鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量rt-pcr引物及探针。

背景技术：

裂谷热(riftvalleyfever，rvf)是由裂谷热病毒(riftvalleyfevervirus，rvfv)引起的急性出血性人兽共患病，该病主要发生于绵羊、山羊、牛和骆驼，也可以传染给啮齿动物和人。裂谷热病毒主要经蚊虫传播，也可通过接触感染或者发病动物的血液、体液、分泌排泄物等被感染。动物感染裂谷热的重症症状为发热、厌食、流涕、急性腹泻、黄疸，羔羊和犊牛死亡率高达90％，怀孕母羊和母牛流产率高达80-100％。人感染后通常无症状或者症状较轻，少于5％的病人发展为综合征，如急性肝炎、出血热或者脑炎。世界动物卫生组织(oie)将裂谷热列为必须报告的疫病，我国将其列为一类传染病。裂谷热病毒属于布尼病毒科(bunyaviridae)白蛉病毒属(phlebovirus)，为单股负链rna病毒，基因组可分为l(大)、m(中)、s(小)三个节段。其中s节段采取双义编码的方式，编码核蛋白n和非结构蛋白nss。m节段编码两种囊膜糖蛋白，以及nsm和未知功能的结构蛋白。l节段序列高度保守，编码rna依赖的病毒聚合酶。

裂谷热最初主要在非洲撒哈拉以南地区周期性流行，2000年向北蔓延到阿拉伯半岛，引起也门和沙特阿拉伯的疫情大爆发。2016年，我国发现首例输入性裂谷热病例，警示该输入性传染病已对我国的公共卫生安全构成了现实性的威胁。因此，建立一种快速准确的针对裂谷热病毒的诊断技术方法，对于加强我国对裂谷热病毒的检测，严格控制裂谷热的输入有现实意义。

目前，国际上还没有人用的裂谷热商品化疫苗，仅有少量兽用疫苗被批准，包括灭活疫苗和弱毒活疫苗。其中，clone13弱毒活疫苗已在南非和津巴布韦获批，该nss缺失株主要毒力因子nss基因中含有大量缺失。灭活疫苗虽然安全，但须重复增加剂量；弱毒活疫苗虽然免疫原性较高，但存在毒力回归的生物安全隐患。有研究者建立了rvfv的t7rna聚合酶驱动的反向遗传系统，构建nss单独缺失和nss/nsm同时缺失的特异性弱毒株，它的毒力比目前可用的弱毒株clone13、mp-12和smithburn更弱，且可以同野生毒株区分开来。这种弱毒株具有成为裂谷热疫苗的巨大潜力。因此，我们选择病毒l基因保守区域以及nss缺失部位设计相应的引物和探针，建立双重荧光定量rt-pcr方法。该方法在快速检测裂谷热病毒的感染的同时，将能够用于区分基因缺失的疫苗毒株和野毒株，进行鉴别诊断。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的在于提供一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量rt-pcr引物及探针。本发明提供的双重荧光定量rt-pcr引物及探针可以检测和鉴别裂谷热病毒野生株和nss基因缺失株。

技术方案

本发明分别设计了一对针对裂谷热病毒的通用检测引物l-f、l-r及一条荧光探针l-p，一对针对野生株的特异性检测引物s-f、s-r及一条荧光探针s-p，并确定了该方法的特异性引物及荧光探针的浓度。具体为：

一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量rt-pcr引物及探针，其特征在于，所述检测裂谷热病毒的通用检测引物及探针的序列分别为：

