一种特异性结合PDL1的核酸适配体及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种特异性结合pdl1的核酸适配体及其应用。

背景技术：

程序性死亡受体1(programmeddeath1,pd-1)是t细胞表面的跨膜受体，参与细胞的凋亡，pd1与pdl1(pd-1ligand1,pd-l1)和pdl2(pd-1ligand2,pd-l2)配体相互作用抑制t细胞的增殖，pdl1、dpl2主要表达在抗原递呈细胞中(如dc细胞、巨噬细胞)。研究发现，多种肿瘤细胞高表达pdl1，如多发性骨髓瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌等。肿瘤细胞在多种因子作用下高表达pdl1，与t细胞表面的pd1分子相互作用，抑制t细胞的活化与增殖，进而引起免疫逃逸现象。同时诸多研究证实，癌组织内pdl1蛋白的表达水平的升高明显降低病人的预后与存活率，因此有针对的阻断pd1/pdl1信号通路，能有效增强t细胞对肿瘤细胞的杀伤和肿瘤的治疗效果。

核酸适配体(aptamer)是一段dna，通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域，当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化。传统的抗原抗体反应灵敏度和特异性均较好，酶联免疫反应在各种生物分子的探测中发挥着举足轻重的作用，但是蛋白质作为探针分子，容易受ph、温度等环境因素影响而变性且合成价格昂贵，适配体由dna或rna构成(主要是dna)，比蛋白质体积更小，稳定性更好，在未来，适配体有望取代酶联免疫反应，成为各种化学分子探测的有力武器。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种特异性结合pdl1的核酸适配体及其应用。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种特异性结合癌细胞表面pdl1蛋白分子的核酸适配体，其序列如seqidno：1所示。

本发明还包括一种特异性结合癌细胞表面pdl1蛋白分子的核酸适配体在肿瘤检测方面的应用。

本发明还包括一种特异性结合癌细胞表面pdl1蛋白分子的核酸适配体在促进t细胞对肿瘤细胞杀伤的应用。

优选的应用，所述肿瘤为肺癌、多发性骨髓瘤、肾癌和黑色素瘤。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明的核酸适配体能与肿瘤细胞表面pdl1蛋白特异性结合，亲和力高，单链寡核苷酸只识别与其互补的空间结构，几乎可以完全避免非特异性结合；本发明的核酸适配体合成成本低，采用selex筛选技术可以实现自动化，并且筛选出的核酸适配体经化学合成纯度高，准确度与重复性好。

附图说明

图1为特异性结合pdl1的核酸适配体制备过程的流程示意图；

图2为流式细胞仪检测各组细胞中pe荧光的强度的示意图；

图3为2号aptamer和无意aptamer分别与人多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226和l363细胞孵育的荧光强度示意图；

图4为2号aptamer与rpmi8226细胞和l363细胞的kd值图；

图5为显微镜下2号aptamer和对照组aptamer与肾癌组织切片的识别和结合的结果示意图；

图6为显微镜下2号aptamer对肺癌细胞和正常肺细胞的表面pdl1蛋白的识别与结合的荧光结果示意图。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种特异性结合pdl1的核酸适配体及其应用，通过以下技术方案实现：

一种特异性结合癌细胞表面pdl1蛋白分子的核酸适配体，其序列如seqidno：1所示。

本发明还公开了特异性结合癌细胞表面pdl1蛋白分子的核酸适配体在肿瘤检测方面的应用。

本发明还公开了特异性结合癌细胞表面pdl1蛋白分子的核酸适配体在促进t细胞对肿瘤细胞杀伤的应用。

优选的应用，所述肿瘤为肺癌、多发性骨髓瘤、肾癌和黑色素瘤，多发性骨髓瘤细胞系如rpmi8226、l363等。

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种特异性结合癌细胞表面pdl1蛋白分子的核酸适配体，其序列如seqidno：1所示。

