本发明涉及葛仙米的培植
技术领域：
，具体为一种富有机硒葛仙米的培养方法。
背景技术：
：葛仙米是念珠藻属(NostocVauch)中球状念珠藻(NostocsphaeoidesKützing)的俗称，它属于蓝藻门(Cyanophyta)，蓝藻纲(Cyanophyceae)，念珠藻目(Nostocales)，念珠藻科(Nostocaceae)。葛仙米又称绿色燕窝，弥足珍贵，是食药两用的佳品。其干物质总蛋白含量为28.38％～52％，总糖为24.19％。含18种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸；富含VC、VE和B族维生素，及多种矿质元素，特别是含钙量高的食用藻类。葛仙米中的蛋白质含量高，组成蛋白质的氨基酸种类丰富，为富硒培养提供了物质基础，葛仙米是一种生产植物活性硒的极佳藻类植物。硒是一种动物体必需的营养元素，硒在人体内无法合成，所以要满足人体对硒的需求，就需要每天补充硒。按世界卫生组织要求，人体膳食中每日最低需求量为50微克硒，而营养补充在50～250微克硒为宜。WST578.3～2017摄入量，中国居民膳食营养素参考摄入量第3部分：微量元素中，针对不同年龄及生理状态，规定了推荐每日的硒摄入量。科学考察表明，硒还可以与其他的一些重金属元素有拮抗作用，所以食用富硒食品既可以增强体质，达到预防疾病的目的，还可以预防人体重金属元素中毒。硒在自然界的存在方式分为两种：无机硒和植物活性硒。无机硒一般指亚硒酸钠和硒酸钠，从金属矿藏的副产品中获得；无机硒有较大的毒性，且不易被吸收，不适合人和动物使用。植物活性硒是硒通过生物转化与氨基酸结合而成，一般以硒蛋氨酸的形式存在。目前，得到公认得是植物活性硒是人类和动物允许使用的硒源。现有专利号：CN201811410255和专利号：CN201811414608的专利，公开了富硒葛仙米培养技术中，所采用硒源为亚硒酸钠，2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，硒及硒化合物在3类致癌物清单中，葛仙米作为藻类，富集能力强。可见现有技术培养的富硒葛仙米的硒应是同时存在硒化合物和植物活性硒。因此，葛仙米吸收而未转化的残留在藻体内的无机硒会直接引起以食用富硒葛仙米补硒时的安全性。为了降低以上食用富硒葛仙米补硒时的安全风险问题，本发明以食用真菌转化的硒代蛋氨酸为培养富硒葛仙米的硒源，而非直接添加无机硒(亚硒酸钠或硒酸钠)，极大地降低了葛仙米中硒的毒性。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种富有机硒葛仙米的培养方法，解决上述
背景技术：
中提出直接采用无机硒培养富硒葛仙米而存在以食用富硒葛仙米补硒时的安全性问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种富有机硒葛仙米的培养方法，具体步骤如下：步骤1)利用富硒固体培养基将蛹虫草菌种培养成富硒蛹虫草子实体；所述富硒固体培养基包括以下重量组分的原料：富硒蛋白草20～25份、葡萄糖2～4份，红糖1～2份，水溶性淀粉5～8份，复合氨基酸1～2份，小球藻粉1～2份，蚯蚓粉1～2份，葛仙米破损藻体10～20份，小麦20～30份，食盐0.001～0.005份，pp塑料粒10～20份，土壤浸出液20～30份，水100～200份；所述培养条件包括：暗培和光培养，暗培温度18～20℃，周期3～4天，光培养的光暗比为6h:18h，光强为500～1000lux，温度19～23℃，培养50～60天；步骤2)酶解采用胶体磨将所述富硒蛹虫草子实体磨成的菌浆，获得富含硒代氨基酸的富硒原