上游引物l-f：5’-tgacatacaaggagcatctgaaa-3’；

下游引物l-r：5’-gccaaaggtgaaatcgtgaac-3’；

荧光探针l-p：5’–joe-aggctcaactttgctaccctccat-tamra-3’；

检测裂谷热病毒非基因缺失株的特异性检测引物及探针的序列分别为：

上游引物s-f：5’-aggatgatagtgaccgaggct-3’；

下游引物s-r：5’-aatgagggctgagtttggaa-3’；

荧光探针s-p：5’–fam-cctcagagggattgacctgtgcctgttgcca-tamra-3’。

所述双重荧光定量rt-pcr引物及探针可以制备试剂盒，可以在检测裂谷热病毒感染方面的应用，该应用仅限于诊断疾病以外的应用。

所述的应用，其特征在于，

(1)合成所述的引物及探针；

(2)质粒标准品的制备：将包含登录号为he687307.1的裂谷热病毒s片段和登录号为he687305的l片段进行基因合成，并克隆至载体pmd19-t中制成阳性质粒，即为标准品，将标准品10倍梯度稀释至:1×10⁸-1×10¹拷贝/μl，储存于-20℃备用；

(3)待测模板的制备：将包含登录号为he687307.1的裂谷热病毒s片段和登录号为he687305的l片段进行基因合成，并克隆至pcdna3.1中，转染至293t细胞，收获细胞裂解液用于制备阳性模板；

取100μl血清或细胞裂解液，或取100mg组织样品，加入500μlpbs缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清液100μl，加入400μltrizol试剂，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，加入100μl氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温孵育30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，rna沉淀于管底，加入500μldepc处理的水配置的75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10分钟，用20μl无rnase水溶解，即为检测用rna模板；

(4)进行双重荧光定量rt-pcr反应：裂谷热病毒感染的双重荧光定量rt-pcr方法的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有裂谷热病毒核苷酸则显示fam和joe阳性扩增曲线；若待检样品中含有裂谷热nss缺失株(包括clone13及其他nss缺失株)核苷酸则显示joe阳性扩增曲线，fam无扩增信号；若待检样品中不含有裂谷热病毒核苷酸则均无扩增信号。所述双重荧光定量rt-pcr检测体系具体包括：

所述双重荧光定量rt-pcr反应的反应条件为：42℃5min；95℃10s；95℃5s、60℃34s，40个循环。

有益效果：

本发明一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量rt-pcr引物及探针选择病毒l基因保守区域以及ns缺失部位设计相应的引物和探针，建立双重荧光定量rt-pcr方法。该方法在快速检测裂谷热病毒的感染的同时，将能够用于区分基因缺失的疫苗毒株和野毒株，进行鉴别诊断，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，可为疫病监测防控提供有力工具。

具体原理是分别利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热dna聚合酶(taq酶)、核苷酸单体(dntp)等成分，并应用pcr技术实现两个靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为5’端分别标记荧光报告基团fam(s)和joe(l)，3’段标记荧光淬灭基团(tamra)的两条寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在pcr扩增过程中，taq酶的5’端外切酶活性将特异性结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。本发明引物及探针也已经委托保存有裂谷热缺失型和非缺失型病毒样品的实验室提取样品核酸，利用本发明方法建立的双重荧光定量rt-pcr进行检测。结果证明了本方法可有效鉴别区分缺失型和非缺失型裂谷热病毒样品。

本发明的优点：

1、本发明提供的引物和探针具有非常良好的灵敏度，本发明方法对10拷贝/μl以上模板量的扩增均能出现典型的扩增曲线；

2、本发明提供的引物和探针对于不含有裂谷热病毒的检测样品均无扩增信号，说明其具有良好的特异性；

3、本发明对裂谷热基因序列进行分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生；

4、本发明采用荧光定量pcr技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了普通pcr检测常出现假阳性结果的现象。由于对pcr产物进行实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力；

5、本方法在快速检测裂谷热病毒的感染的同时，能够区分裂谷热野生毒株和疫苗毒株(包括clone13及其他类似缺失株)，有效鉴别野生病毒感染动物和疫苗接种动物。

附图说明

图1：荧光定量pcr扩增曲线，利用裂谷热双重荧光定量方法检测裂谷热病毒s和l片段10倍稀释(10^-1-10^-8)的标准质粒。target1为nss，target2为l。

