利用内源性CRISPR系统对乳酸片球菌进行基因编辑的方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种利用内源性crispr系统对乳酸片球菌进行基因编辑的方法，具体是构建编辑质粒、电转化编辑质粒至乳酸片球菌以及利用编辑质粒对乳酸片球菌进行基因编辑的应用方法，特别适用于乳酸菌的遗传改造以及乳酸菌代谢产物的生物合成。

背景技术：

乳酸片球菌是一类重要的乳酸菌，可以通过菌体代谢活动将糖类物质转化为乳酸。乳酸是重要的化工产品，在聚合材料、食品、化妆品、医药等多个领域均有重要应用，例如在食品方面乳酸有很强的防腐保鲜功效，可用在饮料、肉类、水果的贮藏，具有调节ph值、抑菌、延长保质期、调味、保持食品色泽等作用；在聚合材料方面将乳酸单体聚合为具有良好降解性的聚乳酸从而用于制作环保包装材料。

乳酸片球菌作为益生菌被广泛应用于饲料行业。将乳酸片球菌添加至饲料中，其发酵产生的乳酸可以有效增加饲料的风味，提高动物的采食量促进其生长，同时降低ph值维持肠道酸性环境，有效抑制致病微生物的生长繁殖；其代谢合成的细菌素表现出较宽的抑菌谱，对肠道内许多致病菌有明显的抑制作用；乳酸片球菌有利于维护动物肠道健康和微生态平衡，增强动物机体免疫功能。

目前对乳酸片球菌的应用多为菌体及其代谢产物的直接利用，关于乳酸片球菌遗传体系的研究较少，因此不能按照生产目的对其进行改造，例如将其不利代谢途径进行阻断，或是对其有益代谢途径进行放大，导致其应用受到较大的限制。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种乳酸片球菌基因编辑质粒，在大肠杆菌和乳酸片球菌的穿梭质粒的基础上，构建乳酸片球菌基因编辑质粒，不需要克隆外源crispr核酸酶基因，通过利用内源性ii-a型crispr系统即可进行基因组的编辑工作。

本发明还有一个目的是提供一种利用内源性crispr系统对乳酸片球菌进行基因敲除的方法、基因插入方法以及基因点突变的方法，利用基因编辑质粒对乳酸片球菌进行基因敲除、插入或者点突变等，从而对乳酸片球菌进行遗传改造，使其代谢途径发生定向改变，从而达到有益产物超表达以及不利产物不表达的目的。

本发明还有一个目的是提供一种利用乳酸片球菌基因编辑质粒完成基因编辑的乳酸片球菌的反筛方法，将完成单次基因编辑的乳酸片球菌进行反筛，获得不含质粒的突变菌株，再以其制备感受态，进行二次或者更多次的基因编辑，从而实现乳酸片球菌的连续基因编辑，筛选获取表达性能更为优良的菌株。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种乳酸片球菌基因编辑质粒，所述基因编辑质粒的构建方法包括以下步骤：

将含有两个dna重复序列和两个三型酶切位点bbs1的mini-crispr序列、乳酸片球菌的穿梭质粒pmg36e分别进行酶切，再将酶切产物酶连后转化至大肠杆菌中，经筛选，获取转入pmg36e-c的转化子；

活化所述转入pmg36e-c的转化子，抽提质粒得到乳酸片球菌基因编辑质粒pmg36e-c；

其中，所述dna序列如seqidno：1所示。

优选的是，所述mini-crispr序列及pmg36e的酶切位点为xba1、pst1。

优选的是，所述筛选条件为：将包含mini-crispr序列、pmg36e的大肠杆菌，涂布于lb固体培养基平板，37℃培养，挑取转化子并进行pcr验证。

本发明还提供一种利用内源性crispr系统对乳酸片球菌进行基因敲除的方法，包含以下步骤：

步骤1：根据乳酸片球菌胞内ii-a型crispr系统的pam为3’端ngg设计spacer，并根据拟敲除基因的上游和下游序列分别设计同源臂，将两个同源臂克隆至权利要求1-3任一项所述pmg36e-c，构建敲除质粒pmg36e-s-lr；