实施例2

1、如图1所示的流程示意图，通过人工合成，建立随机寡核苷酸库，以pdl1蛋白为靶蛋白，选择性分离出同靶蛋白特异性结合的核酸适配体(aptamer)。

2、rpmi8226属于pdl1阳性高表达细胞，l363属于阴性低表达细胞。采用消减selex筛选出与pdl1蛋白特异性结合的aptamer。消减selex筛选三个与pdl1蛋白特异性结合的aptamer，同时设计了一个无意aptamer；

无意核酸适配体aptamer序列seqidno：2：

acgggccaaatactcattcggtacgaccatgcgaccactgcttacgt；

1号核酸适配体aptamer序列seqidno：3：

acgggcctcacacatcaataattagccactgcctagagcgttcgcgt；

2号核酸适配体aptamer序列seqidno：1：

acgggcctctctgaacaaaggtattagacatcatgcgtgcccccagt；

3号核酸适配体aptamer序列seqidno：4：

acgggcacacatcactcgctgcccgtaagattattgaccaatcacgt；

消减selex筛选采用以下步骤：

⑴浓度10pmol/μl的随机寡核苷酸文库35微升加入到200微升选择性缓冲液内(tris.hcl50mm；kcl5mm；nacl100mm；mgcl1mm；ph7.4)，加热99℃5min变性，立即置于0℃5min(加入过量的酵母trna与bsa降低背景)；

⑵将上述溶液与1*10⁵个rpmi8226细胞37℃混匀孵育30min，1000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用选择性缓冲液溶解混匀，再1000rpm离心，如此反复6次；

⑶沉淀加入双蒸水，100℃加热10min，10000rpm离心5min，上清抽提核苷酸，20微升缓冲液溶解；

⑷将抽提出的核苷酸作为模板进行pcr扩增：

①反应体系：模板20微升；10*缓冲液10微升；dntps5微升；mgcl23.5微升；上下游引物各5微升；taq酶5微升；加水至50微升；

②反应条件：94℃3min，20个循环：94℃50s，55℃50s，72℃50s，最后72℃5min。

⑸pcr产物经苯酚：氯仿抽提出核酸，溶解于缓冲液中；

⑹再按照⑴～⑸步骤反复10轮左右，筛选出适量核酸适配体，再经反筛选进一步排除非特异性结合；

⑺经10轮筛选后的寡核苷酸文库，以l363细胞作为负性靶细胞进行反筛选，pcr产物99℃加热5min然后立即置于0℃5min；

⑻先将1*10⁵个l363细胞离心收集，弃掉上清，用上述液体与细胞沉淀在37℃混匀孵育30min，1000rpm离心5min，收集上清，继续用1*10⁵个l363细胞37℃孵育30min，再1000rpm离心5min，收集上清，如此反复5次；

⑼将最后筛选出的核苷酸，用上下游测序引物扩增成dsdna，回收纯化后连接到t载体，经筛选后随机挑选进行测序；

10)最终经11轮正筛与6轮反筛，确定三个aptamer以及合成了一个无意aptamer；

3、研究发现，多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226在ifn-γ的刺激下，细胞表面的pdl1蛋白表达明显增加。基于此，我们来检测筛选出的aptamer对人pdl1蛋白的结合情况并将其与pdl1抗体相对照。将rpmi8226细胞系传代到一个二十四孔板中的十个孔，每孔3*10⁵个细胞，随机选取五个孔，每孔加入1000iu的ifn-γ，37℃、5％co2培养箱中孵育24h；