图2：荧光定量pcr标准曲线，利用裂谷热双重荧光定量方法检测裂谷热病毒s和l片段10倍稀释(10^-1-10^-8)的标准质粒。target1为nss，target2为l。

图3：荧光定量pcr扩增曲线，将包含裂谷热病毒野生型s片段、缺失型s片段和l片段的片段进行基因合成，构建真核表达载体，两种s片段分别与l片段转染细胞后转录产生野生型和缺失型病毒基因mrna。分别提取核酸后进行荧光定量pcr扩增。

图4：荧光定量pcr特异性扩增曲线，利用裂谷热双重荧光定量方法检测裂谷热病毒阳性质粒和其他病原核酸(包括小反刍兽疫病毒、山羊副流感病毒3型、蓝舌病病毒、山羊疱疹病毒、绵羊肺炎支原体)。

图5：荧光定量pcr敏感性扩增曲线，a图为nss基因阳性标准品敏感性扩增曲线，b图为l基因阳性标准品敏感性扩增曲线，利用裂谷热双重荧光定量方法检测裂谷热病毒阳性质粒(10拷贝/ml)。1:1×10⁸拷贝/μl；2:1×10⁷拷贝/μl；3：1×10⁶拷贝/μl；4：1×10⁵拷贝/μl；5：1×10⁴拷贝/μl；6：1×10³拷贝/μl；7：1×10²拷贝/μl；8：1×10¹拷贝/μl。

图6：临床样品的荧光定量pcr扩增曲线。利用双重荧光定量rt-pcr对临床样品进行检测。

具体实施方式

实施例1引物探针设计及方法建立

1、引物和探针设计：通过对裂谷热病毒基因组序列进行比较分析，选择s片段nss基因、n基因以及l基因的无二级结构且高度保守的区段，利用primerexpress3.0软件分别设计了一百多种引物和探针组合，同时利用多重pcr引物设计系统mpprimer软件评估引物组合的效果，进而通过试验验证并优化反应条件，以期筛选最佳靶基因、引物和探针的组合，同时检测两个基因。最终从一百多种引物和探针组合中仅筛选到一个引物探针组合可实现两个基因的良好扩增，最优引物、探针序列组合如下：

针对裂谷热病毒l基因的检测引物及探针的序列分别为：

上游引物l-f：5’-tgacatacaaggagcatctgaaa-3’；

下游引物l-r：5’-gccaaaggtgaaatcgtgaac-3’；

荧光探针l-p：5’–joe-aggctcaactttgctaccctccat-tamra-3’；

针对裂谷热病nss基因的检测引物及探针的序列分别为：

上游引物s-f：5’-aggatgatagtgaccgaggct-3’；

下游引物s-r：5’-aatgagggctgagtttggaa-3’；

荧光探针s-p：5’–fam-cctcagagggattgacctgtgcctgttgcca-tamra-3’。

本发明筛选过程中发现nss基因分别与n基因和l基因组合均会导致扩增曲线被抑制，尝试近百种引物组合均不理想。比如针对nss基因的引物探针a、b、c、d、e、f；针对n基因的引物探针g、h、i、j；针对l基因的引物探针k、l、m；单独使用均可实现扩增，但是不能实现在同一体系中通过双重荧光定量rt-pcr同时检测nss和n或l基因。示例如下：引物探针a-f均可针对nss基因进行特异性扩增；引物探针g-j均可实现对n基因的特异性扩增；引物探针k-m均可针对l基因进行特异性扩增。但是，其组合使用均不能实现在同一体系中同时检测nss和n或l基因，将荧光基团互换也无法得到理想结果。因此，本发明最终选择nss和l作为靶基因建立该方法，且仅筛选到上述的l-f+l-r+l-p+s-f+s-r+s-p组合。引物探针a(针对nss基因)：

