一种水稻细胞色素P450编码基因OsRSb3及其应用的制作方法

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种水稻细胞色素p450编码基因osrsb3及其应用。

背景技术：

水稻是重要的粮食作物，其生产直接影响我国国民的经济发展。水稻纹枯病是由立枯丝核菌(rhizoctoniasolanikühn)引起的一种土传真菌病害，与稻瘟病和白叶枯病并称为水稻三大病害，在某些纹枯病高发区能造成50％的减产，且有逐年加重的趋势，已经成为限制水稻高产的主要病害因素。近年来，随着气候变化的同时水稻高产、粗秆、多孽、大穗型种质的推广种植，种植密度加大以及氮肥的过量施用，使田间通风差、湿度大，为纹枯病菌侵染寄主创造了有力的环境条件。

目前，由于抗纹枯病水稻种质资源的缺乏、病原菌寄主范围广、抗逆性强以及遗传变异等因素，对纹枯病的防治仍没有较为系统的方法。在农业生产上，主要采用化学药剂对水稻纹枯病进行防控，但化学药剂对环境的影响以及造成病原菌耐药性等问题随之而来。在全球大部分水稻种植区，90％以上的水稻品种表现不同程度的感病。关于抗水稻纹枯病相关qtl和基因虽然已有报道，然而由于田间纹枯病的发生及病害流行受到如水稻长势、冠层密度以及田间农艺操作等多重因素的影响，并且在纹枯抗性鉴定方面如接种方法、病害调查及分级标准也不尽统一，导致调控纹枯病抗性的主效基因及qtl仍未解析清楚，抗纹枯病育种进展缓慢。因此，对水稻纹枯病抗性相关基因的研究不仅具有重大的理论意义，同时能够促进水稻抗纹枯病种质资源挖掘和遗传改良，最终达到对纹枯病的有效防控和农业的增产增收。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种水稻细胞色素p450编码基因osrsb3，以及该基因在抗水稻纹枯病中的应用，为培育抗纹枯病水稻品种提供新的方法。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种正向调控水稻纹枯病抗性的细胞色素p450蛋白osrsb3基因，该基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。将该基因与植物过表达载体连接重组后，转化至水稻感纹枯病品种lement中，发现转基因水稻中该基因的表达水平提高，且对纹枯病的抗性提高；将该基因与植物干涉载体连接重组后，转化至水稻抗纹枯病品种特青中，发现转基因水稻中该基因的表达水平降低，且对纹枯病的抗性降低。通过在水稻中过量表达该基因，可以获得抗纹枯病水稻植株，可用于抗纹枯病水稻品种的选育。

本发明还提供了一种含有上述基因的过表达载体，以及含有该过表达载体的农杆菌菌株。

本发明的用途为：

(1)本发明通过基因工程手段将该基因与过表达载体连接后，转化至水稻中，提高该基因在转化后的水稻植株中的表达，可以使该水稻植株对纹枯病的抗性提高；另外可以利用该基因过量表达其它植物中其同源基因的表达，而增强其它植物的抗病性。

(2)用于水稻抗纹枯病机制的解析，如将该基因序列连接到任何一种含有荧光蛋白基因的转化载体上，用任何一种转化方法将该基因和荧光蛋白基因共价导入水稻或其它植物细胞，利用荧光共聚焦透射电镜可以观察到在水稻或其它植物细胞中与荧光蛋白融合表达的osrsb3蛋白在植物细胞中的迁移及定位，明确该基因在细胞中的作用部位；还可利用此osrsb3基因编码的蛋白为诱饵蛋白钓出水稻或其它植株中与该蛋白互作的蛋白，明确该基因在抗纹枯病过程中的调控模式。

本发明的有益效果是：本发明通过对水稻细胞色素p450编码基因osrsb3的克隆及其抗纹枯病功能分析，有助于解析水稻抗纹枯病的分子机制。在实践上可以通过转基因手段利用该基因培育抗纹枯病水稻材料，进一步通过品种间杂交，获得性状稳定的抗纹枯病水稻品种，有效控制纹枯病的发生，提高水稻产量。

