检测玉米蚜虫抗性基因的分子标记、引物、检测方法及应用与流程

本发明属于玉米基因检测技术领域，具体涉及一种检测玉米蚜虫抗性基因的分子标记、引物、检测方法及应用。

背景技术：

玉米蚜虫(rhopalosiphummaidis)是是玉米生长过程中具危害的害虫之一，主要以成、若蚜群集于叶片背面、心叶、花丝和雄穗取食、能分泌“蜜露”并常在被害部位形成黑色霉状物，影响光合作用，叶片边缘发黄；发生在雄穗上会影响授粉并导致减产；被害严重的植株的果穗瘦小，籽粒不饱满，秃尖较长。此外，蚜虫还能传播玉米矮花叶病毒和红叶病毒，导致病毒病造成更大的产量损失。

一年发生20代左右，以成、若蚜在麦类及早熟禾、看麦娘等禾本科杂草的心叶里越冬。翌年3-4月间随着气温上升，开始在越冬寄主上活动、繁殖为害。6月下旬7月初蚜虫由其他寄主迁往夏玉米，7月下旬玉米蚜大量迁入，抽雄前蚜虫在心叶为害，7月底至8月上旬玉米进入抽雄期，玉米蚜迅速增殖。8月上旬至中旬进入盛期，百株蚜量达万头以上。8月下旬末天敌大量出现，气候干燥凉爽，蚜量急剧下降，集中在雌穗苞叶或下部叶片，玉米收获前产生有翅蚜迁飞其他寄主。

目前对蚜虫的防治主要有：清除田间地头杂草，减少早期虫源，玉米心叶期，在蚜虫盛发前施用颗粒剂，苗期和抽雄初期进行喷雾防治，以上方法均是在玉米种植之后的防治措施，治标不治本，目前没有抗蚜虫功能标记的报道，因此研发一种能够检测玉米蚜虫抗性基因，用于培育抗蚜虫玉米品种尤为重要。

技术实现要素：

本发明提供的一种检测玉米蚜虫抗性基因的分子标记、引物、检测方法及应用，该分子标记能够检测玉米蚜虫抗性基因，检测效率高，降低了工作繁琐度。

本发明的第一个目的是提供一种检测玉米蚜虫抗性基因的分子标记，所述分子标记为fm.rm1，核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种用于扩增所述分子标记的引物，所述引物的序列为：

上游引物fm.rm1-f：5’-aaagcaaggcagcaaaagc-3’

下游引物fm.rm1-r：5’-tgcgtgatgcagttgagca-3’。

本发明的第三个目的是提供一种利用上述引物检测玉米蚜虫抗性基因的方法，具体包括以下步骤：

s1，提取待检测玉米的基因组dna；

s2，以所述玉米的基因组dna为模板，以上游引物和下游引物进行pcr扩增，得到扩增产物；

s3，琼脂糖凝胶电泳检测：将pcr扩增后的产物用3g/100ml浓度的琼脂糖凝胶分离检测，依次吸取pcr扩增后的产物6μl与1μl的6×loadingbuffer溶液混匀后，依次加到点样孔中。在第一个点样孔中加入dnamarker作为分子量标记，用于检测目的条带的大小，用1×tae电泳缓冲液进行电泳，设置电压220v，电流150ma，时间45分钟，电泳结束后，用核酸染料进行染色并在凝胶成像分析系统下检测pcr反应结果并保存胶图，如果检测到218bp和206bp两条扩增条带，则说明待测玉米基因组dna含有抗性分子标记fm.rm1，且含有玉米蚜虫抗性基因，如果仅检测到206bp一条扩增条带，则说明待测玉米基因组dna不含抗性分子标记fm.rm1，不含有玉米蚜虫抗性等位基因。

进一步的，利用所述引物检测检测玉米蚜虫抗性基因的方法中，所述pcr扩增使用的反应体系为：

基因组dna2μl，上游引物fm.rm1-f0.2μl，下游引物fm.rml-r0.2μl，2×taqpcrmix5μl，ddh2o2.6μl；总体积10μl；上游引物fm.rm1-f和下游引物fm.rml-r的浓度均为5μm；

所述pcr扩增使用的反应条件为：

所述pcr扩增使用的反应条件为：预变性95℃，5min；进入pcr扩增循环，每个循环先95℃，30s变性，58℃，30s复性，72℃，1min延伸，重复35次，最后4℃保存，完成pcr的扩增。