上游引物：5’-tcagccctcattgctcttatg-3’；

下游引物：5’-catctgggattggaggaacaa-3’；

荧光探针：5’–fam-tgcgctcatcacttcctagcatga-tamra-3’。

引物探针b(针对nss基因)：

上游引物：5’-tctttctcatgcaccatcgtc-3’；

下游引物：5’-ctgaaaaggctttgctggtg-3’；

荧光探针：5’–fam-tcggacttggagactttgcatcaaac-tamra-3’。

引物探针c(针对nss基因)：

上游引物：5’-caggcagcaagagaggacat-3’；

下游引物：5’-aacatctgggattggaggaac-3’

荧光探针：5’–fam-taatgctgtagttccaaactcagccctc-tamra-3’。

引物探针d(针对nss基因)：

上游引物：5’-ttgcagagtggtcgtcgtg-3’；

下游引物：5’-ctttgctggtggaggtgca-3’；

荧光探针：5’–fam-cgtcctagtcacgaggttcgcttgcga-tamra-3’。

引物探针e(针对nss基因)：

上游引物：5’-gttgggccctgttgtgtctt-3’；

下游引物：5’-ggttctccaagaggccagga-3’；

荧光探针：5’–fam-acgttgcacctccaccagcaaagcc-tamra-3’。

引物探针f(针对nss基因)：

上游引物：5’-agggattgacctgtgcctgt-3’；

下游引物：5’-cagcatcaggctctcctcca-3’；

荧光探针：5’–fam-tgctgcctgcaggagccgaacac-tamra-3’。

引物探针g(针对n基因)：

上游引物：5’–cgatccagtttgctgctcaa-3’；

下游引物：5’-ctacgggcatcaaacccttg-3’；

荧光探针：5’–joe-agcaaactctcggacccactgttca-tamra-3’。

引物探针h(针对n基因)：

上游引物：5’–atccttcccgggatgagttg-3’；

下游引物：5’-aagccactcactcaagacga-3’；

荧光探针：5’–joe-cgagttgctgccgccctggc-tamra-3’。

引物探针i(针对n基因)：

上游引物：5’–ggtggacccttctctaccag-3’；

下游引物：5’-ggtggacccttctctaccag-3’；

荧光探针：5’–joe-tgtatctgctgcagttctcccggg-tamra-3’。

引物探针j(针对n基因)：

上游引物：5’–aacagtgggtccgagagtt-3’；

下游引物：5’-cttggcatccttctcccagt-3’；

荧光探针：5’–joe-accctacgggcatcaaacccttga-tamra-3’。

引物探针k(针对l基因)：

上游引物：5’–ggggagatgaaagaggtg-3’；

下游引物：5’-aggcgctaacaacataaag-3’；

荧光探针：5’–joe-ccaggctgccatgactaaactcgctaagt-tamra-3’。

引物探针l(针对l基因)：

上游引物：5’-acaaggagcatctgaaataggc-3’；

下游引物：5’-gccaaaggtgaaatcgtgaac-3’；

荧光探针：5’–joe-ctaccctccatgtcgatagatgtggaag-tamra-3’。

引物探针m(针对l基因)：

上游引物：5’-gccaatcaagcattatgactgtac-3’；

下游引物：5’-gagggtagcaaagttgagccta-3’；

荧光探针：5’–joe-cactcccaacatttgatgtctccaagat-tamra-3’。

2、反应体系的建立和优化：本发明采取基因合成方式制作阳性质粒作为阳性样品。将引物设计过程中筛选出的高保守区域前后分别延长30～50bp进行基因合成，并克隆至载体中制成阳性质粒，即为标准品。将标准品10倍梯度稀释，储存于-20℃备用。

2.1引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从0.1μmol/l至2.0μmol/l做连续倍比稀释，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.2μmol/l。

2.2探针浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将探针浓度分别从0.1μmol/l至0.5μmol/l作连续倍比稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定l基因探针的最佳终浓度为0.4μmol/l，nss基因探针的最佳终浓度为0.2μmol/l。

