烟草AUX/IAA及其应用的制作方法

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及烟草aux/iaa及其应用专利申请。

背景技术：

生长素作为五大经典植物激素之一，几乎对植物的所有的生长发育过程都起着重要的调控作用。生长素信号转导主要受到aux/iaas(auxin/indoleaceticacids)蛋白和生长素响应转录因子(auxinresponsefactors，arfs)两类转录相关蛋白的调控。arf具有dna结合域，可以识别并结合生长素响应基因启动子中的生长素响应元件，从而激活生长素响应基因的表达。在植物体内不含或含较低浓度生长素的条件下，aux/iaa蛋白能与arf结合并抑制其转录活性，使其不能驱动下游目标基因的表达；当生长素浓度升高时，生长素能够促进aux/iaa蛋白的泛素化降解，解除其对arf的抑制作用，从而激活下游生长素响应基因的表达。大部分aux/iaa蛋白含有4个结构域，分别为domainⅰ、ⅱ、ⅲ和ⅳ，domaini具有保守的lxlxl氨基酸序列，具有转录抑制活性，domainⅱ决定aux/iaa蛋白的稳定性，domainⅲ和ⅳ则介导aux/iaa蛋白与arf之间、或不同aux/iaa蛋白之间的二聚化。

人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(nicotiana)有60多个种，而用于制备所吸食的烟草主要为两个栽培种，其中普通烟草(又称红花烟草，nicotianatabacum)占据主要面积，而黄花烟草(nicotianarustica)的栽培面积相对较小。

栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点，一般可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是栽培最广的普通烟草。我国烤烟种植面积和总产量均居世界第一位。作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。为使在未来的国内外市场竞争中立于不败之地，满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须提高烟叶品质和安全性。

植物色素是烟草中一类重要的化合物，主要包括叶绿素和类胡罗卜素类物质。叶绿素在烟草成熟和烟叶调制过程中大量降解消失，它在干烟叶中是一种不利的化学成分，往往带有青杂气，是烟叶分级中被严格控制的指标之一。如果叶绿素在调制处理过程中没有充分降解就把烟叶烤干，就会烤出不同程度的“青黄烟”。“青黄烟”不仅外观品质不良，燃烧时还会产生有害物质，进而影响烟草等级和品质。

烟叶发酵醇化过程中，叶绿素卟啉环一方面会降解产生吡咯类化合物，从而增加烟叶陈化香，降低青杂气；另一方面，叶绿素水解产生的植醇可进一步降解成新植二烯，并再降解成植物呋喃，进而转化成烟叶的清甜成分。因此，叶绿素是重要的香气前体物，充分降解后对烟质较为有利。

烟草黄色素主要是类胡萝卜素，烟叶类胡萝卜素含量与烟叶品质存在正相关关系，一方面是烟叶外观品质与该类成分含量直接相关；另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前体物质，对烟草的香气量和香气品质是正相关关系。烟叶中的香味成分很大一部分是类胡萝卜素的降解产物，其中不少化合物是烟草中关键的致香成分，如紫罗兰酮、大马酮和异佛尔酮等。

基于上述烟叶中色素的重要作用，对烟草色素类物质调控基因进行深入研究，利用基因工程构建新的烟草品种，可为改善烟草品种奠定良好应用基础。

技术实现要素：

基于烟草色素类调控基因的研究，本申请目的在于提供一种aux/iaa基因，其与烟草中色素类物质含量相关，通过调节该基因的表达（沉默或超表达），可以改变烟草叶片中色素类物质的含量，可为烟草新品种的开发和培育奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下：

烟草aux/iaa蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示，其由212个氨基酸组成，其中第83-211位氨基酸为其保守结构域。

烟草aux/iaa蛋白在植物叶片色素类物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中色素类物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中色素类物质含量明显降低，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素。

编码所述烟草aux/iaa蛋白的基因，包括639个碱基，其碱基序列如seqidno.2所示；所述烟草aux/iaa蛋白的编码基因，其特异性核酸片段为第170-583位碱基。

所述编码烟草aux/iaa蛋白的基因在叶片色素类物质含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草aux/iaa蛋白表达量，来调节控制烟叶中色素类物质含量情况，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素。

利用所述编码烟草aux/iaa蛋白基因的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有aux/iaa基因的病毒诱导沉默载体、rnai干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得色素含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（vigs）的技术，干扰aux/iaa基因的表达使其沉默，aux/iaa基因沉默植株中色素类物质含量显著下降，进而获得色素含量下降的植物新品种。

本发明通过对与烟草色素含量相关调节基因的研究，提供了一个烟草aux/iaa基因。进一步通过基因沉默技术，在将该基因沉默后，烟草中色素类物质含量发生了显著降低，利用这一特性，可为烟草植物新品种开发提供新的研究方向和借鉴参考。

附图说明

图1为本发明烟草trv2-pds,trv2-gfp及trv2-ntaux1载体转化组的表型比较图；

图2与对照植株相比aux/iaa1基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图3病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的主要色素含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；