步骤2：将所述pmg36e-s-lr电转至感受态乳酸片球菌，用含有红霉素的mrs平板进行筛选，挑取单菌落并进行pcr验证，以得到基因敲除突变株。

本发明还提供一种利用内源性crispr系统对乳酸片球菌进行基因插入的方法，包含以下步骤：

步骤1：根据乳酸片球菌胞内ii-a型crispr系统的pam为3’端ngg及拟插入位点设计spacer，并根据拟插入位点的上游和下游序列设计同源臂，将两个所述同源臂和拟插入基因克隆至权利要求1-3任一项所述pmg36e-c，构建插入质粒质粒pmg36e-s-lgr；

步骤2：将所述pmg36e-s-lgr电转至感受态乳酸片球菌，用含有红霉素的mrs平板进行筛选，挑取单菌落并进行pcr验证，以得到基因插入突变株。

本发明还提供一种利用内源性crispr系统对乳酸片球菌进行基因点突变的方法，包含以下步骤：

步骤1：根据乳酸片球菌胞内ii-a型crispr系统的pam为3’端ngg及拟突变位点设计spacer，并根据拟突变位点的上游和下游序列设计同源臂，将两个所述同源臂和目的基因克隆至权利要求1-3任一项所述pmg36e-c，构建突变质粒pmg36e-s-lmr；

步骤2:将所述pmg36e-s-lmr电转至感受态乳酸片球菌，用含有红霉素的mrs平板进行筛选，挑取单菌落并进行pcr验证，以得到点突变菌株。

优选的是，所述感受态乳酸片球菌的制备方法，包括：以下步骤：取冻存管中的乳酸片球菌划线至mrs固体培养基，挑取单菌落后，用mrs液体培养基过夜活化，得到种子液；

将种子液转接至含有苏氨酸的mrs液体培养基培养至对数期，再将菌液用含有蔗糖的电转缓冲液洗涤3-4次，并用溶菌酶处理20-30min，然后用含有蔗糖及甘油的电转缓冲液悬浮细胞，得到感受态乳酸片球菌。

优选的是，所述电转至感受态乳酸片球菌内的条件为：电转参数为2500v、25uf、200ω，质粒浓度500ng。

本发明还提供一种利用所述的乳酸片球菌基因编辑质粒完成基因编辑的乳酸片球菌的反筛方法，其特征在于，将按照所述的方法完成的基因编辑突变株，在不含抗生素的mrs固体培养基上划线培养，经过2-3代传代培养，挑取单菌落进行pcr验证，筛选得到质粒丢失的目的菌株。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明以大肠杆菌和穿梭质粒pmg36e为基础，将含有两个重复序列以及两个三型酶切位点bbs1的mini-crispr序列克隆至所述穿梭质粒pmg36e，构建乳酸片球菌基因编辑质粒pmg36e-c。基于内源性crispr对乳酸片球菌进行基因编辑，不需要克隆外源性的cas基因，操作更为简单。

基于内源性crispr对乳酸片球菌进行基因编辑，通过点突变、缺失突变或插入突变改变其营养代谢途径或者插入新的代谢途径，从而达到对乳酸片球菌进行定向改造的目的，并且通过改造菌株的微生物发酵作用获得目的产物或者超表达目的产物，也可以阻断其不利代谢途径从而消除不利代谢产物的合成与分泌。

利用该技术进行基因编辑的效率相比于传统的同源重组更高，因此可以在较短时间内完成基因编辑工作，节省时间成本，有利于该编辑技术的应用及推广。

本发明完成编辑的菌株只需两到三次传代即可完成反筛，获得质粒丢失的目的菌株单克隆，从而进行第二次的基因编辑，有利于短时间内完成多个基因的连续编辑，获得生产代谢性能更有优良的目的菌株。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明质粒pmg36e的图谱；

图2为本发明质pmg36e-c的图谱：

图3为本发明mini-crispr片段克隆至质粒pmg36e的电泳图；

图4为本发明质粒pmg36e-c转化至乳酸片球菌的电泳图；

图5为本发明利用编辑质粒pmg36e-c对乳酸片球菌进行基因敲除的方法获取的pkt缺失的纯基因型敲除菌株；

图6为本发明插入质粒pmg36e-st-lr的图谱；

图7为本发明利用编辑质粒pmg36e-c对乳酸片球菌进行基因插入的方法获取的pkt基因缺失、tkt基因插入的纯基因型突变菌株；

图8为本发明对已完成编辑的乳酸片球菌基因工程菌进行反筛获取的插入tkt基因的纯基因型突变菌株且emr基因丢失的菌株。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

