紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法与流程

本发明涉及一种紫色红曲菌mokh基因过表达菌株的构建方法，属于生物基因工程领域。

背景技术：

红曲菌又称“红曲霉”，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌可以产生多种次级代谢产物，如红曲色素、monacolink、γ-氨基丁酸和桔霉素等，其中许多代谢产物被广泛的应用于食品色素、医药、酿酒等方面，monacolink又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，monacolink具有抑制胆固醇合成中关键酶hmg-coa活性的作用，能够有效的抑制胆固醇合成，因此，monacolink被国内外视为降胆固醇的理想药

由于对红曲菌中次级代谢产物monacolink生物合成途径的研究起步较晚，所以很多细节尚未清楚。但由于与土曲霉中monacolink的结构相似，因此根据土曲霉中monacolink的生物合成途径来推测红曲菌中monacolink的生物合成途径。经过研究初步推测，红曲菌中monacolink的生物合成基因簇中有9个功能域与土曲霉中monacolink生物合成酶基因高度同源，即moka-moki。基因过表达技术是分子生物学中十分重要的一项技术，主要是通过将完整的强启动子与目的基因融合，使目的基因能在宿主中进行表达，从而构建过表达载体，通过转化受体菌，获得该目的基因产物大量积累的菌株。曾有相关实验对红曲霉cg-6中的moke基因进行过表达，最后发现moke的过表达对红曲霉的菌体生长、孢子形态及生殖方式均有影响。而对于mokh基因在紫色红曲菌中的调节机制，目前未有研究，通过比较，发现mokh基因与love基因、mlcr基因具有同源性，因此推测mokh基因在monacolink合成过程中起到转录因子的作用，调控特异性途径上的基因，其表达量可能会直接影响其余8段基因的表达，从而影响monacolink的合成。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种紫色红曲菌mokh基因过表达菌株的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

1)设计了一对引物mokh-f和mokh-r，具体如下：

mokh-f：5’-gctctagaatggccctatcgccagt-3’(xbai)；

mokh-r：5’-cccaagcttttaggaggccaggttgtgtt-3’(hindiii)；

2)通过pcr扩增紫色红曲菌基因组中的mokh基因；

3)将扩增得到的mokh基因连接到pbc-hygro原核表达载体上，构建pbc-hygro-mokh高表达质粒；

构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用quickcutclaⅰ和xbaⅰ进行双酶切验证，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。

4)制备红曲菌原生质体

（1）将红曲菌m1接种于试管斜面培养基，30℃培养7-10d。

（2）加0.9%无菌生理盐水用接种环轻轻刮菌体表面，释放并收集孢子，制备成均一浓度的孢子悬液（1×10⁸-1×10⁹个/ml）。

（3）取200μl均一孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的pda固体培养基上，30℃培养36-40h。

（4）用涂布棒刮取玻璃纸上的菌丝体并收集到500目尼龙布上，用0.6mmgso4溶液洗1-2次。

（5）取约0.3g菌丝体于100ml三角瓶中，并加入30ml裂解酶液，于30℃，60r/min酶解2.5h，然后用500目尼龙布过滤。

（6）滤液于4℃，7000r/min离心5min，弃上清。

（7）将收集的原生质体沉淀用1.2mol/l预冷的山梨醇溶液洗涤2次，然后将其分成2份。一份用预冷的1.2mol/l山梨醇溶液重悬后，于-80℃保存。另一份则用1.2mol/l山梨醇溶液重悬后置于冰上备用。

5）通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到mokh过表达菌株。

本发明的有益效果：

本发明成功的克隆出了紫色红曲菌中的调控基因mokh，将得到的mokh基因在紫色红曲菌中进行过表达，从而探究mokh基因在紫色红曲菌中的功能。

通过hplc检测和潮霉素基因组的扩增，筛选出mokh基因过表达的目的工程菌株。对筛选出的工程菌株次级代谢产物、菌丝体形态及基因表达量进行检测，从而探究mokh基因在紫色红曲菌m1中对代谢、生长及基因表达的作用。

附图说明：

图1是pbc-hygro-mokh重组质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图，泳道1：dl10000dnamarker；泳道2,3：pbc-hygro-mokh+quickcutclaⅰ+xbaⅰ。

图2a红曲菌m1菌株对潮霉素b的耐受浓度，图2b是导入质粒菌株的筛选结果，图中，第一行：m1菌株；第二行；加入质粒的m1菌株。

图3是rna琼脂糖凝胶电泳图，泳道1：dl2000dnamarker；泳道2：过表达h7菌株转录组；泳道3：紫色红曲菌m1转录组。

图4是h7菌株潮霉素转录组的pcr电泳图，泳道1：dl2000dnamarker；泳道2,3:h7菌株；泳道4：m1菌株。

图5是三种菌株monacolink产量检测。每组比较中，从左到右以此是m1菌株、过表达菌株和敲除菌株。

图6是三种菌株色素产量检测，a：红曲红色素；b：红曲橙色素；c：红曲黄色素。每组比较中，从左到右以此是m1菌株、过表达菌株和敲除菌株。

图7是mokh基因过表达菌株h7与普通m1菌株在不同倍率下扫描电镜图，a：m1菌株5000×；b：h7菌株5000×；c：m1菌株10000×；d：h7菌株10000×。1：凹陷；2：褶皱。

