一种超灵敏高选择性实时分析次氯酸的荧光探针的制作方法

本发明涉及茚酮类化合物作为次氯酸荧光探针，能够迅速对次氯酸高选择性超灵敏识别，或者其可即时测定实际水样中次氯酸的浓度。

背景技术：

活性氧作为生命系统的信号分子，与生理和病理过程密切相关。在高反应性活性氧中，次氯酸是在过氧化物酶作用下由过氧化氢和氯离子产生的，它在生物系统的信号传导和先天免疫反应中起着关键的作用，在生物和医学领域受到了广泛的关注。虽然次氯酸对人体健康有一定的保护作用，但是，由于次氯酸对各种生物分子具有很强的氧化能力，过量的次氯酸会导致细胞和组织损伤。越来越多的证据也表明，次氯酸调控不当是诱发各种疾病的关键因素，如癌症、神经退行性疾病和炎症性疾病等。因此，在生物系统中寻找合适的化学工具来追踪次氯酸浓度的变化具有重要意义。

由于其高灵敏度和显著的时空分辨率，荧光探针作为一种非侵入性工具应用于生物成像中分析物测定。到目前为止，已经设计了大量用于生物系统中检测次氯酸的荧光探针。但是目前报道的次氯酸荧光探针仍存在一些缺陷，包括选择性不够好、灵敏度不够高、水溶性差、合成复杂。另外，由于次氯酸在生理条件下氧化反应时间短、浓度低，探索一种高效荧光探针实时检测活体和活细胞中的次氯酸仍然是一个热点问题。此外，用于检测次氯酸的水溶性好、量子效率高的荧光探针还相对较少。因此，在生物系统中寻找一种高量子产率、高选择性、超灵敏、实时检测次氯酸的工具仍是至关重要的。

技术实现要素：

本领域急需制备一种高量子产率的快速高选择性次氯酸荧光探针，从而能够有效检测次氯酸。为此，本发明合成了一类新颖的次氯酸荧光探针，其量子产率高、选择性好、灵敏度高、能够快速识别次氯酸。具体而言，本发明提供了一种次氯酸荧光探针，其为茚酮类化合物，其结构如下：

优选的，本发明的荧光探针是：

本发明还提供了次氯酸荧光探针的制备方法，其是通过将对应于本发明的探针的相应的茚酮类化合物与二甲氨基硫代甲酰氯在二氯甲烷溶液中回流48h而合成制得。

本发明还提供了用于检测样本(例如游泳池水)中次氯酸浓度的检测制剂，其包含本发明的探针。优选地，本发明的检测制剂或试剂盒还包含产品的使用说明书。优选地，本发明的检测制剂还包含用于测定样本中的次氯酸浓度的缓冲剂。

本发明还提供了检测样本(例如游泳池水)中次氯酸浓度的方法，其包括将本发明的探针与待测样本接触的步骤。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本(例如游泳池水)中次氯酸浓度的制剂中的用途。

本发明的荧光探针可与次氯酸进行作用，产生荧光光谱的变化，从而实现对次氯酸的定量检测。

具体而言，本发明的次氯酸荧光探针分别与钾离子、钙离子、锌离子、钠离子、铜离子、镁离子、二价铁、三价铁、氯离子、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根、过氧化氢、超氧化钾等其他物质进行作用均不能导致荧光光谱的明显改变，从而实现对次氯酸的选择性识别，进而可任选地用于排除这些钾离子、钙离子、锌离子、钠离子、铜离子、镁离子、二价铁、三价铁、氯离子、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根、过氧化氢、超氧化钾等物质以及人体内其他离子的存在对次氯酸的定量测定的干扰。

本发明的荧光探针与次氯酸反应非常灵敏，从而有利于对次氯酸的迅速检测。

可选择地，本发明的次氯酸荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。

进一步的，本发明的次氯酸荧光探针是快速高选择性次氯酸荧色探针，且合成简单，有利于商业化的推广应用。

附图说明

图1是探针(5μm)加入次氯酸(1μm)后的响应时间；

图2是探针(5μm)加入次氯酸(0-5μm)前后的荧光光谱；

图3是不同浓度次氯酸(0-1μm)对探针(5μm)满足良好的的线性关系。

图4是人体内常见的物质对探针(5μm)的荧光强度的影响。其中编号1-28分别为空白、钾离子、钙离子、锌离子、钠离子、铜离子、镁离子、二价铁、三价铁、氯离子、硝酸根、亚硝酸根、亚硫酸根、硫酸根、硫化钠、谷胱甘肽(5mm)、同型半胱氨酸(500μm)、半胱氨酸(500μm)、过氧化氢、羟基自由基、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧化钾、单线态氧、一氧化氮、过氧化亚硝酸盐、次氯酸钠(5μm)(除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μm)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在505nm处的荧光强度值。

具体实施方式：

本发明提供了上述快速高选择性超灵敏次氯酸荧光探针的合成路线、方法及其光谱性能。

本发明的次氯酸荧光探针是一类茚酮类化合物，其具有以下结构通式

上式中：r1，r2，r3，r4，r5，r6，r7，r8，r9和r10,为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；r1，r2，r3，r4，r5，r6，r7，r8和r9和r10,可以相同或不同。