下述实施例中所采用的vigs载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattlevirus，trv)，所具体利用的trv2由郑州烟草研究院基因中心保存，其带有卡那筛选标记和35s启动子，同时trv2带有ecori和bamhi等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

lb液体培养基，1l含量中含有：10g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone）；10g氯化钠（nacl）；5g酵母抽提物（yeastextract），高温高压灭菌；

yeb液体培养基，1l含量中含有：5g牛肉浸膏（beefextract）；5g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone）；5g蔗糖（sucrose）；1g酵母抽提物（yeastextract）；2ml1m硫酸镁（mgso4），高温高压灭菌；

1m2-(n-吗啉)乙磺酸（mes）储备液：ddh2o溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200mm乙酰丁香酮（acetosyringone，as）储备液：二甲基亚砜（dsmo）溶解，-20℃储存备用；

mma（100ml）：1ml（1m）mgcl2，1ml（1m，ph5.6）mes，75μl（200mm）as。

实施例1

本实施例就烟草ntaux/iaa1基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草ntaux/iaa1基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关aux/iaa1基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计pcr扩增用引物序列如下：

ntaux1-f：5’-accgaattcaaactttgcctttgcttg-3’，（下划线处“gaattc”部分序列为ecori酶切位点）

ntaux1-r：5’-accggatcctccagggtacatcaccag-3’；（下划线处“ggatcc”部分序列为bamhi酶切位点）；

以栽培烟草叶片k326的cdna为模板，进行pcr扩增获得ntaux/iaa1基因；

pcr扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸5min；

对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组trv2-ntaux1载体

将步骤（1）中的pcr扩增产物进行ecori、bamhi双酶切，同时对空载体trv2进行ecori、bamhi双酶切，分别回收酶切产物，利用t4dna连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态dh5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/lkan的lb固体培养基上，在37℃过培养夜；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行pcr鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体trv2-ntaux1。

需要说明的是：

烟草ntaux蛋白，包括212个氨基酸，具体氨基酸序列为：

mmelqlglalcsnsakgcnfddvkieslsgnfklnntkkcsssqvfdvvdenvqvlqtlpllvwdkandhnepqrkdgdeegvvgwppvnslrkklchhirrtggamnyvtvenggggggsggggrrsnskyvkvkmegvgiarkidlslfqsygtltdtliamfgkskengdtyeltyqdnegdwllagdvpwrtfvvsvqrlklvrdedy；

烟草ntaux蛋白的编码基因，包括639个碱基，具体碱基序列为：

atgatggaacttcaattggggcttgctttatgtagcaattcagcaaaagggtgtaattttgatgacgtaaaaattgagtctttgagtggaaatttcaagttgaacaacaccaagaaatgtagctcgagtcaagtttttgatgttgtagatgaaaatgttcaagttcttcaaactttgcctttgcttgtttgggacaaagctaatgatcacaatgaacctcaaagaaaggatggggatgaagaaggggtggtggggtggccaccggttaattctttgaggaagaagctctgccaccatatccgccgtaccggcggtgcaatgaactatgtcacggtggagaacggcggcggtggcggtggcagtggtggtggtggcagaagatcaaattctaagtacgtgaaagtgaaaatggaaggagttggaatagcaagaaagattgacttgagtctttttcaatcttatgggacactcactgacaccttaattgccatgtttggaaaaagtaaagaaaatggtgatacttatgaacttacttatcaagataacgaaggtgattggcttcttgctggtgatgtaccctggagaacttttgtcgtgtcagtgcagcggctaaaattggttagagatgaagattattga。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的vigs技术，发明人进一步将所构建的重组trv2-ntaux1载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了trv2-gfp、trv2-pds重组载体作为对照，具体转化过程为：

将trv2-gfp（载体对照）、trv2-pds（vigs效率对照）及trv2-ntaux1的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌gv3101感受态细胞中，利用含50mg/lkan和50mg/lrif的yeb平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落pcr筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5ml的yeb液体培养基（含50mg/lkan和50mg/lrif）中，28℃、250rpm条件下培养过夜；

取50ul过夜培养物接种至50ml的yeb液体培养基（含50mg/lkan）中，培养至od600=1.0~1.5左右，然后4000g离心5min，收集菌体，再用mma(1ml（1m）mgcl2；1ml（1m，ph5.6）mes；75μl（200mm）as)重悬，调节od600=1.0左右；

最后室温放置3h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4w苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1ml规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

注射3周后的烟草表型变化情况如图1所示。可以看出，含trv2-pds的农杆菌浸染植株新生叶有漂白现象，说明侵染成功；而trv2-gfp组则无明显变化，相对应的trv2-ntaux1组烟草叶片颜色则有明显变化，表明ntaux1基因与烟草叶片中色素含量高度相关。

进一步通过qrt-pcr对ntaux1基因表达情况进行了检测，结果如图2所示，可以看出，trv2-ntaux1的侵染植株中，ntaux1的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（trv2-ntaux1浸染植株）和对照组（trv2-gfp浸染植株）中的植物色素（新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素）含量情况进行了检测（根据中华人民共和国烟草行业标准yc/t382-2010“烟草及烟草制品质体色素的测定高效液相色谱法”进行检测），结果如图3及下表所示。

表1新鲜烟叶样品中植物色素含量变化情况

。

从上表结果可以看出，实验组中新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β胡萝卜素等各种色素含量与对照组相比均有显著下降，这进一步表明，通过沉默ntaux1基因，可对烟草叶片中植物色素的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控奠定一定技术基础。

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<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120>烟草aux/iaa及其应用

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