序 列如序列表 SEQ ID N0:1 所不 Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Leu Arg Arg Lys lie Lys Lys Gly Phe Lys Lys lie Phe Lys Arg Leu Pro Pro Val Gly Val Gly Val Ser lie Pro Leu Ala Gly Arg Arg，所有氨基酸均为L-型。
[0007] 本发明也提供了抗菌肽Alligatorin4的化学制备方法：
[0008] 根据获得天然抗菌肽Alligatorin4成熟肽的氨基酸序列，用自动多肽合成 仪（433A, Applied Biosystems)合其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；用高效 液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-T0F)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
[0009] 另外，本发明提供了抗菌肽Alligatorin4的应用，在制备抗菌药物或组合物、抑 制细菌生长药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中的应用。
[0010] 本发明的优点是提供了一种来源于扬子鳄的天然抗菌肽Alligatorin4以及其在 抗菌方面的应用。抗菌肽Alligatorin4具有广谱高效的抗菌作用，且具有分子量小、合成 简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品 保鲜和养殖业领域。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1 :
[0012] 天然抗菌肽Alligatorin4的发现
[0013] 通过检索，从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)网站的扬子鳄基因组数据中发现一条基因 序列（XP_006037273. 1)，长度为519bp，编码的多肽前体由172个氨基酸残基组成。该基因 及其编码的多肽前体分别如SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示：
[0014] atgcagacctgctgggtcatcctgctcctgcccctgctcggggcagccagcaccgagctg
[0015] MQTCWVILLLPLLGAASTEL
[0016] cccacccctggcaccgacccaccacagctcacgccgacctacgcccaggccctggccacg
[0017] PTPGTDPPQLTPTYAQALAT
[0018] gccgtcgacgtctacaaccaagggcccggcgtggacttcgccttccggctcctggaggca
[0019] AVDVYNQGPGVDFAFRLLEA
[0020] gagtcccgggacgactgggacgcgagcacggatcccctgcggcagctggagttcaccctg
[0021] ESRDDWDASTDPLRQLEFTL
[0022] aaggagaccgagtgccccgtgggcgaggaccagcccctggaccagtgcgacttcaaggat
[0023] KETECPVGEDQPLDQCDFKD
[0024] ggcggggcggtgctggactgcacagggaccttctcctgctccgaggcctcgctcatggtg
[0025] GGAVLDCTGTFSCSEASLMV
[0026] ctggtcacctgccaacccgccgagcccctgcctgaccgcgtccgcaggggtctattcaag
[0027] LVTCQPAEPLPDRVRRGLFK
[0028] aagctgaggaggaaaatcaagaagggctttaagaaaatcttcaagcgcctgcctcccgtc
[0029] KLRRKIKKGFKKIFKRLPPV
[0030] ggtgtcggtgtctccatcccactcgcaggaaggcggtga
[0031] GVGVSIPLAGRR-
[0032] 将该基因序列用 NCBI 网站的 blastX 软件（http://blast. st_va. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.cgi ? PROGRAM = blastx&PAGE-TYPE = BlastSearch&LINK-L0C = blasthome)进行序列比对分析结果表明，该基因的编码产物可能为扬子鳄cathelicidins 家族抗菌肽前体。进一步将该基因编码的多肽前体序列用NCBI网站的protein blast 软件（http://blast.st_va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ? PROGRAM = blastp&PAGE- TYPE = BlastSearch&LINK_L0C = blasthome)进行序列比对，并与之前发现的其它动物 来源cathelicidins家族抗菌肽序列进行比较分析，确定该抗菌肽成熟过程中酶切位点 为-R133-v134-，从而获得该抗菌肽成熟肽序列 RRGLFKKLRRKIKKGFKKIFKRLPPVGVGVSIPLAGRR( 氨基酸单字母简写序列），命名为Alligatorin4。Alligatorin4与目前已知所有抗菌肽的 氨基酸序列存在明显差异。
[0033] 实施例2
[0034] 抗菌肽Alligatorin4的化学合成方法
[0035] (1)用自动多肽合成仪（433A, Applied Biosystems)合成 Alligatorin4 的全序 列，通过HPLC (：18反相柱层析脱盐纯化。（2)分子量测定采用常规基质辅助激光解析电离飞 行时间质谱（MALDI-T0F)法。（3)纯化的Alligatorin4用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯 度>95%，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-T0F，4402. ?a)， 等电聚焦电泳测定等电点为12. 78,用自动氨基酸测序仪确定其氨基酸序列结构与天然 Alligatorin4 一致。
[0036] 实施例3 :
[0037] 抗菌肽Alligatorin4抗菌活性检测
[0038] (1)分别挑取保存于斜面上的试验菌株（大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌 ATCC27853购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其它菌株从当地医院收集）均匀涂布 于MH固体培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）平板上，将经过灭菌的0. 5cm直径 的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的Alligatorin4样品溶液 10 μ 1，于37°C倒置培养18-20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在 滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。结果表明，抗菌肽 Alligatorin4对表2中列出的菌株种类均具有抗菌活性。
[0039] (2)采用 2 倍稀释法测定最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration): 选择上述实验步骤（1)中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。将试验菌株接种到ΜΗ液 体培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）中，然后在培养箱中37°C振荡培养到对数生 长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的菌株培养液稀释到2X 105cfu/ml 待用。
[0040] 在无菌96孔板各孔中预先加入100 μ 1 MH液体培养基，然后在第一孔中加入 100 μ 1用ΜΗ液体培养基稀释到一定浓度的经0. 22 μ m孔滤膜过滤的的Alligatorin4样 品溶液，混匀后取100 μ 1加入第2孔，依次倍比稀释（参见表1)，自第9孔吸出100 μ 1弃 去，第10孔为对照管。
[0041] 表1稀释方法
[0042]
【权利要求】
1. 一种天然抗菌肽Alligatorin4,其特征在于，所述抗菌肽来源于扬子鳄，由38个氨 基酸组成，分子量为4402. ?a，等电点为12. 78,其氨基酸序列表如SEQ ID NO: 1所示：Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Leu Arg Arg Lys lie Lys Lys Gly Phe Lys Lys lie Phe Lys Arg Leu Pro Pro Val Gly Val Gly Val Ser lie Pro Leu Ala Gly Arg Arg，所有氨基酸 均为L-型。
2. -种如权利要求1所述的天然抗菌肽Alligatorin4在制备抗菌药物或组合物、抑制 细菌生长药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中的应用。
【文档编号】A61K8/64GK104151415SQ201410315332
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】王义鹏, 于海宁, 高久香, 蔡莎莎 申请人:苏州大学