一株樟子松根际具疣篮状菌SBS-ZGTP02及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株樟子松根际具疣篮状菌SBS-ZGTP02及其应用。

背景技术：

磷是植物生长必须的三大营养元素之一，自然条件下植物可利用的有效磷只占总磷含量的很小一部分。解磷微生物是指土壤中能将难溶磷转化成为植物能够吸收利用的可溶性磷，从而提高植物对根际磷的吸收效率，促进植物生长，提高其抗逆性。溶磷微生物包括细菌、真菌和放线菌，由于细菌和放线菌在继代培养中存在解磷效率退化的现象，而解磷真菌相对稳定，制备菌剂使用后，对自然条件下的根际适应性较强，因此具有更高的开发利用价值。樟子松是我国北方主要造林树种，具有抗逆性强，生长迅速的特点，在生态修复，园林绿化，防风固沙等方面具有重要的作用，目前樟子松苗木生产中存在农药使用过多导致病原菌产生抗药性、土壤微生态结构破坏，环境污染、苗木长势不好的问题，而益生菌的使用可在促进苗木生长、提高苗木抗病性、改善根际微生态环境方面发挥重要作用，解磷真菌属于植物益生菌，而现有技术中并未有关于适应于樟子松根际的解磷真菌的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株樟子松根际具疣篮状菌SBS-ZGTP02及其应用，本发明提供的樟子松根际具疣篮状菌可提高难溶性磷酸盐的溶解，促进樟子松苗木的生长，改善樟子松根际土壤和理化性状，并提高樟子松根际土壤中的酶活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一株樟子松根际具疣篮状菌SBS-ZGTP02，拉丁文为Talaromyces verruculosus，保藏编号为CGMCC No.17768。

本发明还提供了上述技术方案所述的樟子松根际具疣篮状菌在提高难溶性磷酸盐溶解中的应用。

优选的，所述难溶性磷酸盐包括磷酸钙、磷酸铝和磷酸铁中的一种或几种。

本发明还提供了上述技术方案所述的樟子松根际具疣篮状菌在促进樟子松苗木生长中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的樟子松根际具疣篮状菌在改善樟子松根际土壤的理化性状中的应用。

优选的，所述理化性状包括土壤有机质、全氮、速效氮、全磷、速效磷、全钾和速效钾。

本发明还提供了上述技术方案所述的樟子松根际具疣篮状菌在提高樟子松根据土壤中酶活性中的应用。

优选的，所述酶包括蔗糖酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和脲酶中的一种或几种。

本发明提供了一株樟子松根际具疣篮状菌SBS-ZGTP02及其应用，拉丁文为Talaromyces verruculosus，保藏编号为CGMCC No.17768。本发明提供的樟子松根际具疣篮状菌提高难溶性磷酸盐的溶解，促进樟子松苗木的生长，改善樟子松根际土壤和理化性状，并提高樟子松根际土壤中的酶活性。

生物保藏证明

具疣篮状菌SBS-ZGTP02，拉丁文为Talaromyces verruculosus，于2019年06月03日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17768。

附图说明

图1为具疣篮状菌SBS-ZGTP02在NBRIP培养基上解磷作用，其中从左往右依次为1)在覆盖赛璐玢膜的NBRIP培养基上解磷作用；2)去掉赛璐玢膜后NBRIP培养基上的透明圈；3)具疣篮状菌SBS-ZGTP02直接在NBRIP培养基上形成的透明圈；

图2为具疣篮状菌SBS-ZGTP02对樟子松苗木的促生作用，其中从左往右的苗木处理依次为：1)SBS-ZGTP02固体菌剂；2)棉籽壳对照3)空白对照。

具体实施方式

本发明提供了一株樟子松根际具疣篮状菌SBS-ZGTP02，拉丁文为Talaromyces verruculosus，保藏编号为CGMCC No.17768。在本发明中，所述樟子松根际具疣篮状菌提高难溶性磷酸盐的溶解，促进樟子松苗木的生长，改善樟子松根际土壤和理化性状，并提高樟子松根际土壤中的酶活性。

本发明还提供了上述技术方案所述的樟子松根际具疣篮状菌在提高难溶性磷酸盐溶解中的应用。在本发明中，所述难溶性磷酸盐包括磷酸钙、磷酸铝和磷酸铁中的一种或几种。

本发明还提供了上述技术方案所述的樟子松根际具疣篮状菌在促进樟子松苗木生长中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：将所述樟子松根际具疣篮状菌制成固体菌剂后，施加到樟子松根际土壤中。本发明对所述固体菌剂的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可，所述固体菌剂中具疣篮状菌的活孢子含量在4.0×10⁸个/g以上。