液；步骤3)利用富硒液体培养基将对数生长期的葛仙米驯化培养成适应富硒培养的葛仙米藻体；所述驯化培养用的富硒液体培养基包括以下重量组份的原料：富硒原液30～50份、硫酸镁0.05～1份、硝酸钙0.1～0.2份、甘油磷酸钠0.01～0.03份、硫酸亚铁0.01～0.025份，氯化钾0.02～0.05份、氯化钠0.02～0.05份、水1000～2000份；所述驯化培养条件包括：光照光强10000～15000lux，温度20～30℃，通气培养周期20～30天；步骤4)诱导培养适应富硒培养的葛仙米藻体，获得富有机硒的葛仙米；所述诱导培养所用富硒液体培养基包括以下重量组分的原料：富硒原液30～50份、尿素0.05～0.08份，硫酸镁0.5～1份、硝酸钙0.1～0.2份、甘油磷酸钠0.01～0.03份、硫酸亚铁0.01～0.025份，氯化钾0.02～0.05份、氯化钠0.02～0.05份、水1000～2000份；所述诱导培养条件包括：波长为620～645nm单色光，光照强度5000～6000lux，温度20～25℃，通气培养周期30～40天。上述培养方法步骤1)具体包括如下步骤：1)配制包括以下重量组分的原料富硒固体培养基：富硒蛋白草20～25份、葡萄糖2～4份，红糖1～2份，水溶性淀粉5～8份，复合氨基酸1～2份，小球藻粉1～2份，蚯蚓粉1～2份，葛仙米破损藻体10～20份，小麦20～30份，食盐0.001～0.005份，pp塑料粒10～20份，土壤浸出液20～30份，水100～200份。2)灭菌富硒固体培养基：将固体培养基于121℃灭菌30min冷却至常温。3)接种与培养：蛹虫草菌种接于富硒固体培养基上，在温度18～20℃下暗培3～4天，转为在光暗比为6h:18h，光强500～1000lux，温度19～23℃下光培50～60天。4)采收：采收离培养基0.5～1cm以上的蛹虫草子实体，即得富硒蛹虫草子实体。上述培养方法步骤2)具体包括如下步骤：1)磨浆：采用胶体磨将步骤1)所述富硒蛹虫草子实体，按料液比15-30g/L磨成菌浆。2)酶解：将菌浆转移至发酵罐中，加2000～5000U/g的木瓜蛋白酶，调节pH＝6～7，温度设为55～65℃，通气搅拌水解3～6h。3)灭酶：将发酵罐温度设置为100～121℃，处理15～30min，将未反应的木瓜蛋白酶灭活而获得酶解液。4)吸附：在酶解液中加粒径2～3mm的活性炭10～20g/L，吸附游离硒及脱色3～5h。5)离心：吸附后的酶解液经6000～8000r/min离心10～15min，取上清液获得富含硒代氨基酸的富硒原液。上述的培养方法步骤3)具体包括如下步骤：1)配制包括以下重量组分原料的驯化富硒液体培养基：富硒原液30～50份、硫酸镁0.5～1份、硝酸钙0.1～0.2份、甘油磷酸钠0.01～0.03份、硫酸亚铁0.01～0.025份，氯化钾0.02～0.05份、氯化钠0.02～0.05份、水1000～2000份。2)驯化培养：按10～15g/L接种量，接对数生长期的葛仙米藻体，在光强为10000～15000lux，20～30℃的条件下，通气驯化培养20～30天，获得适应富硒培养的葛仙米藻体。上述的培养方法步骤4)具体包括如下步骤：1)配制包括以下重量组份原料的诱导富硒液体培养基：富硒原液30～50份、尿素0.05～0.08份，硫酸镁0.05～1份、硝酸钙0.1～0.2份、甘油磷酸钠0.01～0.03份、硫酸亚铁0.01～0.025份，氯化钾0.02～0.05份、氯化钠0.02～0.05份、水1000～2000份。2)光诱培养：按10～15g/L的接种量，将步骤3)中所述适应富硒培养的葛仙米藻体接于富硒诱导培养基中，置于波长为620～645nm单色光下，光强5000～6000lux、温度20～25℃下，通气培养30～40天。