一种检测硫氰酸根的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测硫氰酸根的荧光探针及其应用。

背景技术：

大多数阴离子对生命系统有毒性作用，极少数阴离子控制着几种代谢过程，硫氰酸盐（scn^-）就是一种这样的阴离子。scn^-离子是氰基化物在体内解毒后的代谢产物，主要存在于唾液、血清和尿液中。其通常以30-100mm的含量存在于血液中，而在唾液和牛奶中可达到0.5-1.6mm，并且充当抗微生物剂。可在h2o2存在下氧化硫氰酸盐，其具有杀菌或抑菌活性。而缺乏它会导致囊性纤维化和其他与炎症相关的疾病。正常人血浆中的scn^-水平在10至140mm之间变化。尽管少量scn^-离子对人体无毒无害，但研究表明，它是有机碘化过程的抑制剂，如果体内长期存有过高浓度的scn^-离子，会导致地方性甲状腺肿大，眩晕和意识模糊等病症，同时它也是致癌物质n-亚硝基化合物在胃内合成的催化剂。所以对scn^-离子的检测具有非常重要的意义。

用于检测硫氰酸根的方法除了利用其与铁离子形成络合物产生红色沉淀的方法外，近年来又发展了利用气相色谱、电化学方法、阴离子色谱柱、电位滴定法以及光谱法等。但是这些方法大多分析时间长，操作方法相对复杂，合成的分析底物多是一些金属配合物，并多伴有其他阴离子的干扰。而与这些方法相比，荧光探针则拥有选择特异性好、灵敏度高、即时检测和响应迅速等众多优势。这些优点使得其在化学、生物医学等学科领域都有着较为广泛的应用，尤其是在生物医学领域，荧光探针不仅可以用于体外分析还可以用于活体的影像学研究。

近年来，能特异性检测硫氰酸根的小分子荧光探针被大量报道。然而，其中许多探针水溶性差、灵敏度低、ph的变化对检测的效果影响较大，这些缺陷很大程度上影响了探针的应用。因此发展稳定灵敏的硫氰酸根检测探针具有十分重要的意义。

技术实现要素：

针对目前水溶性差、灵敏度低、ph的变化对检测的效果影响大等问题，本发明提供一种检测硫氰酸根的有机硅荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞和斑马鱼中检测硫氰酸根的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测硫氰酸根的荧光探针，其化学结构式如式（i）所示：

式（i）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）4-溴-1,8-萘酐与甲硫醇钠于乙醇中反应，分离、提纯得纯净化合物a：

；

（2）氨丙基双封头、乙二醛与甲醛于乙醇、冰醋酸溶液中反应，分离、提纯得化合物b：

；

（3）化合物a与化合物b于乙醇中加热反应，分离、纯化得荧光探针：

。

步骤（1）中，所述4-溴-1,8-萘酐与甲硫醇钠物质的量比为1:1.5。

步骤（1）中，所述反应时间为24h。

步骤（1）中，所述分离提纯步骤为：向反应后的混合液中加水，得到沉淀后，以甲醇:二氯甲烷（v/v）=1:20为洗脱液进行柱层析提纯，即得化合物a。

步骤（2）中，所述氨丙基双封头、乙二醛与甲醛的物质的量比为1:1.2:1。

步骤（2）中，所述反应时间为6h。

步骤（2）中，所述分离提纯步骤为：加入无水mgso4除去体系中的水分，抽滤后将滤液置于旋转蒸发仪上蒸发掉体系中的乙醇，即可得到产物b。

步骤（3）中，所述化合物a与化合物b的物质的量比为1:2。

步骤（3）中，所述加热温度为50℃。

步骤（3）中，所述反应时间为24h。

步骤（3）中，分离、纯化步骤为将反应液旋蒸、干燥，以甲醇:二氯（v/v）=1:10为洗脱液，柱层析得到荧光探针。

一种上述荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中硫氰酸根的应用。

本发明的机理如下：

检测硫氰酸根的荧光探针，探针本身发射硫甲基萘酰亚胺的荧光，加入硫氰酸根之后，探针中4号位上的硫甲基被硫氰酸根所取代，荧光淬灭。

本发明具有以下优点：

本发明的检测硫氰酸根的有机硅荧光探针，能特异性识别硫氰酸根，响应速度快、抗干扰能力强。且合成原料易得，合成步骤、纯化方法简单。在检测溶液、细胞或生物体中硫氰酸根有重要应用价值。