附图说明

图1为osrsb3基因于纹枯病菌侵染的不同时间点在抗感水稻品种中的表达模式；

图2为osrsb3基因在过表达植株中的表达；

图3为osrsb3基因在干涉植株中的表达；

图4为水稻感纹枯病材料lemont和以感纹枯病材料lemont为背景过表达osrsb3基因植株接种纹枯病菌72h时症状；

图5为水稻抗纹枯病材料特青和以抗纹枯病材料特青为背景干涉表达osrsb3基因植株接种纹枯病菌72h时症状。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例一：水稻osrsb3基因cdna的克隆及其序列分析

将水稻特青种子于37℃催芽1天后，播种于温室中，取三叶期水稻叶片提取rna。提取方法采用trizol法，具体操作步骤如下：

(1)取50～100mg新鲜水稻叶片，放入事先准备好的的研钵(depc水浸泡24h，高温灭菌)中，加入适量液氮冷冻研磨成粉末状；

(2)将研磨后的粉末移入事先准备好的无酶的1.5mlep管，立即加入1ml的trizol试剂，注意样品总体积不超过trizol体积的10％；

(3)将ep管冰浴15min后，加入400μl体积的氯仿，涡旋1min后，冰浴15min；

(4)4℃条件下，12000rpm离心15min，小心吸取450μl体积的上清液至对位的无酶1.5mlep管；

(5)加入500μl体积的异丙醇，混合均匀；放入-20℃冰箱，冷冻沉淀不少于30min；

(6)冷冻沉淀结束后，4℃条件下，13000rpm离心20min，沉淀即为rna；

(7)离心结束后，倒掉上部液体，注意勿将rna倒出。加入1ml75％乙醇(750μl的无水乙醇和250μl的depc水混合物)，室温条件下反复洗涤沉淀2～3次，每次5～10min；每次洗涤结束后，4℃条件下，7500rpm离心5min；

(8)洗涤结束后高速瞬时离心，用小枪头把多余的酒精吸掉；

(9)自然风干，使酒精挥发，根据实验要求加入适量的depc水，放置于-80℃冰箱保存备用；将获得的rna通过反转录获得cdna，反转录采用y0y0b0公司的revertraaceqpcrrtmastermixwithgdnaremover试剂盒进行；具体操作如下：取lugrna和适量双蒸水混匀，总体积为12ul，65℃处理5min，冰上迅速冷却后，加入4xdnasemix4ul，37℃处理5min。加入5xrtmastermix4ul，37℃处理15min后，再于50℃处理5min，98℃处理5min，终止反应。

以日本晴基因组为模板设计引物osrs1，序列如下：

osrs1-f:5'-atggaagaaccaaccagctgctac-3'(seqidno.2)；

osrs1-r:5'-catggagtggcacacgaacgacgg-3'(seqidno.3)。

以反转录获得的cdna为模板扩增，采用rt-pcr法克隆水稻特青的osrsb3基因，具体反应体系如下：2×phantamaxbuffer25μl、dntpmix(10mmeach)1μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase1μl、模板cdna2μl、ddh2oupto50μl；反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。反应结束后，获得的基因送往擎科新业生物技术有限公司(成都)测序。测序结果如结果如下：

