一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和应用的制作方法

本发明属于分子生物技术领域，具体而言，涉及一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因、重组载体、转化体和应用。

背景技术：

几丁质(甲壳素)是由n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚物,是最丰富的天然高分子化合物之一。几丁质经几丁质酶水解后的产物几丁二糖，在医药保健等领域具有很高的应用价值。根据几丁质酶作用时的切割位点不同,可将几丁质酶分为内切几丁质酶和外切几丁质酶两大类。内切几丁质酶在几丁质链内部随机切割，产生分子量更小的几丁寡糖；外切几丁质酶催化底物水解时从几丁质链的还原末端或非还原末端释放(glcnac)2，以及可以分解内切几丁质酶产生的低聚物为单体的β-n-乙酰氨葡萄糖苷酶。

由于天然甲壳素在一般溶剂中或中性条件下不可溶解，大大降低了其水解效率，因此需要经过繁琐的步骤制备成胶体几丁质才能被酶水解。另外，在酸性条件下几丁质的溶解性显著增加，从而可提高几丁质酶的水解效率，因此酸性几丁质酶(amcase)在几丁质的水解上表现出明显的优势。然而，目前虽然有研究报道酸性几丁质酶在大肠杆菌宿主中进行异源表达，但是存在表达量比较低，以及活性低的问题，使其在工业应用方面存在明显的弊端。

通过检索国内外现有技术，尚未发现酸性哺乳动物几丁质酶在宿主中大量表达的方法应用。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明的第一个目的在于通过优化现有的哺乳动物几丁质酶基因序列，从而提供一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和重组载体、转化体以及遗传工程化的宿主细胞。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：

一种酸性哺乳动物几丁质酶的编码基因，该基因经过碱基优化后具有seqidno.2所示的核苷酸序列。另外，该基因编码具有seqno.1所示的氨基酸序列的蛋白质。

一种重组载体，该重组载体包含上述几丁质酶的编码基因，所述编码基因的拷贝数为4。

进一步优选出多组重组载体，所述重组载体是在phbm905m载体的cpoi和noti位点插入所述酸性哺乳动物几丁质酶的编码基因而得，进而通过串联表达框，得到含有4拷贝的重组载体。

本发明还提供两种转化体，转化体可以为重组菌，其包含上述重组载体。例如，将酸性哺乳动物几丁质酶基因插入载体phbm905m的cpoi和noti位点得到的重组表达载体，及含有基因多拷贝表达框的重组表达载体转化至毕赤酵母gs115得到重组菌。另外一种转化体为以酸性哺乳动物几丁质酶4拷贝gs115重组菌，再次转入辅助因子(hac1、pdi1和mrx1)进行共表达的新型重组菌。

本发明还提供多对引物，用于扩增上述的酸性哺乳动物几丁质酶编码基因全长及共表达所需的各种辅助因子。

一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述的重组载体。进一步优选地，所述遗传工程化的宿主细胞除含有几丁质酶4拷贝的重组载体外，还包含插入辅助因子hac1基因序列的重组载体。所述重组载体为载体pgapzb的ecori和agei位点插入目标基因得到的重组表达载体。

哺乳动物几丁质酶首次在小鼠体内发现，属于真核细胞来源的基因。而本发明人选用的毕赤酵母gs115存在真核基因具有的翻译后修饰特点，且能够进行分泌表达和高密度发酵，满足工业化应用的条件。因此，我们选择毕赤酵母gs115作为出发菌株进行酸性哺乳动物几丁质酶的表达。

最后，本发明还提供了上述编码基因编码的酸性哺乳动物几丁质酶在水解甲壳素或/和胶体几丁质中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下几点的进步性：

(1)利用体外构建无抗生素筛选标记的多拷贝的方法，实现了酸性哺乳动物几丁质酶的高量表达，但拷贝数与表达量并不是成正比；

(2)不同辅助因子的共表达，实现了酸性哺乳动物几丁质酶表达量的进一步提高，其中hac1促进作用最强；

(3)本发明的酸性哺乳动物几丁质酶表达量和活性均为目前报道最高。

附图说明

图1为酸性哺乳动物几丁质酶多拷贝质粒构建验证dna电泳图，其中泳道1/2/3/4//6分别为酸性哺乳动物几丁质酶1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝、6拷贝质粒。

