一种抗逆性三疣梭子蟹的筛选方法与流程

本发明属于海水贝类免疫特性检测技术领域，具体涉及一种评价三疣梭子蟹的抗逆性的筛选方法。

背景技术：

三疣梭子蟹(portunustrituberculatus)，也称海蟹、海螃蟹、枪蟹，为甲壳纲(crustacea)、十足目(decapoda)、梭子蟹科(portunidae)、梭子蟹属(portunus)的物种。由于缺乏特异性免疫系统，甲壳类动物必须完全依靠非特异性免疫来抵挡各种病原及异物的入侵。甲壳类动物中的细胞介导的免疫防御主要通过循环血细胞进行，血细胞由成年动物中的自我更新的造血干细胞连续产生。血细胞通过吞噬作用、包裹作用、黑化和细胞凝集消除入侵病原体，并在甲壳类动物的防御机制中发挥关键作用。

三疣梭子蟹养殖作为浙江省四大优势产业之一,近年来养殖量逐渐攀升,尤其设浙北一代宁波、舟山是梭子蟹养殖主产业带,养殖围塘面积约占全省四分之三。由于养殖密度的逐渐扩大，造成养殖水环境的恶化，从而导致蟹类体质的急剧下降，进而爆发流行性疾病，每年因疾病引起的损失占养殖产量的30％～50％,特殊年份,损失在60％～70％,这大大制约了三疣梭子蟹养殖产业的发展。现下，养殖三疣梭子蟹过程引起病害主要原因有病毒、细菌、真菌、寄生虫类，对于这些病害多主要通过加入抗生素药物来解决，然而这并不能从根源上解决养殖过程中出现的病害问题，且抗生素药物的大量使用严重时会导致食品安全问题。因此筛选出抗逆性三友梭子蟹品种进行育苗培养，可以更好的从根源上环节养殖过程中病害问题的影响。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种抗逆性三疣梭子蟹筛选方法，可以有效的筛选抗逆性好的三疣梭子蟹用于育苗，从而解决现有的检测三疣梭子蟹免疫特性技术上的不足。

本发明首先提供一种筛选抗逆性三疣梭子蟹的标准，其中具有抗逆性的三疣梭子蟹的标准包含有如下的一个或几个指标：

血细胞中颗粒细胞与透明细胞的含量分别为38.47±1.78％和57.44±1.28％，

血细胞中透明细胞的活性氧含量不低于22.7％；

血细胞中颗粒细胞的活性氧不低于40.19％；

血细胞中透明细胞的吞噬率不低于4.67％；

血细胞中颗粒细胞的吞噬率不低于15.29％；

上述的标准用于筛选具有抗逆性的三疣梭子蟹；

本发明再一个方面提供一种筛选抗逆性良好的三疣梭子蟹的方法，包括如下的步骤：

1)血淋巴的收集：

从待检测的三疣梭子蟹的游泳足基部收集血淋巴，将收集的血淋巴与抗凝剂混合后，在1000r/min，4℃下离心10min后离心弃去上清，收集的细胞使用4％的多聚甲醛进行固定，并用pbs溶液将沉淀进行洗涤后，用pbs重悬细胞；

2)将步骤1)制备的细胞使用流式细胞仪进行血细胞的形态学和亚群分析、血细胞的吞噬能力检测、活性氧的检测；

其中血细胞的形态学和亚群分析的条件如下：所获得的细胞悬液经细胞计数后进行流式上样；横坐标为fsg，纵坐标为ssg，收集10000个细胞的数据；

血细胞的吞噬能力检测：在收集的血淋巴加入适量的2μm荧光微球，室温下避光震荡孵育30分钟；孵育完成后，用pbs洗涤除去多余未结合的微球；在流式细胞仪激发光波长为488nm处接收荧光信号，收集细胞量为10000个。

活性氧的检测(ros)：使用非荧光探针2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(dcfh-da)与血细胞黑暗中在环境温度下孵育结合20分钟后取出，流式细胞仪激发光波长为488nm处进行检测，收集10000个血细胞。

3)使用检测的数据与上述确定的指标进行比较，满足要求的确定为具有抗逆性的梭子蟹。

本发明确定了流式细胞仪检测三疣梭子蟹血细胞的条件，并获得了筛选抗逆性三疣梭子蟹的标准，通过该标准可以筛选抗逆性良好的三疣梭子蟹品种。

附图说明

图1：三疣梭子蟹血细胞分群与各类群占比图，

图2：两种细胞类群ros和偏移率图，

图3：两种类群细胞吞噬率图。

具体实施方式

本发明通过对三疣梭子蟹血液细胞的形态及免疫特性(吞噬活性、活性氧含量)的检测，比较不同的种类的三疣梭子蟹之间免疫特性差异，从而为筛选抗逆性强的三疣梭子蟹品种提供可靠的技术手段。

