一种提高植物组织中铁含量的方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种与植物组织中铁含量相关的基因及其应用。

背景技术：

微量营养素在人体中起着极其重要的作用，它的缺乏和过剩与人的健康休戚相关。全世界预计有1.61亿5岁以下儿童发育不良，部分原因是由于摄入食品缺乏维生素和矿物质造成的隐藏的饥饿（brancaetal.,2016）。在尼日利亚，75%的学龄前儿童和67%的孕妇患有贫血症（genevaetal.,2008）。缺铁性贫血会影响人体免疫系统，阻碍儿童生长并损害认知发育（blacketal.,2008）。因此通过生物技术对主要粮食作物进行生物强化是改善必要微量营养素缺乏的策略之一（hefferonetal.,2015）。为了满足人体对铁元素的正常需要，通过食物来补充铁元素是安全而经济的方式。

大豆是世界重要的粮油兼用作物，也是人类优质蛋白的主要来源。提高大豆中铁元素含量铁生物强化的一个重要途径，尽管此前在大豆中克隆并证明了gmdmt1、gmzip1等基因参与调控大豆的铁转运（moreauetal.,2002;kaiseretal.,2003），但仍然需要大力挖掘与大豆铁转运有关的元件或功能基因，从而为在生产上更为充分地利用该“绿色”铁素营养供给方式提供理论支持。

目前尚未见到有关ysl7在大豆铁元素吸收和运输中是否具有调控作用的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种提高植物组织中铁含量的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种提高植物组织中铁含量的方法，在植物体内过表达序列表中的seqidno：1所示的基因，获得与正常植物相比铁含量增多的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述植物为蝶形花科植物，所述植物组织为植物的可食用部分。

作为本发明的一种优选技术方案，所述植物为大豆，所述植物组织为大豆的籽粒。

作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有seqidno：1所示基因片段的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比铁含量增多的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述重组过表达载体以ptf101载体为骨架载体，并连接有35s强启动子。

作为本发明的一种优选技术方案，利用所述重组表达载体转化农杆菌eha101制备转化体。

作为本发明的一种优选技术方案，利用农杆菌eha101介导的大豆稳定转化法转化受体植物。

本发明还包括上述基因的扩增引物对，其正向引物依次如序列表中seqidno：2所示；其反向引物依次如序列表中seqidno：3所示。

本发明还包括含有上述基因的重组表达载体和转化体。

本发明还包括上述方法所制备的转基因植物。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明首创提出了基于特定基因提高植物组织中微量元素（铁）含量的方法，在本技术领域取得了开拓性的突出技术进步。

基于上述科学发现，并经过植株基因工程试验的验证，利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆籽粒的铁含量，对于大豆的生物强化及提升大豆的营养品质等均具有重要的实际意义。

附图说明

图1为过表达gmysl7后对大豆籽粒铁含量分析，在完全相同的实验环境下，上调表达gmysl7的转基因籽粒铁含量同空载体转化的转基因（ev）相比，铁含量显著增加（图1a），图1b为对转基因叶片中gmysl7的表达水平分析，结果显示在稳定转基因叶片中gmysl7的表达是显著上调的。

图2为转基因植株与对照植株的照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、wilimas82大豆根组织中总dna的提取。

（1）取植物组织0.1-0.2g放到2mlep管中,加入钢珠,液氮速冻后用打样机研磨至粉状；

（2）加入650μlctab，65℃放置20min；

（3）加入0.5倍体积氯仿，猛烈混匀，12000rpm离心10min；

（4）取上清于新的1.5mlep管中，加入两倍体积无水乙醇，-20℃放半小时以上，12000rpm离心10min；

（5）去上清，离心，干燥，溶于40-100μl水中，4℃冰箱保存。反应合成的dna可用作pcr反应模板。

实施例2、构建重组表达载体。

（1）gmysl7基因片段的克隆。

根据gmysl7的编码序列（seqidno：1）设计引物对用于过表达载体构建，根据载体ptf101上的多克隆位点，引物末端分别引入smai和bamhi酶切识别位点；以大豆测序品种w82的dna为模板进行pcr，扩增gmysl7长为4886bp的基因片段（seqidno：1）；引物序列为：