4、24h后，取出其中八个孔中的细胞(4个无刺激、4个ifn-γ刺激24h)分别加入已灭菌的1.5mlep管内，1000rpm离心15min，弃掉上清，预冷的pbs洗涤一次，离心弃上清，将其和pe标记的不同aptamer(无意aptamer与1-3号aptamer)在100微升预冷pbs溶液中避光孵育20分钟，同时将剩余两个孔内的细胞收集并将它们分别与5微升的pe-pdl1抗体避光孵育20分钟。孵育完毕后，离心，弃上清，用200微升预冷pbs洗涤一次，再离心弃上清，加入600微升的预冷pbs，重悬细胞，流式细胞仪检测各组细胞中pe荧光的强度，如图2所示，已有研究报道rpmi8226在ifn-γ的刺激下，细胞表面pdl1蛋白的表达显著升高，pe-pdl1抗体与细胞共孵育也证实这一结果。我们还发现pe标记的2号aptamer显示的结果与pdl1抗体的结果最相近，提示我们2号aptamer与pdl1蛋白的结合与pdl1抗体几无差异。(*：与空白对照组相比p<0.05，**：与空白对照组相比p<0.01)。

5、选取人多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226(pdl1高表达)和l363(pdl1低表达)分别培养在含有10％fbs的1640培养基内，37℃，5％co2培养箱中培养。细胞在对数生长期时候，收集1*10⁵的rpmi8226与l363，将其和一系列不同浓度(0、5、25、125、250、500、1000nm)fam标记的2号aptamer在100微升结合缓冲液(含有0.5％bsa的pbs溶液)中37℃反应60分钟，pbs清洗两次，细胞上流式细胞仪检测：同等长度的无意aptamer作为随机对照。图3结果显示，1000nm的2号aptamer与pdl1高表达的rpmi8226细胞孵育的荧光强度明显强于随机对照组，而2号aptamer与低表达的l363细胞孵育的荧光强度与随机对照组几无差异。表明2号aptamer与pdl1高表达细胞结合性强。利用graphpadprism5软件计算2号aptamer与rpmi8226细胞和l363细胞的kd值，分析结果如图4所示，2号aptamer与rpmi8226细胞的kd值是68.45±5.36，l363细胞的kd值为189.35±51.34，2号aptamer与rpmi8226细胞的结合能力强于l363细胞；

6、采用临床肾癌病理切片来验证2号aptamer对癌组织表面pdl1蛋白的识别与结合。将石蜡包埋的正常肾组织与肾癌组织切片于65℃烤箱中烘烤1h，切片浸于二甲苯中脱蜡两次，每次10min；浸入无水乙醇两次，每次5min；切片依次经过梯度乙醇(90％、85％、70％乙醇各一次，每次3min)，最后浸入pbs；微波修复法对切片进行抗原修复，待冷却至室温，使用pbs洗两次；随后使用山羊血清室温封闭1h；去除封闭液，分别加入hrp标记的2号aptamer于4℃孵育1h；洗涤缓冲液洗3次，每次5min；随后加入辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育30min；经洗涤后，加入dab显色液显色(镜下控制时间)。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。结果如图5所示，2号aptamer能够特异性识别切片肾癌细胞表面pdl1蛋白，但与正常的肾脏呈现较弱结合，对照组aptamer与肾癌组织内pdl1蛋白结合也比较弱，从而2号aptamer在临床上可用于肾癌细胞表面pdl1蛋白的检测和诊断。

7、采用临床非小细胞肺癌病理切片进一步验证2号aptamer与肺癌细胞表面pdl1蛋白的识别与结合。将石蜡包埋的正常肺与非小细胞肺癌组织病理切片于60℃烤箱中烘烤1.5h，切片浸于二甲苯中脱蜡两次，每次10-20min；浸入无水乙醇两次，每次5-10min；切片依次经过梯度乙醇(90％、85％、70％乙醇各一次，每次3-5min)，最后浸入pbs；微波修复法对切片进行抗原修复，待冷却至室温，使用pbs洗两次；加入cy5标记的2号aptamer于4℃孵育1-2小时，pbs洗两次，每次3-5min，防荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察。结果如图6所示，非小细胞肺癌组织中，红色荧光强度明显高于正常肺组织，提示我们2号aptamer能识别与结合非小细胞肺癌组织表面的pdl1蛋白。

序列表

<110>山东昂科诺生物科技有限公司

<120>一种特异性结合pdl1的核酸适配体及其应用

<141>2019-05-10

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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