3)采收干燥：采收葛仙米，用清水反复洗净，在50℃的烘箱中烘干，即得富有机硒葛仙米干品。上述培养方法步骤1)中，优选地，富硒固体培养基包括以下重量组份的原料：富硒蛋白草24份、葡萄糖3份，红糖1.5份，水溶性淀粉6，复合氨基酸1.8份，小球藻粉2份，蚯蚓粉2份，葛仙米破损藻体20份，小麦20份，食盐0.0045份，pp材料12份，土壤浸出液25份，水200份。优选地，所述培养条件包括：暗培温度为19℃，周期为4天，光培的光暗比为6h:18h，光强为800lux，温度为20℃，培养周期为60天。优选地，用于改善富硒固体培养基透气性的pp塑料粒的粒径为3mm；一般地pp塑料粒可用对培养基透气性具有改善效果的材料替换。上述培养方法步骤2)中，优选地，研磨菌浆的料液比为20g/L。优选地，所述酶解所用木瓜蛋白酶的添加量为3000U/g，温度为60℃，水解时长为5h。优选地，所述灭酶温度为105℃，处理时长为20min。优选地，所述的吸附所用活性炭粒为粒径为2.5mm，添加量为15g/L，吸附时长为4h。上述培养方法步骤3)中，优选地，驯化培养所用富硒液体培养基包括以下重量组份的原料：富硒原液45份、硫酸镁0.8份、硝酸钙0.15份、甘油磷酸钠0.025份、硫酸亚铁0.025份，氯化钾0.035份、氯化钠0.03份、水1500份。优选地，驯化培养所接对数生长期的葛仙米球径3mm左右，接种量为12g/L。优选地，驯化培养条件包括光照光强为12000lux，温度为25℃，通气培养周期为25天。上述所述培养方法步骤4)中，优选地，诱导培养所用富硒的液体培养基包括以下重量组份的原料：富硒原液48份、尿素0.8份，硫酸镁0.08份、硝酸钙0.15份、甘油磷酸钠0.025份、硫酸亚铁0.02份，氯化钾0.03份、氯化钠0.03份、水1800份；优选地，诱导培养的光为波长为645nm红光，光强6000lux，温度为22℃，通气培养周期为40天；一般地在富硒液体培养基中增加促进葛仙米蛋白质合成的尿素，可用能促进葛仙米合成蛋白质的原料替代。本发明还包括上述固体培养基或上述液体培养基在富有机硒葛仙米培养方法上的应用。本发明中土壤浸提液可按现有技术方法制备。本发明中所用原料均可从市场中采购而得。本发明中所用蛹虫草菌种为常德炎帝牧源农业发展有限公司菌种库中的菌种。本发明中所用的对数生长期的葛仙米藻体为常德炎帝牧源农业发展有限公司生产的葛仙米藻种。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明利用酶解及活性炭吸附处理经多级生物转化的植物活性硒而获得的硒代氨基酸作为培养富硒葛仙米的硒源，降低用于培养葛仙米的富硒液体培养基中游离硒的含量，不仅为培养富硒葛仙米提供更安全的硒源，还为葛仙米生长提供丰富的营养。通过营养和光质的协同诱导，提高葛仙米对富硒液体培养基中硒代氨基酸的利用率，提高葛仙米中的硒含量而获得富有机硒的葛仙米，利用生物的多级转化作用和酶解提取技术，获得可用葛仙米合成蛋白质的硒代氨基酸，避免直接使用无机硒，有效地提高富硒葛仙米的食用安全性。本发明的优势：1、培养富硒葛仙米的硒源是蛋白草和蛹虫草两次转化的间接硒源；2、培养富硒葛仙米的硒源是从富硒蛹虫草子实体中酶解提取的硒代氨基酸；3、在富硒蛹虫草培养基加入的pp塑料粒，有效改善培养基透气性，防止麦粒之间的黏性，改善基内气体的交换，促进菌丝生长，提高蛹虫草子实体单产；4、尿素和补以645nm红光光质的协同诱导作用，增强葛仙米的光合能力，提高葛仙米对富硒培养基中硒代氨基酸的利用率，促进葛仙米合成蛋白质而提高葛仙米中硒含量而培养得到富硒葛仙米。