2.3循环条件的优化：通过比较荧光定量pcr的三温循环和双温循环进行筛选，同时将退火温度从55℃递增到65℃，对退火温度进行筛选。

利用上述引物、探针和循环条件的建立，最后确定采用的裂谷热病毒实时双重荧光定量rt-pcr反应体系为20μl，所需各组分及相应浓度见表1。

表1.裂谷热病毒实时荧光定量rt-pcr反应体系中的各组分情况：

3.仪器检测通道的选择：在进行荧光定量rt-pcr反应时，应对所使用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针两端所标记的荧光报告基团相一致。本发明所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(fam/joe)和荧光淬灭基团(tamra)的寡核苷酸，具体设置方法参照仪器使用说明书。

4.pcr反应条件选择如下：42℃，5分钟，反转录；95℃，10秒，预变性；95℃，5秒，60℃，34秒，40个循环。

5.检测步骤：

5.1选取引物和探针；

5.2制备待测模板，采用常规提取rna方法提取各种来源样品中核酸；

5.3反应体系的建立：表1。

5.4选择仪器的检测通道；

5.5上机检测。

6.样品检测

6.1待测样品核酸提取：取100μl血清或100μl细胞裂解液；或取100mg组织样品，加入500μlpbs缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清液100μl。加入400μltrizol试剂，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，加入100μl氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温孵育30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，rna沉淀于管底，加入500μl75％乙醇(depc处理的水配置)，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10分钟，用20μl无rnase水溶解，即为检测用rna模板；

6.2裂谷热病毒实时荧光定量pcr反应的扩增条件：根据表1加样，将加好样品的pcr管放置荧光定量pcr仪(abisteponeplustm)中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下：42℃，5分钟，反转录；95℃，10秒，预变性；95℃，5秒，60℃34秒，40个循环。试验结果可以实时监测。仪器检测通道的选择：在进行荧光定量rt-pcr反应时，应对所使用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，与探针两端所标记的荧光报告基团相一致。本发明所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(fam/joe)和荧光淬灭基团(tamra)的寡核苷酸，参照荧光pcr仪(abisteponeplustm)使用说明书具体设置选择的荧光检测参数。

6.3裂谷热病毒实时荧光定量rt-pcr

将包含裂谷热病毒野生型nss基因(登录号：he687307.1)、缺失型nss基因(登录号：dq380182)和l基因(登录号：he687305)的片段分别进行基因合成，并分别克隆至真核表达载体pcdna3.1(clonetech公司)中，转染293t细胞(购自中科院昆明细胞库)，使目的基因转录获得病毒基因mrna。同时转染野生型s片段和l片段载体的细胞样品作为野生型病毒样品，同时转染缺失型s片段和l片段载体的细胞样品作为缺失型病毒样品。

经检测，若待检样品中含有裂谷热病毒野生株(非缺失型裂谷热病毒)核苷酸则显示fam和joe阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达10拷贝/μl；若待检样品中含有裂谷热nss缺失株(包括clone13及其他类似缺失株)核苷酸则显示joe阳性扩增曲线，fam无扩增信号，其检测灵敏度可达10拷贝/μl；若待检样品中不含有裂谷热病毒核苷酸则无扩增信号。

进一步本发明也已经委托美国保存有裂谷热缺失型和非缺失型病毒样品的实验室提取样品核酸，利用本发明方法建立的双重荧光定量rt-pcr进行检测，验证了本方法可有效区分鉴别缺失型和非缺失型裂谷热病毒样品，而不含病毒核酸的样品均无扩增信号。

实施例2特异性检测

利用上述实施例建立的方法对裂谷热病毒阳性质粒和其他病原核酸包括小反刍兽疫病毒(pprvnigeria75/1疫苗株，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)、山羊副流感病毒3型(js2013株，李文良等，山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定.畜牧兽医学报，2015，46(2)：344-348)、蓝舌病病毒(75-1株，李文良等，血清15与21型蓝舌病病毒的分离与鉴定.西南农业学报，2018，31(3)：630-634)、山羊疱疹病毒i型(jsha1405株，郝飞等，山羊疱疹病毒i型的分离鉴定.畜牧兽医学报，2018,49(8)：1797-1802)、绵羊肺炎支原体(y98株，购自中国兽医药品监察所)进行检测，验证方法能否在准确鉴定出裂谷热病毒的同时不对阴性样品产生非特异反应。