本发明还提供了上述技术方案所述的樟子松根际具疣篮状菌在改善樟子松根际土壤的理化性状中的应用。在本发明中，所述理化性状优选包括土壤有机质、全氮、速效氮、全磷、速效磷、全钾和速效钾，所述樟子松根际具疣篮状菌能够提高土壤有机质、全氮、速效氮、全磷、速效磷、全钾和速效钾在樟子松根际土壤中的含量。在本发明中，所述应用优选包括：将所述樟子松根际具疣篮状菌制成固体菌剂后，施加到樟子松根际土壤中。本发明对所述固体菌剂的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可，所述固体菌剂中樟子松根际具疣篮状菌的活孢子含量在4.0×10⁸个/g以上。

本发明还提供了上述技术方案所述的樟子松根际具疣篮状菌在提高樟子松根据土壤中酶活性中的应用。在本发明中，所述酶优选包括蔗糖酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和脲酶中的一种或几种。在本发明中，所述应用优选包括：将所述樟子松根际具疣篮状菌制成固体菌剂后，施加到樟子松根际土壤中。本发明对所述固体菌剂的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可，所述固体菌剂中樟子松根际具疣篮状菌的活孢子含量在4.0×10⁸个/g以上。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实例中，

PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，蒸馏水1000mL。

解磷培养基(NBRIP)的配方为：葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，MgCl2.6H2O 5g，KCl 0.2g，MgSO4.7H2O 0.25g，(NH4)2SO40.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

解磷培养基A的配方为：用磷酸铝(AlPO4)代替NBRIP中的Ca3(PO4)2，其他成分和含量相同。

解磷培养基B的配方为：用磷酸铁(FePO4·4H2O)代替NBRIP中的Ca3(PO4)2，其他成分和含量相同。

棉籽壳固体培养基：棉籽壳1000g，葡萄糖20g，硫酸镁2.5g，磷酸二氢钾7.5g，石灰粉5g，加水至湿度60％。

实施例1

具疣篮状菌(Talaromyces verruculosus)SBS-ZGTP02的解磷

1)固体平板条件菌株的解磷圈

将具疣篮状菌(Talaromyces verruculosus)SBS-ZGTP02接种到NBRIP平板上，25℃培养，7d后，观察是否有透明圈，测定菌落(D)和透明圈(d)的直径，并计算透明圈直径与菌落直径的比值(d/D)，可以初步的估计解磷真菌的解磷能力。比值越大，说明真菌的解磷能力越强。按上述方法测定具疣篮状菌的d/D的值，结果测得比值为1.55，说明具疣篮状菌菌株具有很强的解磷能力。结果见图1。

2)液体发酵条件菌株对难溶性无机磷酸盐的解磷

将具疣篮状菌(Talaromyces verruculosus)SBS-ZGTP02菌株接种到PDA平板上，25℃培养7d后，用灭菌的打孔器在平板取菌块(直径10mm)分别接种到装有100mLNBRIP液体培养基及解磷液体培养基A、B的250mL的三角瓶中，分别以相同体积未接菌的解磷培养基为对照(CK)，每瓶接种3个菌块，每个待测菌株设三个重复，25℃，150rpm振荡培养，7d后，将发酵液离心10min(4℃，10000r·min^-1)；采用磷钼蓝分光光度法，即取上述离心得到的上清液100μL加入50mL的容量瓶中，然后加入约25mL的去离子水后，再加1-2滴2,4-二硝基酚指示剂，再加5mL钼锑抗显色剂，再加去离子水定容，混匀，静置0.5h之后，测定OD值。并计算上清液中的有效磷含量和解磷率。

解磷率(％)＝(接菌可溶性磷含量－对照可溶性磷含量)/加入磷酸盐的量×100。结果见表1。

表1菌株SBS-ZGTP02对难溶性磷酸盐磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝溶解能力

从表1可以得出，分别以难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁为唯一磷源，培养7d后，发酵液中可溶磷含量均高于对照，但对各磷源的溶解效果明显不同，其中对磷酸三钙的溶解效果较好，对磷酸铁和磷酸铝的溶解效果稍弱。