atggaagaaccaaccagctgctacggttactaccactacctcgccctcgccgtggccgtgctggtgctcgtccgggtcacgaggacgcgcggcggcggcagcgatggcgtcaggctgccgccggggccgtggcggctgccggtgatcggcagcctgcaccacctcgccgggaagccgctggtgcaccgcgcgctggcggacctcgcgcggcggatggacgcgccgctcatgtacctccggctcggcgaggtccccgtggtggtggccacgtcgccgggcgccgcgcgcgaggtgatgcggacgcacgacgtcgcgttcgcgacgcggccggtgaaccccaccgtgaggatcatgacggccgacggggagggcctcgtgttcgcgccctacggcgcgctgtggcgacagctccgccgcatcgccatcctggagctcctctccgcgcgccgcgtccagtcgttccgccgcgtcagggaggaggaggccgcgcgcctcgccgccgccgtcgcggcggcggcgccccacggcgaggcggccgtcaacgtcagcgagcggatcgccgtgctcatcgccgactcggcggtgcgcgccatgatcggggacaggttcaagaagcgggacgagttcttggaggccctcgccgaggggctcaagctcgtctccgggttcagcctcgccgacctgttcccgtcgtcgtggctcgccagcttcgtcaccggcgcggcgcggcgggcgcaggagaaccaccgcaagaacttcgagctcatggaccgcgccatcgagcagcaccaggagcggcgcgcggcggcagcggcggcgagcggcgacgtcgtggaagacgacgatctggtggacgtcctcttgaggattcagaagggaggtggcctcgacgtgcctctcaccatggggatcatcaaagcagtaatccttgacctttttagcgccggaagtgagacatcggcgactacaatccaatgggccatgtcggagctcatgaggaacccaagagtgatgaagagagcgcaagctgagttacgcgacaatctccaagggaagccaaaggtgaccgaggaagacttggccgacctaaattacctaaagctcattatcaaagagacgctgaggttgcatctgccagcgcctttgctccttcctagggagtcgagggagtcatgcaaaatctttggatatgatgtgccaaaaggtaccactgtgtttgttaacgcttgggcaattggtagagatcctaagtattgggatgaccccgaagagttcaagcctgagcgatttgaggatagcaagattgactttaagggtttggactttgagttcttgccatttgggtctggacggagaatgtgtcctggtataatgttcgcgcagccgaacatagaactcgccctcgccacccttctctaccacttcgattggagcctccctgctggggtgaagccaagtgagctagatatgaccgaggagatgggcatcactgttaggaggaagaatgacctatacctacatgccgtcgttcgtgtgccactccatgcgacgacaccctag(seqidno.1)。

实施例二：osrsb3基因在抗感水稻品种中的表达分析

分别提取分蘖期水稻特青和lemont侵染0h、12h、24h、48h和72h的叶片rna，分析osrsb3基因在两个水稻材料中不同侵染时间点的表达水平。

两个水稻材料的rna提取及反转录方法同实施例1。采用荧光定量pcr法分析osrsb3基因的表达水平。根据克隆的osrsb3基因序列设计荧光定量pcr引物osrs2，序列如下：

osrs2-f:5'-gatcggggacaggttcaagaag-3'(seqidno.4)；

osrs2-r:5'-tccatgagctcgaagttcttg-3'(seqidno.5)。

以两个水稻不同侵染时间点叶片的rna反转录产物为模板，反应体系为20ul(2×aceqqpcrsybrgreenmastermixprimer1(10μm)10.0μl，primer1(10μm)0.4μl，primer2(10μm)0.4μl，50×roxreferencedye10.4μl，templatedna/cdna2μl，用ddh2o补足20.0μl)，以水稻osubq基因为内参基因，引物序列如下：

ubq-f：5'-caagatgatctgccgcaaatgc-3'(seqidno.6)；

ubq-r：5'-tttaaccagtccatgaacccg-3'(seqidno.7)。

采用美国伯乐公司的cfxconnectreal-timepcrsystem荧光定量pcr仪进行荧光定量pcr反应。反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃延伸1min，循环40次。实验结果表明水稻细胞色素p450编码基因osrsb3在抗病品种特青中高表达，且相对于未侵染对照，侵染12h时表达量上调；在感病品种lemont中基本不表达，如图1所示。

实施例三：osrsb3基因过表达转基因水稻植株的获得

为鉴定osrsb3基因在纹枯病抗性中的功能，本发明将实施例1中获得的序列片段克隆入植物表达载体pbwa(v)ks中，构建osrsb3基因的过表达载体。将构建好的osrsb3基因过表达载体采用电激转化法转化农杆菌gv3101，并转化感病品种lemont，具体操作由武汉伯远生物科技有限公司完成。转化植株经检测表明osrsb3基因在过表达转化植株中表达明显高于野生型，如图2所示。