结果如图4所示，双重荧光定量rt-pcr方法在裂谷热病毒阳性质粒存在的情况下，显示fam和joe阳性扩增曲线，而对其他病原核酸的检测双荧光均为阴性；表明本方法可以特异性鉴别裂谷热病毒感染。

实施例3灵敏度的测定

将两种阳性质粒标准品分别从1×10⁸拷贝/μl梯度稀释至1×10¹拷贝/μl，然后按实施例所述的扩增体系和条件进行检测，测定本发明方法的最低检出极限。

结果如图5所示，a图为nss基因标准品敏感性扩增曲线，b图为l基因标准品敏感性扩增曲线。从中可以看出，在最优反应条件下，本发明方法对10拷贝/μl以上模板量的扩增均能出现典型的扩增曲线。

实施例4临床样品的检测

用基因组dna/rna提取试剂盒提取现有临床样品中病原核酸，并以其为模板，分别对样品进行双重荧光定量rt-pcr，结果如图6所示：双重荧光定量rt-pcr方法在裂谷热病毒阳性模板存在的情况下，显示fam和joe阳性扩增曲线，而对其他临床样品核酸的检测双荧光均为阴性，表明临床样品中不存在裂谷热病毒核酸。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>检测裂谷热病毒感染的双重荧光定量rt-pcr引物及探针

<141>2019-07-19

<160>45

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgacatacaaggagcatctgaaa23

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gccaaaggtgaaatcgtgaac21

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aggctcaactttgctaccctccat24

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aggatgatagtgaccgaggct21

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aatgagggctgagtttggaa20

<210>6

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cctcagagggattgacctgtgcctgttgcca31

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tcagccctcattgctcttatg21

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

catctgggattggaggaacaa21

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tgcgctcatcacttcctagcatga24

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

tctttctcatgcaccatcgtc21

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ctgaaaaggctttgctggtg20

<210>12

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

tcggacttggagactttgcatcaaac26

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

caggcagcaagagaggacat20

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

aacatctgggattggaggaac21

<210>15

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

taatgctgtagttccaaactcagccctc28

<210>16

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

ttgcagagtggtcgtcgtg19

<210>17

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

ctttgctggtggaggtgca19

<210>18

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

cgtcctagtcacgaggttcgcttgcga27

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

gttgggccctgttgtgtctt20

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

ggttctccaagaggccagga20

<210>22

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

acgttgcacctccaccagcaaagcc25

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

agggattgacctgtgcctgt20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

cagcatcaggctctcctcca20

<210>24

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

tgctgcctgcaggagccgaacac23

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

cgatccagtttgctgctcaa20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

ctacgggcatcaaacccttg20

<210>27

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

agcaaactctcggacccactgttca25

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>28

atccttcccgggatgagttg20

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>29

aagccactcactcaagacga20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>30

cgagttgctgccgccctggc20

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>31

ggtggacccttctctaccag20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>32

ggtggacccttctctaccag20

<210>33

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>33

tgtatctgctgcagttctcccggg24

<210>34

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>34

aacagtgggtccgagagtt19

<210>35

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>35

cttggcatccttctcccagt20

<210>36

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>36

accctacgggcatcaaacccttga24

<210>37

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>37

ggggagatgaaagaggtg18

<210>38

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>38

aggcgctaacaacataaag19

<210>39

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>39

ccaggctgccatgactaaactcgctaag28

<210>40

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>40

acaaggagcatctgaaataggc22

<210>41

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>41

gccaaaggtgaaatcgtgaac21

<210>42

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>42

cctccatgtcgatagatgtggaag24

<210>43

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>43

gccaatcaagcattatgactgtac24

<210>44

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>44

gagggtagcaaagttgagccta22

<210>45

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>45

cactcccaacatttgatgtctccaagat28