正向引物：cccccgggatgggtacttcagaaaggatcgacttggagc（seqidno:2）；

反向引物：cgggatcctcaagattctaagaatccatccacctttgtatttaccc（seqidno:3）；

扩增程序为：95℃5min；95℃30sec，56℃30sec，68℃5min，35个循环；68℃5min；

pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化4886bp左右的条带；

回收的dna片段与blant3-t载体(takara公司)连接，5μl体系中加入tvector1μl，回收片段4μl，混匀混合液，16℃连接过夜，热击法转入e.coli大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。

(2)重组表达载体的构建。

a.提取含有正确测序的gmysl74886bp基因序列的t载体质粒，用smai和bamhi酶切获得核苷酸序列；

b.用smai和bamhi酶切ptf101质粒，获得线状的ptf101核苷酸序列；

c.将gmysl7核苷酸序列片段先克隆到ptf101载体中；

d.将步骤3的连接产物热激转化感受态大肠杆菌dh5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒gmysl7-ptf101。

实施例3、农杆菌eha101介导的大豆稳定转化。

（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：

a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒dna，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；

b.放入液氮中5min后取出，将管转入37℃（5min）融化后，加入800μllb（无抗性）液体培养基，28℃低速振荡(150r/min)4-5h；

c.4000r/min，30sec,去上清，加100μllb液体培养基，悬浮菌体后涂板含50mg/ml卡那霉素）；

d.置28℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化。

（2）大豆稳定转化。

以大豆品种w82为材料，取种子材料用氯气消毒10h后，置于灭菌水中，在26℃条件下暗培养16h：

a.菌液制备：将经过初次培养-继代培养至od600为0.8-1的农杆菌液保菌，用前3天划平板，前一天下午在平板上挑菌斑，用40%甘油稀释后涂平板，第二天早上收集长好的菌苔，用液体ccm(em)稀释至od=0.7-0.8；

b.外植体准备：涂平板同时在gm上萌发豆子。第二天早上菌板长好细菌，大豆萌发约16小时。在平板上倒少量菌液，用15号手术刀片将萌发好的大豆上胚轴切断，后沿两片子叶正中间将两片子叶分开，尽量做到每片子叶都附有生长点（每个外植体是由一片子叶连着一段下胚轴组成的，即一枚种子可以形成两个外植体）开始接种；

c.接种外植体：30-40片切好的外植体置于三角瓶中，加入50毫升重悬于共培养液的农杆菌菌液，要确保外植体被菌液充分包被浸润，放置在水平摇床上，转速80-100rpm，在下午5点左右换新重悬的菌液，放置26°暗培养过夜；

d.共培养：第三天早上在共培养培养基上铺一层经过高压灭菌的滤纸，将浸染后的外植体在灭菌的滤纸上蘸干多余的菌液，并在超净台内吹干表面。然后近轴面向下平铺于滤纸上面，16-18个/皿，在温度26℃暗培养5天。

e.丛生芽的诱导：共培养后，接于诱导丛生芽培养基上。在26℃,18hlight/6hdark光照体系下培养14天后，切掉丛生芽，使外植体在si培养基上继代培养2周；

f.丛生芽的伸长：在诱导丛生芽的最后期间，取已生成的分生组织，在生长点的基部作新的切口（水平方向的），并将培养组织移入伸长培养基。每两周将培养物向新的培养基上转移一次。每次转移时在外植体的基部作一个新的水平切口。在6-8周培养以后，伸长的芽应该有清晰的分化。这个时期可以延长到12周；

g.生根：将伸长的芽(一般剪取芽长>4cm)用iba（1mg/ml）蘸1-2min后移入生根培养基上生根。培养大约2-4周，长出足量的根系时,进行移栽；

h.移栽：将生根的小苗小心移入小花盆中，花盆里放入（进口土：营养土=1：1）培养土。移栽后需套保鲜袋一周，使苗习惯于土壤的新环境并保持湿度，培养间的温度于26℃，一周后取下保鲜袋。