实施例四：osrsb3基因干涉转基因水稻植株的获得

为进一步验证osrsb3基因在纹枯病抗性中的功能，本发明构建了osrsb3基因的干涉载体，并转化水稻抗纹枯病品种特青。具体方法如下：基于osrsb3基因cds序列设计特异性引物osrsb3i，序列如下：

osrsb3i-f:5'-agagtgatgaagaga-3'(seqidno.8)；

osrsb3i-r:5'-tgcgcgaacattatacca-3'(seqidno.9)。

以已克隆的osrsb3基因为模板，采用高保真酶transstartfastpfudnapolymerase(trnasgen)pcr扩增osrsb3基因序列。扩增序列连接至pbwa(v)hs载体中，获得osrsb3基因的干涉载体。将构建好的osrsb3基因干涉载体采用电激转化法转化农杆菌gv3101，并转化抗病品种特青，具体操作由武汉伯远生物科技有限公司完成。转化植株经检测表明osrsb3基因在干涉转化植株中表达明显低于野生型，如图3所示。

实施例五：过表达和干涉水稻植株的抗纹枯病鉴定

采用纹枯病菌接种水稻离体叶片的方法进行过表达和敲除水稻植株的抗纹枯病鉴定。具体方法如下：

(1)用打孔器(直径约5mm)在带有纹枯病菌菌丝的pda培养基边缘打孔取直径大小均一的小块，接种到新鲜的pda培养基的平板上，倒置放在28℃培养箱中，活化培养2～3d，待培养基表面长满白色菌丝后拿出；

(2)剪取水稻分蘖期倒二叶叶片，放置于铺有滤纸的40×30×3cm白色瓷盘，滤纸用无菌水浸湿，叶片背面紧贴滤纸；将培养的新鲜纹枯病菌培养皿边缘均匀打孔，以保证每个琼脂块含有大致均一的菌丝量，将菌块置于离体叶片中间部位，带菌丝的一面紧贴叶片表面。为保持病原菌侵染所需较高的湿度，采用保鲜膜包裹白色瓷盘，置28℃光照培养箱；

(3)72h后观察发病情况，病测量病斑长度。

实验结果表明osrsb3基因干涉水稻植株明显比野生型感病，osrsb3基因过表达水稻植株明显比野生型抗病，见图4和图5。进一步说明osrsb3基因具有正向调控水稻纹枯病抗性的功能。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

序列表

<110>四川农业大学

<120>一种水稻细胞色素p450编码基因osrsb3及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1560

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggaagaaccaaccagctgctacggttactaccactacctcgccctcgccgtggccgtg60

ctggtgctcgtccgggtcacgaggacgcgcggcggcggcagcgatggcgtcaggctgccg120

ccggggccgtggcggctgccggtgatcggcagcctgcaccacctcgccgggaagccgctg180

gtgcaccgcgcgctggcggacctcgcgcggcggatggacgcgccgctcatgtacctccgg240

ctcggcgaggtccccgtggtggtggccacgtcgccgggcgccgcgcgcgaggtgatgcgg300

acgcacgacgtcgcgttcgcgacgcggccggtgaaccccaccgtgaggatcatgacggcc360

gacggggagggcctcgtgttcgcgccctacggcgcgctgtggcgacagctccgccgcatc420

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gaggccgcgcgcctcgccgccgccgtcgcggcggcggcgccccacggcgaggcggccgtc540

aacgtcagcgagcggatcgccgtgctcatcgccgactcggcggtgcgcgccatgatcggg600

gacaggttcaagaagcgggacgagttcttggaggccctcgccgaggggctcaagctcgtc660

tccgggttcagcctcgccgacctgttcccgtcgtcgtggctcgccagcttcgtcaccggc720

gcggcgcggcgggcgcaggagaaccaccgcaagaacttcgagctcatggaccgcgccatc780

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gacgatctggtggacgtcctcttgaggattcagaagggaggtggcctcgacgtgcctctc900

accatggggatcatcaaagcagtaatccttgacctttttagcgccggaagtgagacatcg960

gcgactacaatccaatgggccatgtcggagctcatgaggaacccaagagtgatgaagaga1020

gcgcaagctgagttacgcgacaatctccaagggaagccaaaggtgaccgaggaagacttg1080

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cctttgctccttcctagggagtcgagggagtcatgcaaaatctttggatatgatgtgcca1200

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aagaatgacctatacctacatgccgtcgttcgtgtgccactccatgcgacgacaccctag1560

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tgcgcgaacattatacca18