图2为酸性哺乳动物几丁质酶多拷贝构建质粒酶切验证dna电泳图，其中泳道1/2/3分别为1拷贝、2拷贝、3拷贝sali线性化结果，泳道4/5/6分别为3拷贝、4拷贝、6拷贝用xbai和bamhi双酶切。

图3为酸性哺乳动物几丁质酶1,2,3,4,6拷贝菌株表达的sds-page检测图。

图4为辅助因子和酸性哺乳动物几丁质酶共表达sds-page检测图。

图5为hac1共表达的酸性哺乳动物几丁质酶直接水解甲壳素(a)和胶体几丁质(b)0-6h的hplc检测图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、酸性哺乳动物几丁质酶基因序列密码子优化

将来源于小鼠胃组织的哺乳动物几丁质酶的基因序列进行一定程度的密码子优化：a、减少连续的a/t/g/c碱基出现几率，避免产生茎环结构；b、在整个基因序列中，增加一些稀有密码子，特别是翻译起始阶段，来降低核糖体的延伸速率。优化后的酸性哺乳动物几丁质酶基因序列如seqidno.2所示，整个序列和原始序列相比优化率达23.4％。

实施例2、表达载体的构建及蛋白质表达

1、基因序列的人工合成

seqidno.2所示的核苷酸序列委托武汉金开瑞生物工程有限公司按照本领域的常规技术进行基因人工合成，基因插入质粒载体puc57中，保存，备用。

2、基因序列的扩增

根据seqidno.2所示的核苷酸序列设计引物对(dchit-f，dchit-r)

正向引物的下划线部分为cpoi的酶切位点，反向引物的下划线部分为noti酶切位点，此位点的序列设计符合t4dna聚合酶作削的方法所产生的粘性末端。

pcr反应体系：

pcr反应条件：95℃预变性5min，95℃变性5s，55℃退火5s，72℃延伸10s，30轮循环扩增，最后72℃终延伸10min。

用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，并用dna纯化试剂盒(genemark公司生产)纯化。

3、重组表达载体的构建

1)将上述纯化的pcr产物用t4dna聚合酶作削的方法处理，然后进行溶液回收产物。将质粒phbm905m用cpoi和noti双酶切，1％琼脂糖电泳回收酶切产物。

2)将步骤1)中的pcr溶液回收产物和载体的双酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌gold后涂布于含有100μg/ml氨苄抗生素的lb平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用引物dchit-f和dchit-r进行菌落pcr，筛选到含有酸性哺乳动物几丁质酶基因的重组菌，抽提重组菌的质粒并进行双酶切验证，进一步通过测序验证。结果表明，在phbm905m的cpoi和noti酶切位点之间插入了酸性哺乳动物几丁质酶基因的dna片段,将该重组质粒命名为pamc1c(phbm905m-dchit-1copy)。

4、酸性哺乳动物几丁质酶多拷贝质粒的构建

重组载体phbm905m-dchit表达框的5’端含有xbai酶切位点，3’端含有spei和bamhi酶切位点。因xbai和spei为同尾酶，故利用xbai/bamhi两种酶双酶切得到表达框，spei/bamhi两种酶双酶切得到线性化的载体，再把酶切回收得到的片段和载体通过t4dna连接酶连接就可以得到我们所需的酸性哺乳动物几丁质酶2拷贝质粒，命名为pamc2c(phbm905m-dchit-2copy)。如此类推，，我们可以得到3拷贝，4拷贝，6拷贝重组质粒。分别命名为pamc3c，pamc4c，pamc6c。

构建成功的多拷贝质粒，其分子量大小会呈现一个梯度变化，随着拷贝数增加，分子量也会增强，如图1所示。同时，在phbm905m上有2个sali的酶切位点，通过酶切1拷贝，2拷贝，3拷贝后，得到一组梯度增加的线性化片段，同时用xbai和bamhi双酶切处理3拷贝，4拷贝，6拷贝质粒，切割下来的表达框条带会根据表达框的大小呈倍数关系，如图2所示。

5、工程菌的制备

将构建好的酸性几丁质酶的1c、2c、3c、4c、6c质粒分别用sali线性化酶切后，溶液回收酶切产物。然后在1.5kv的条件下电转化gs115感受态后涂布组氨酸缺陷型md平板，28℃培养2天。再将md平板上的菌转接到ypd平板上。然后进行一次酵母菌落pcr，缩小筛选范围。