具体实施方式：

实施例1

本实施例提供一种紫色红曲菌mokh基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：

1)设计了一对引物mokh-f和mokh-r，具体如下：

mokh-f：5’-gctctagaatggccctatcgccagt-3’(xbai)。

mokh-r：5’-cccaagcttttaggaggccaggttgtgtt-3’(hindiii)。

2)通过pcr扩增紫色红曲菌基因组中的mokh基因；

3)将扩增得到的mokh基因连接到pbc-hygro原核表达载体上，构建pbc-hygro-mokh高表达质粒；

构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用quickcutclaⅰ和xbaⅰ进行双酶切验证，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。

4)制备红曲菌原生质体，并通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到mokh过表达菌株。

实施例2质粒验证

一、重组质粒的验证

构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用quickcutclaⅰ和xbaⅰ进行双酶切验证。结果如图1所示，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。

二、重组质粒的导入及转化子的筛选

制备红曲菌原生质体，并通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，再结合潮霉素b浓度筛选浓度结果，筛选导入过表达质粒的转化子。结果如图2a所示，从图中看出，随着潮霉素b浓度的增加，加入质粒和未加入质粒的红曲菌m1菌株的菌落数都逐渐减少；当潮霉素b浓度为10μg/ml时，加入质粒的红曲菌m1菌株的菌落数明显多于未加入质粒红曲菌m1菌株；当潮霉素b浓度为15μg/ml时，加入质粒的红曲菌m1菌株有菌落生长，而未加入质粒的红曲菌m1菌株则无菌落生长。因此，挑取潮霉素b浓度为15μg/ml抗性板上的菌落，从而成功获得具有潮霉素b抗性的转化子。

通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，再结合潮霉素b浓度筛选浓度结果，筛选导入过表达质粒的转化子。结果如图2b所示，从图中看出，随着潮霉素b浓度的增加，加入质粒和未加入质粒的红曲菌m1菌株的菌落数都逐渐减少；当潮霉素b浓度为10μg/ml时，加入质粒的红曲菌m1菌株的菌落数明显多于未加入质粒的红曲菌m1菌株；当潮霉素b浓度为15μg/ml时，加入质粒的红曲菌m1菌株有菌落生长，而未加入质粒的红曲菌m1菌株则无菌落生长。因此，挑取潮霉素b浓度为15μg/ml抗性板上的菌落，从而成功获得具有潮霉素b抗性的转化子。将获得的转化子在具有潮霉素b抗性的平板上传5代，再进行发酵培养，对其monacolink的产量以及潮霉素b基因组进行测定，以筛选出阳性转化子。

实施例3过表达菌株的验证

一、rna质量验证

将m1菌株在发酵培养基中培养12天后，对菌株中的rna进行提取，通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的rna质量，电泳结果如图3所示，有清晰的条带出现，且28s条带的亮度是18s的2倍，说明rna提取成功，且未降解。然后检测rna的od260/280比值、浓度，rna的浓度在300-500ng/μl之间，od260/280比值在1.8-2.1之间，说明rna提取成功，且未被污染。综上结果，该rna可以作为反转录扩增的模板，并进行后续实验。

二、过表达菌株h7潮霉素基因的pcr验证

通过hplc初步筛选出高产monacolink的转化子红曲菌株h7后，对h7菌株进行潮霉素基因的pcr验证。分别提取红曲菌m1菌株和h7菌株的rna，再将其反转录成cdna。以cdna为模板，hygro-f和hygro-r为引物进行扩增潮霉素基因。结果如图4所示，对照菌株红曲菌m1菌株未能扩增出明显条带，而h7菌株能扩增出明显条带，说明h7菌株中成功的导入了过表达质粒，因此说明，mokh过表达菌株构建成功。

三、monacolink产量检测

将过表达菌株h7、红曲菌m1菌株及mokh基因缺失菌株一起进行摇瓶发酵培养，通过hplc分别检测两种菌株不同阶段monacolink产量，以观测mokh基因对monacolink产量的影响。结果如图5所示。由图可知，第15d时，过表达菌株与m1菌株相比monacolink产量提高了0.82倍，达到了243.84mg/l，敲除菌株产量为84.42mg/l，降低了0.37倍。由此推测，mokh基因对紫色红曲菌monacolink的合成起正调控作用。

四、红曲色素产量检测

通过紫外分光光度计分别检测2，5，8，12，15d的h7菌株、m1菌株及mokh基因缺失菌株的红曲红色素、红曲橙色素和红曲黄色素。结果如图6a-c所示，由图得三种色素的产量变化总体呈现一致性，均是过表达菌株的三种色价低于普通的m1菌株和敲除菌株；敲除菌株的色价略高m1菌株。结合monacolink产量检测结果及文献报道推测：由于合成monacolink和红曲色素的前体物质均为乙酰辅酶a，所以两支路存在竞争关系，因此当monacolink产量增多时，红曲色素的产量会在一定程度上减少；反之，当monacolink产量降低时，红曲色素的产量会相应提高。所以，mokh基因过表达菌株的色素产量最低；mokh基因缺失菌株的色素产量最高。

五、过表达菌株h7微观菌体形态的检测

通过扫描电镜检测h7菌株和m1菌株菌丝体的形态差异，结果如图7所示，对比图a和图b可知，h7菌株的菌丝体与m1菌株相比更为饱满；对比图c和图d可知，h7菌株的菌丝体凹陷程度及褶皱明显多于m1菌株。由此推测，mokh基因的过表达可能会刺激胞内物质分泌到胞外，从而使红曲菌菌丝体的形态发生改变。

序列表

<110>北京工商大学

<120>紫色红曲菌mokh基因过表达菌株的构建方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gctctagaatggccctatcgccagt25

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cccaagcttttaggaggccaggttgtgtt29