实施例4、过表达转基因植株鉴定。

（1）材料获取：实验所用材料为稳定转化t0代叶片（剪取0.1g，暂存于液氮）。

（2）mrna的分离：采用trizol法提取大豆总rna，①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织0.1-0.2g加入1ml离心管中然后加入1mltripure试剂，充分震荡，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体，室温放置5min；②加200μl氯仿，振荡混匀，室温静置5min，4℃，12000r/min，离心15min；③将上清移入另外一个离心管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；④弃上清，用75%的乙醇（depc处理过的无菌水配制）洗，4℃，12000r/min，离心10min，重复两次，室温风干10min左右，加20μl左右depc处理过的rnasefree水（depc水）溶解沉淀。

（3）反转录为cdna：将提取的mrna用takara反转录试剂盒，反转录为cdna。

（4）实时荧光定量pcr分析：采用tiangen公司的superrealpremixplus（sybrgreen）试剂盒，具体实验方法如下：在10μl体系中加入上步所得cdna模板0.2μl、正反向引物各0.2μl、2xsuperrealpremixplus5μl、ddh2o4.4μl；扩增程序为：95℃，15min；95℃，10sec；60℃，34sec，40cycles；65℃，5sec，95℃，5sec；其中，

正向引物为：gtggtgtcattgctggtttg（seqidno：4）；

反向引物为：ctaggttgccaaaagccttg（seqidno：5）。

实施例5、过表达转基因植株籽粒铁含量测定。

将5g稳定转基因不同line的籽粒送至中检志康公司进行铁含量测定，主要仪器设备为原子吸收光谱仪。

结果如图1所示，表明在完全相同的实验环境下，上调表达gmysl7的转基因籽粒铁含量同空载体转化的转基因（ev）相比，铁含量显著增加（图1a），图1b为对转基因叶片中gmysl7的表达水平分析，结果显示在稳定转基因叶片中gmysl7的表达是显著上调的。

实施例6、讨论分析。

ysl是一类转运寡肽和铁等离子的蛋白，广泛存在于植物中。在模式植物拟南芥中有8个ysl蛋白，对这些蛋白表达模式和在铁转运中的功能有所报道。比如ysll和ysl3在根和叶中在叶子的叶脉和叶脉周围的薄壁组织中表达，而且在老叶中的表达比嫩叶显著增强；在根中，它们主要在维管组织表达。而它们在花组织中的表达模式却不同，ysll主要在未成熟的花药和成熟雄蕊的花丝中表达，而ysl3则只在成熟雄蕊的花药和花粉中表达（waterseta1.,2006）。ysll和ysl3的单突变体都没有明显表型，但ysl1单突变体种子中铁和na的含量降低（leeta1.,2005）。ysl1ysl3双突变体表现出明显的脉间黄化现象，同时表现出根和叶子、种子中的铁含量降低以及育性降低、花粉无活力、种子发育异常、萌发率降低等症状，而外源施加铁可以部分互补这些表型（waterseta1，2006）。ysl1ysl3双突变体老叶中fe、mn、zn和cu的再活化效率降低，说明ysli和ysl3在植株体内对这些离子的再分配、老叶中铁的再活化和铁向花序、种子的运输过程中起重要作用。

本发明首创提出了基于特定ysli7基因提高植物组织中微量元素（铁）含量的方法，在本技术领域取得了开拓性的突出技术进步。利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆籽粒的铁含量，对于大豆的生物强化及提升大豆的营养品质等均具有重要的实际意义。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种提高植物组织中铁含量的方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4886

<212>dna

<213>大豆属大豆(glycinemax)

<400>1

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<210>2

<211>39

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>46

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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