接种适量上述筛选得到的正确转化子的单菌落于50mlbmgy培养基中培养36h左右，使其od600接近15左右，再将bmgy培养基通过低温离心换成25mlbmmy培养基，并每隔24h加入250μl甲醇进行诱导表达，使其终浓度为1％。每隔24h取样并加入等量的甲醇，所取培养液于10000rpm、4℃条件下离心5min左右收集上清，于4℃冰箱中储存。

分别取不同天数的发酵上清20ul加上5ul的loadingbuffer在100℃加热10min后，sds-page检测，如图3所示。

实施例3、辅助因子基因及相关载体的构建

1、辅助因子基因扩增

通过网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，查找毕赤酵母gs115来源的mxr1、hac1和pdi1基因序列并设计引物进行基因扩增(引物列表)，这些基因分别构建在pgapzb载体的ecori和agei酶切位点之间。

pcr反应体系：

pcr反应条件：95℃预变性5min，95℃变性5s，55℃退火5s，72℃延伸10s，30轮循环扩增，最后72℃终延伸10min。

用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，并用dna纯化试剂盒(genemark公司生产)纯化。

2、重组表达载体的构建

1)将质粒pgapzb用ecori和agei双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2)将回收纯化的dna片段mxr1,hac1,pdi1和步骤1的酶切产物用t5外切酶的方法进行转化大肠杆菌gold后，涂布于含有25μg/mlzeocin的低盐lb平板，37℃过夜培养，将得到的转化子分别用上述的正向引物和反向引物进行菌落pcr，筛选到含有辅助因子基因的重组菌，提取重组菌的质粒，进行测序验证。结果表明，在pgapzb载体的ecori和agei酶切位点之间分别插入了hac1,pdi1,mxr1辅助因子片段，插入方向正确，将重组质粒分别命名为pgapzb-mxr1、pgapzb-hac1、pgapzb-pdi1。

实施例4、辅助因子和4拷贝酸性哺乳动物几丁质酶共表达重组菌株

将质粒pgapzb-mxr1、pgapzb-hac1、pgapzb-pdi1分别用avrii线性化酶切后，溶液回收酶切产物。然后在1.5kv的条件下电转化酸性哺乳动物几丁质酶4拷贝基因的gs115感受态后，涂布含有100μg/mlzeocin的ypd平板，28℃培养2天。再将ypd(zeocin)平板上的菌转接到ypd平板上，并做好标记。然后进行一次酵母菌落pcr，缩小筛选范围。将筛选到的菌取适量进行摇瓶甲醇诱导表达。后续的酸性哺乳动物几丁质酶表达步骤按照实施例2中的第5点进行甲醇诱导表达。

结果如图4显示：4c为酸性哺乳动物几丁质酶4拷贝对照，hac1/mxr1/pdi1分别为在酸性哺乳动物几丁质酶4拷贝菌株的基础上，过表达hac1,mxr1,pdi1时酸性哺乳动物几丁质酶的表达情况。在过表达的三个辅助因子中，且hac1的促进效果最好。过表达hac1的酸性哺乳动物几丁质酶4拷贝菌株，针对胶体几丁质的水解活性达到了0.95u/ml，相对于1拷贝酸性哺乳动物几丁质酶表达菌株，表达活性也提高了3.5倍。

实施例5、辅助因子hac1共表达的酸性哺乳动物几丁质酶对甲壳素和胶体几丁质的水解

取100μl共表达的酸性哺乳动物几丁质酶amcase(0.95u/ml)和900μl5.0％(w/v)胶体几丁质于ph2.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中,55℃条件下分别温浴30min,1h,2h,3h,6h后沸水浴煮沸10min,终止反应；对照组为amcase与胶体几丁质混匀后即刻煮沸失活。另外，取1ml共表达的酸性哺乳动物几丁质酶amcase(0.95u/ml)和9ml1.0％(w/v)甲壳素于ph2.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中,55℃条件下分别温浴30min,1h,2h,3h,6h后沸水浴煮沸10min,终止反应；对照组为amcase与几丁质混匀后即刻煮沸失活，随后hplc进行产物分析，并通过标准曲线进行定量。

结果如图5所示，重组amcase在3h内直接水解甲壳素为(glcnac)2，结果显示水解效率很低，仅有4.3％(图5a)，但以可溶性更好的胶体几丁质作为底物时，水解率可达59％(图5b)。

序列表

<110>湖北大学

<120>一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>452

<212>prt

<213>小鼠(mouse)

<400>1

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151015

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<213>人工序列(artificialsequence)

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