附图说明

图1是探针的核磁谱图（氢谱）；

图2是探针在水相中的选择性。其中，激发波长为405nm；探针浓度为10µm，选择性阴离子浓度为0.1mm；

图3是探针与硫氰酸根作用的荧光滴定实验。其中激发波长为405nm；探针的浓度为10µm；

图4是探针与硫氰酸根作用的紫外滴定实验。探针的浓度为10µm；

图5是探针的硫氰酸根斑马鱼成像测试。探针浓度为10μm，硫氰酸根浓度为0.1mm，激发波长为405nm。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1荧光探针的合成

（1）将2.77g4-溴-1,8-萘酐溶于50ml乙醇中，再将3g甲硫醇钠溶于50ml乙醇中，再一同加入250ml茄型反应瓶中，室温反应搅拌24h。反应结束后，向反应瓶中加入100ml水，得到黄色沉淀，过滤后干燥得到黄色固体，柱层析法提纯，洗脱液为甲醇:二氯甲烷（v/v）=1:20，得到纯净化合物a：

；

（2）称取11.94g氨丙基双封头加入50ml无水乙醇溶解，再称取4.8g冰乙酸，缓慢加入到体系中；再称取6.38g乙二醛、4.87g甲醛混合均匀后加入体系中；常温条件下反应6h；加入无水mgso4除去体系中的水分；抽滤后将滤液置于旋转蒸发仪上蒸发掉体系中的乙醇，即可得到产物b：

；

（3）将1.064gb溶解于50ml乙醇中，在将0.162ga加入50ml乙醇中，再一同加入至250ml茄型烧瓶中，50℃加热搅拌回流24h。旋蒸、干燥，以甲醇:二氯（v/v）=1:10为洗脱液，柱层析得到荧光探针，其¹hnmr图谱如图1：

。

实施例2荧光探针对不同阴离子的选择性

配制5ml浓度为1mm的各种常规阴离子的pbs水溶液（ph=7.4）及浓度为1mm的实施例1所得荧光探针母液作为备用。

分别加入探针母液和各阴离子溶液，探针终浓度为10µm，选择性阴离子终浓度为0.1mm，用磷酸缓冲液pbs定容至3ml，摇匀后30min进行荧光检测（λex=405nm，λem=520nm），建立荧光强度与各离子的柱状图，如图2所示，1-12加入的分别为氯化钠、醋酸钠、硫化钠、碳酸氢钠、硫氰酸钠、硫酸氢钠、亚硝酸钠、硝酸钠、硫酸钠、碳酸钠、探针。由图2可以发现，其他离子对荧光探针的荧光几乎没有影响，而硫氰酸根的加入使荧光探针的荧光显著减弱。

实施例3不同浓度的硫氰酸根对探针的荧光滴定检测

配制10ml浓度为1mm硫氰酸根的水溶液及浓度为1mm的实施例1所得荧光探针母液作为备用。

配制探针终浓度为10μm，分别与不同浓度的硫氰酸根（0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100μm）相互作用，并进行荧光检测（λex=405nm，λem=520nm），计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与硫氰酸根浓度标准曲线，如图3。由图3可知，随着硫氰酸根浓度的增加，反应体系荧光强度逐渐降低。

实施例4不同浓度的硫氰酸根对探针的紫外滴定检测

配制10ml浓度为1mm硫氰酸根的水溶液及浓度为1mm的实施例1所得荧光探针母液作为备用。

配制探针终浓度为10μm，分别与不同浓度的硫氰酸根（0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10μm）相互作用，并进行紫外检测，如图4。由图4可知，随着硫氰酸根浓度的增加，405nm处的紫外吸收峰逐渐降低，295nm处的紫外吸收峰逐渐升高。

实施例5探针检测硫氰酸根斑马鱼成像测试

配制浓度为1mm的实施例1所得荧光探针母液作为备用。

将10μm的探针溶液加入斑马鱼中孵育20min。待孵育结束后，用荧光显微镜在单光子模式下拍摄斑马鱼黄绿色荧光照片；随后原位加入50μm硫氰酸根溶液，10s后拍摄，发现斑马鱼中的黄绿色荧光淬灭，且随后60s内荧光强度基本无变化。