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：富有机硒葛仙米的培养一种富有机硒葛仙米的培养方法，具体步骤如下：步骤1)利用富硒固体培养基将蛹虫草菌种培养成富硒蛹虫草子实体，具体包括如下步骤：1)配制包括以下重量组分的原料富硒固体培养基：富硒蛋白草24份、葡萄糖3份，红糖1.5份，水溶性淀粉6份，复合氨基酸1.8份，小球藻粉2份，蚯蚓粉2份，葛仙米破损藻体20份，小麦20份，食盐0.0045份，pp塑料粒12份，土壤浸出液25份，水200份。2)灭菌富硒固体培养基：将固体培养基于121℃灭菌30min冷却至常温。3)接种与培养：蛹虫草菌种接于富硒固体培养基上，在温度19℃下暗培4天，转为在光暗比为6h:18h，光强800lux，温度20℃下光培60天。4)采收：采收离培养基0.5cm以上的蛹虫草子实体，即得富硒蛹虫草子实体。步骤2)：酶解采用胶体磨将所述富硒蛹虫草子实体磨成的菌浆，获得富含硒代氨基酸的富硒原液，具体包括如下步骤：1)磨浆：采用胶体磨将步骤1)所述富硒蛹虫草子实体，按料液比15-30g/L磨成菌浆。2)酶解：将菌浆转移至发酵罐中，加3000U/g的木瓜蛋白酶，调节pH＝6～7，温度设为60℃，通气搅拌水解5h。3)灭酶：将发酵罐温度设置为105℃处理20min，将未反应的木瓜蛋白酶灭活而获得酶解液。4)吸附：在酶解液中加粒径2.5mm的活性炭15g/L，吸附游离硒及脱色4.5h。5)离心：吸附后的酶解液经6000r/min离心15min，取上清液获得富含硒代氨基酸的富硒原液。步骤3)：利用富硒原液配制成液体培养基将对数生长期的葛仙米驯化成适应富硒培养的葛仙米藻体，具体包括如下步骤：1)配制包括以下重量组分原料的驯化富硒液体培养基：富硒原液45份、硫酸镁0.8份、硝酸钙0.15份、甘油磷酸钠0.025份、硫酸亚铁0.025份，氯化钾0.035份、氯化钠0.03份、水1500份。2)驯化培养：按12g/L接种量，接对数生长期的葛仙米藻体，在光强为12000lux，25℃的条件下，通气驯化培养25天，获得适应富硒培养的葛仙米藻体。步骤4)：诱导培养适应富硒培养的葛仙米藻体，获得富有机硒的葛仙米，具体包括如下步骤：1)配制包括以下重量组份原料的诱导富硒液体培养基：富硒原液48份、尿素0.08份，硫酸镁0.08份、硝酸钙0.15份、甘油磷酸钠0.025份、硫酸亚铁0.02份，氯化钾0.03份、氯化钠0.03份、水1800份。2)光诱培养：按15g/L的接种量，将步骤3)中所述适应富硒培养的葛仙米藻体接于富硒诱导培养基中，置于波长为645nm单色光下，光强6000lux、温度22℃下，通气培养40天。3)采收干燥：采收葛仙米，用清水反复洗净，在50℃的烘箱中烘干，即得富有机硒葛仙米干品。按实施例1培养而得的富硒葛仙米，经检测，葛仙米富硒效果如下表1：表1富硒葛仙米中的硒含量及硒形态检测结果检测项目检测结果SeCys220.2％MeSeys0.0％Se4+6.7％SeMet73.1％Se6+0.0％SeEt硒代乙硫氨酸0.0％总硒/(mg/kg)2.03上清液总硒/(mg/kg)1.61提取率79.6％观察表检测结果，表明本发明培养的富硒葛仙米中，总硒含量可达2.03mg/kg，与葛仙米中组成蛋白质的Cys、Met结合，比例达93.3％，4价游离硒仅占6.7％，即葛仙米中的硒主要以硒代蛋氨酸的形式存在。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。当前第1页1 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