本发明的第四个目的是提供一种所述的分子标记在检测玉米蚜虫抗性等位基因或者在培育抗蚜虫玉米品种中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种所述的引物在检测玉米蚜虫抗性等位基因或者在培育抗蚜虫玉米品种中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种检测玉米蚜虫抗性基因的分子标记、引物、检测方法及应用，具有以下有益效果：

本发明是我们科研团队经过多年的研究积淀，独创性地发现玉米蚜虫抗性基因的一个功能变异。这个功能性变异是我们首次报道，在以前专利中没有相关的报道。围绕一个蚜虫抗性候选基因，开发了一个玉米蚜虫抗性功能分子标记，该分子标记能够检测出玉米蚜虫抗性基因，检测效率和准确性高，在培育抗蚜虫玉米品种中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为玉米蚜虫抗性基因的全基因组关联分析图。

图2为玉米蚜虫抗性基因的qtl定位图。

图3为感蚜虫材料b73和抗性材料回交群体的pcr扩增结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了一种检测检测玉米蚜虫抗性基因的分子标记，检测玉米蚜虫抗性基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记为fm.rm1，核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述分子标记fm.rm1获得方式如下：

利用全基因组的关联分析(如图1所示)，鉴定出一个抗性基因，并依据抗性基因在材料的差异，设计抗功能分子标记，用于抗性育种。

基因的确定：

利有基于双亲群体在第4染色体上鉴定出了一个主效的qtl，关联分析在该基因区间内找到一个显著的分子标记，该分子标记位于本发明的蚜虫抗性基因内，所述蚜虫抗性基因核苷酸序列如seqidno.2所示。通过生物信息学的分析，预测该基因参与丁布的生物合成，而丁布的含量与蚜虫的抗性有很大的相关性，玉米蚜虫抗性基因的qtl定位如图2所示。

将该基因在抗病亲本和感病亲本间进行测序列，发现的抗病亲本比感病亲本在一个区域内有12个碱基的长度差异，利用该差异设计能够检测该差异的特异性引物。

基于同一种发明构思，本发明还提供了一种用于扩增分子标记的引物，所述引物的序列为：

上游引物fm.rm1-f：5’-aaagcaaggcagcaaaagc-3’(如seqidno.32所示)；

下游引物fm.rm1-r：5’-tgcgtgatgcagttgagca-3’(如seqidno.4所示)。

为了验证上述分子标记、引物及检测方法的可行性，我们用b73(感蚜虫材料)和抗性材料hrrm01的回交群体，进行pcr扩增，验证特异分子标记fm.rm1的适用性。本发明还提供的利用所述引物(上游引物fm.rm1-f和下游引物fm.rm1-r)检测抗玉米蚜虫抗性基因的方法，具体包括以下步骤：

s1，提取待检测玉米的基因组dna；

s2，以所述玉米的基因组dna为模板，以上游引物和下游引物进行pcr扩增，得到扩增产物；

所述pcr扩增使用的反应体系为：

基因组dna2μl，上游引物fm.rm1-f0.2μl，下游引物fm.rm1-r0.2μl，2×taqpcrmix5μl，ddh2o2.6μl；总体积10μl；上游引物fm.rm1-f和下游引物fm.rm1-r的浓度均为5μm；

所述pcr扩增使用的反应条件为：

预变性95℃，5min；进入pcr扩增循环，每个循环先95℃，30s变性，58℃，30s复性，72℃，1min延伸，重复35次，最后4℃保存，完成pcr的扩增。

s3，琼脂糖凝胶电泳检测：将pcr扩增后的产物用3g/100ml浓度的琼脂糖凝胶分离检测，依次吸取pcr扩增后的产物6μl与1μl的6×loadingbuffer溶液混匀后，依次加到点样孔中。在第一个点样孔中加入dnamarker作为分子量标记，用于检测目的条带的大小，用1×tae电泳缓冲液进行电泳，设置电压220v，电流150ma，时间45分钟，电泳结束后，用核酸染料进行染色并在凝胶成像分析系统下检测pcr反应结果并保存胶图，如果检测到218bp的扩增条带，则说明待测玉米基因组dna含有抗性分子标记fm.rm1，且含有玉米蚜虫抗性基因，如果检测到206bp左右的较短的扩增条带，则说明待测玉米基因组dna不含抗性分子标记fm.rm1，不含有玉米蚜虫优良的抗性等位基因。

结果：如图3所示，在第1、2、3、4、6、11泳道的玉米材料不包含抗性分子标记fm.rm1，也就是说不包含优良抗性等位基因；泳道5、7、8、9、10、12的玉米材料是包含抗性基因的杂合体。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>河南农业大学

<120>检测玉米蚜虫抗性基因的分子标记、引物、检测方法及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>218

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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