本发明所使用的相关计算方法如下：

kaluza软件进行处理，spss18.0与origin8.0进行分析，数据均表示为平均值±标准差。通过单因素方差分析(anova)和多重比较检验组间的显着差异。

亚群分析：比较收集的一万个细胞中不同种类细胞以及含量。

活性氧含量差异：根据不同亚群的细胞的根据不同亚群细胞处理组组与空白相比较荧光偏移量的差异比价器活性氧含量的差异。

吞噬率分析：根据不同细胞吞噬荧光微球的荧光差异进行比较。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1

实验分别选取5只发育程度相同，体重相近的三疣梭子蟹与已进行过抗逆性筛选试验后存活，且具有良好生命活力的梭子蟹进行血液指标比较分析，具体步骤如下：

1)血细胞的形态学和亚群分析：所获得的细胞悬液经细胞计数后(细胞数控制在1-2x10⁶个/ml)，进行流式上样。横坐标为fsg，纵坐标为ssg，收集10000个细胞，检测三疣梭子蟹的细胞亚群

2)血细胞的吞噬能力检测：在上述收集的血淋巴加入适量的2μm荧光微球，室温下避光震荡孵育30分钟。孵育完成后，用pbs轻轻洗涤两次除去多余未结合的微球。在流式细胞仪激发光波长为488nm处接收荧光信号，收集细胞量为10000个。

3)活性氧的检测(ros)：使用非荧光探针2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(dcfh-da)与血细胞黑暗中在环境温度下孵育结合20分钟后取出，流式细胞仪激发光波长为488nm处进行检测，收集10000个血细胞。

流式细胞仪检测结果经专用分析软件kaluza进行分析，将实验组与空白对照进行叠加比较，将比较数据导出至excel表格，利用spss18.0对导出的数据进行单因素方差分析(anova)和多重比较检验组间的显著差异。利用origin8.0根据所得分析数据作图。

最终确定了判断三疣梭子蟹抗逆性良好的标准，所述的标准如下：三疣梭子蟹血细胞的颗粒细胞与透明细胞的含量分别为(38.47±1.78)％和(57.44±1.28)％，其中透明细胞的活性氧含量为22.7％，而颗粒细胞的活性氧40.19％；透明细胞的吞噬率为4.67％，颗粒细胞的吞噬率为15.29％。

实施例2

选取实施例1中具有良好抗逆性的三疣梭子蟹进行育苗培养，将其亲本子代与随机选取的未知抗逆性的养殖三疣梭子蟹进行比较实验，两类螃蟹各选取5只

模拟池塘养殖条件并对实验螃蟹进行细菌浸染，暂养一周后发现，检测确定知具有良好抗逆性的三疣梭子蟹的亲本子代5只仍然具有良好的生命活力，且其血液免疫特性检测结果均在所提出的标准范围以内，而另五只随机选取的三疣梭子蟹则有两只具有生命体征，但是不具有良好的活力，其血细胞免疫特性检测结果略低于所述标准，已经死亡的三只三疣梭子蟹的血细胞免疫特性检测结果低于上述鉴定标准。

检测时是从游泳足基部抽取两种螃蟹的血液进行免疫指标检测，步骤如下：

1)血淋巴的收集：使用一次性消毒1ml注射器从螃蟹游泳足基部收集血淋巴，注射器事先用预冷的灭菌抗凝剂润洗防止蟹血凝固。收集的血淋巴与抗凝剂以1：1的比例进行混合后，在1000r/min，4℃下离心10min后弃去上清，经过4％的多聚甲醛固定15min，并用pbs将沉淀进行洗涤两次后，用pbs重悬细胞。

2)亚群分析：取步骤1)胞悬液经细胞计数后(细胞数控制在1-2x10⁶个/ml)，进行流式上样。横坐标为fsg，纵坐标为ssg，收集10000个细胞，检测三疣梭子蟹的细胞亚群

3)吞噬能力检测：在上述收集的血淋巴加入适量的荧光微球，室温下避光震荡孵育30分钟。孵育完成后，用pbs轻轻洗涤两次除去多余未结合的微球。使用流式细胞仪(galliosbeckman)分析，收集细胞量为10000个。

4)活性氧的检测(ros)

将血细胞与10μmol/ldcfh-da在黑暗中在环境温度下孵育20分钟后取出进行流式上样检测，每个样本收取10000个细胞。

因此，本发明确定了流式细胞仪检测三疣梭子蟹血细胞的条件，并获得了筛选抗逆性三疣梭子蟹的标准，通过该标准可以筛选抗逆性良好的三疣梭子蟹品种。