该类次氯酸荧光针的合成路线和方法如下：

具体地，本发明的荧光探针可以通过如下方法制备，将一定摩尔比(例如1:2～1:6)的茚酮类化合物与二甲氨基硫代甲酰氯溶于二氯甲烷中，然后加入dipea(例如1:2～1:6)，加热回流一段时间(例如48h)，然后利用旋转蒸发仪进行旋蒸得到粗产品，如果要得到较纯的产品，可以将滤液用二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,2:1)进行柱色谱分离得到纯品。

因此，本发明还提供了二甲氨基硫代甲酰氯在制备用于检测次氯酸的荧光探针中的用途。

本发明还提供了对茚酮类化合物在制备用于检测次氯酸的荧光探针中的用途。

本发明的次氯酸荧光探针的显著特征是能够快速高选择性超灵敏识别次氯酸以及在人体内的其他离子的存在下能够准确对次氯酸进行定量分析。

下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。

实施例1

(方案1)472mg(2mmol)2-苯亚甲基-5-羟基-1-茚酮溶于10ml二氯甲烷中，再加入496mg(4mmol)二甲氨基硫代甲酰氯，然后加入dipea516mg(4mmol)回流10h，然后利用旋转蒸发仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以用二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,2:1)进行色谱柱分离得到纯品，得到纯净产品460mg，产率为71.2％。

(方案2)将472mg(2mmol)2-苯亚甲基-5-羟基-1-茚酮溶于10ml二氯甲烷中，再加入744mg(6mmol)二甲氨基硫代甲酰氯，然后加入dipea774mg(6mmol)回流16h，然后利用旋转蒸发仪进行旋蒸得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以用二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,2:1)进行色谱柱提纯得到纯品，得到纯净产品500mg，产率为77.4％。

(方案3)将472mg(2mmol)2-苯亚甲基-5-羟基-1-茚酮溶于10ml二氯甲烷中，再加入992mg(8mmol)二甲氨基硫代甲酰氯，然后加入dipea1032mg(8mmol)回流24h，然后利用旋转蒸发仪进行旋蒸得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以用二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,2:1)进行色谱柱分离得到纯品，得到纯净产品540mg，产率为83.6％。

(方案4)将472mg(2mmol)2-苯亚甲基-5-羟基-1-茚酮溶于10ml二氯甲烷中，再加入1488mg(12mmol)二甲氨基硫代甲酰氯，然后加入dipea1548mg(12mmol)回流48h，然后利用高压泵进行抽滤，得到滤液，滤液成为我们的粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将滤液用二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,2:1)进行色谱柱分离得到纯品。得到黄色纯净产品580mg，产率为89.8％。

(方案5)将472mg(2mmol)2-苯亚甲基-5-羟基-1-茚酮溶于10ml二氯甲烷中，再加入330mg(12mmol)二甲氨基硫代甲酰氯，然后加入dipea3096mg(12mmol)回流24h，然后利用高压泵进行抽滤，得到滤液，滤液成为我们的粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将滤液用二氯甲烷和甲醇的混合体系(例如v/v,2:1)进行色谱柱分离得到纯品。得到黄色纯净产品550mg，产率为85.1％。

实施例2

图1是探针(5μm)加入次氯酸(1μm)后的响应时间。从探针母液中取出50μl置于10ml的测试体系，然后将1μm的次氯酸加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在纯水(5mmpbs,ph7.4)中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。

由图可以清楚地看到，当次氯酸加入后，经检测3s内荧光强度达到最大值并保持不变，这说明该探针与次氯酸反应迅速，能够为次氯酸的测定提供快速的分析方法。

实施例3

图2是次氯酸荧光探针(5μm)加入次氯酸(0-5μm)的荧光光谱变化图。图3是不同浓度次氯酸(0-1μm)对探针(5μm)的线性关系图。

配置多个探针浓度为5μm的平行样品于10ml比色管中，然后将不同浓度的次氯酸加入到测试体系中，摇晃均匀后静置1分钟。上述测定是在纯水(5mmpbs,ph7.4)中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。

用荧光光谱仪测试其荧光强度变化，从图2可以清晰的看出，随着加入次氯酸浓度的增加，505nm处的荧光强度逐渐增强。并且，由图3可以看出，在505nm处，次氯酸荧光探针(5μm)加入次氯酸(0-1μm)之后荧光强度呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对次氯酸进行定量分析。

实施例4

图4是不同离子分析物对探针(5μm)的荧光强度。分析物分别为空白、钾离子、钙离子、锌离子、钠离子、铜离子、镁离子、二价铁、三价铁、氯离子、硝酸根、亚硝酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫酸根、硫化钠、谷胱甘肽(5mm)、同型半胱氨酸(500μm)、半胱氨酸(500μm)、过氧化氢、羟基自由基、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧阴离子自由基、单线态氧、一氧化氮、过氧化亚硝酸盐、次氯酸钠(5μm)(除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μm)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在505nm处的荧光强度值。上述测定是在纯水(5mmpbs,ph7.4)中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。具体地，配置多个探针浓度为5μm的平行样品于10ml比色管中，然后加入一定量的分析物，摇匀，待1分钟后测定。

从图4可以看出，生物体内存在的常见离子不会明显干扰探针对次氯酸的荧光强度，因此探针具有良好的选择性。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。