3)培养条件对菌株SBS-ZGTP02解磷效果影响

通过测定不同碳源、氮源、温度和pH值条件下菌株SBS-ZGTP02的解磷效果(表2)，以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源，发酵培养基pH值为7.0，在25℃条件下，解磷效果最好，使用优化后的培养基配方进行解磷，解磷值达到697.15mg/L。

表2不同培养条件对菌株SBS-ZGTP02解磷效果的影响

实施例2

具疣篮状菌(Talaromyces verruculosus)SBS-ZGTP02对樟子松苗的促生

固体菌剂制备：将菌株SBS-ZGTP02在PDA培养基上活化5d后，用无菌打孔器(直径10mm)去2片菌饼接种于盛有250mLPD液体培养基的三角瓶(500mL)中，置于摇床上(25℃、150r/min)振荡培养7d后，将培养好的液体菌种接种到棉籽壳固体培养基上，25℃黑暗条件下静置培养15d，待菌丝长满后，取出培养基，制备成固体菌剂备用，菌剂孢子含量为4.0×10⁸个孢子/g菌剂。

接种共三个处理：1)具疣篮状菌SBS-ZGTP02固体菌剂；2)棉籽壳固体培养基空白对照；3)无菌水空白对照。

樟子松催芽完成后，先处理培养基质，将解磷真菌固体菌剂和棉籽壳固体培养基分别与无菌培养基质(草炭土：蛭石：细沙＝2:1:1)按照体积比1:10的比例添加到营养钵中后，进行樟子松播种。

将经催芽的樟子松种子播入营养钵中，每钵30颗种子，上覆2cm厚无菌土，浇透水后放入大棚中培养，待幼苗出土后，定苗至每钵15株。进行常规的日常管护，每2d浇一次水(100ml/钵)，每周浇一次Hoagland营养液(100ml/钵)。

出苗90d后，每处理随机挖取30株樟子松苗木，测定苗木生长指标，采用直尺和游标卡尺分别测量苗高和地径。苗木取样后，用刷子小心清理掉根际泥土，用电子天平测定苗木鲜重后，在鼓风干燥箱中85℃烘干后称量苗木的干重。结果见表3和图2。

表3解磷真菌SBS-ZGTP02对樟子松苗的促生

实施例3

具疣篮状菌(Talaromyces verruculosus)SBS-ZGTP02对樟子松苗根际土壤理化性状改良

实施例2中的樟子松苗出苗90d后，每一处理随机采集70株樟子松苗轻轻抖动根际将根际土样收集与无菌样品袋中，用2mm筛子过筛后放入装有冰袋的保温箱中带回实验室，自然风干后4℃冰箱保存。土壤有机质的测定用重铬酸钾外加热法，全氮的测定采用凯氏定氮仪测定，全磷采用钼锑抗比色法测定，速效磷采用双酸侵提钼锑抗比色法，速效钾采用NH4OAc侵提火焰光度计法，全钾采用火焰光度计法测定，土壤pH用酸度计法。土壤蔗糖酶活性、过氧化氢酶活性、酸性磷酸酶活性、脲酶活性使用南京建成试剂盒测定。结果见表4。

表4解磷真菌SBS-ZGTP02对樟子松苗根际土壤理化性状改良

由表4结果可知，解磷真菌SBS-ZGTP02对樟子松苗根际土壤理化性状具有改良作用，不同处理之间存在显著性差异(P<0.05)，同空白对照相比，添加解磷真菌固体菌剂的樟子松根际土壤有机质、全氮、速效氮、全磷、速效磷、全钾、速效钾分别提高24.49％、18.53％、16.81％、11.32％、77.98％、4.67％和43.33％。其中速效磷提高最多，达到了77.98％，证明解磷真菌的加入有效改善了樟子松根际土壤理化性状，促进樟子松苗木的生长。

同空白对照相比，接种解磷真菌SBS-ZGTP02固体菌剂后，樟子松根际土壤酶包括蔗糖酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和脲酶活性分别提高：132.67％、9.81％、119.44％和34.19％。解磷真菌菌剂的使用对根际土壤的活性酶和养分循环起到了显著的促进作用。

由以上实施例可以得出，本发明提供的疣篮状菌提高难溶性磷酸盐的溶解，促进樟子松苗木的生长，改善樟子松根际土壤和理化性状，并提高樟子松根际土壤中的酶活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。