乳酸片球菌编辑质粒的构建方法，具体包含以下步骤：

a、擎科生物(武汉)公司合成含有两个dna序列为gtttcagaaggatgttaaatcaataaggttaagatc的重复序列以及两个三型酶切位点bbs1的mini-crispr片段(如seqidno：2所示)；

b、将mini-crispr片段、pmg36e(实验室保藏，图谱如图1所示)分别进行酶切(37℃、3h)，酶切位点为xba1、pst1；

将上述酶切产物酶连转化至大肠杆菌，涂布含有400ug/ml红霉素的lb固体培养基平板，37℃培养，挑取转化子并进行pcr验证；设计一对pmg36e的通用引物36f/36r(36f：ggcaatcgtttcagcagaaaaattc36r：cgttttcagactttgcaagcttgc)，用该引物进行pcr扩增检测是否含有300bp的条带，以验证mini-crispr片段是否克隆至质粒上，pcr扩增结果如图3所示，其中3#(即自左向右第四泳道)为成功转入pmg36e-c(图谱如图2所示)的转化子；

c、用含有400ug/ml红霉素的lb液体培养基在37℃、180rpm培养条件下活化上述正确转化子，抽提质粒得到乳酸片球菌基因编辑质粒pmg36e-c。

实施例2

制备感受态乳酸片球菌的方法，具体包括以下步骤：

a、取冻存管中的乳酸片球菌划线至mrs平板，于37℃培养箱中静置培养24h，长出单菌落后挑取至20mlmrs液体培养液中，于37℃、180rpm培养12h；

b、取400μl培养液转接至20ml新鲜mrs培养液中(添加600μl40mm的d/l-苏氨酸)，37℃、180rpm培养约3h至od600为1.5；

c、取1.5ml菌液4℃、10000rpm离心5min，弃上清，加入1ml电转缓冲液i(蔗糖205.37g/l，三水磷酸钾1.86g/l，六水氯化镁0.20g/l，ph7.5)悬浮菌体后，4℃、10000rpm离心5min，弃上清，再加入1ml电转缓冲液i重复离心一次，去上清。用100μl电转缓冲液i悬浮菌体，加入10μl的1mg/ml溶菌酶，并于37℃水浴锅中处理30min。接着4℃、10000rpm离心5min，弃上清，然后加1ml电转缓冲液i悬浮离心两次，最后加入500μl电转缓冲液ii(蔗糖171.15g/l，甘油10％)悬浮细胞，每80μl分装得到乳酸片球菌电转感受态，-80℃保存。

实施例3

编辑质粒pmg36e-c转化至乳酸片球菌的方法，具体包括以下步骤：

将500ng的pmg36e-c加至一支80ul乳酸片球菌感受态，电击转化，电转参数为2500v、25uf、200ω，立即加入900ul复苏培养基，其中，所述复苏培养基包含以下质量浓度的组分：蔗糖171.15g/l，葡萄糖20g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物4g/l，牛肉膏8g/l，乙酸钠3g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁0.2g/l，一水硫酸锰0.05g/l，吐温80lml/l，然后于37℃、180rpm孵育3h，取100ul菌液涂布含有5ug/ml红霉素的mrs固体培养基平板，37℃培养；

2天后平板上长出多个转化子，转化效率达到6*10³cfu/ug；挑取10个转化子活化以后，用pmg36e上一对通用引物36f/36r(36f：ggcaatcgtttcagcagaaaaattc36r：cgttttcagactttgcaagcttgc)进行pcr扩增，检测是否含有300bp的条带，验证结果如图4所示：结果表明10个转化子均已转入编辑质粒pmg36e-c。

实施例4

利用编辑质粒pmg36e-c对乳酸片球菌进行基因敲除的方法，具体包括以下步骤：

a、以乳清酸核糖转移酶pyre为待敲除基因，根据3’ngg设计aacaacaactaactcctgcccagctagatt为spacer，将其通过bbsi单酶切、酶连的方法克隆至pmg36e-c，构建敲除质粒pmg36e-se；

b、以乳酸片球菌基因组为模板，设计两对引物，即：

e-lf：aactgcagggctggggggcatggac

e-lr：agttgcgccccattggtttgaacccctttatttggatttc

e-rf：taaaggggttcaaaccaatggggcgcaactacaac

e-rr：cccaagcttacccgcaaagtagacttgtgc，

通过pcr的方法扩增pyre基因的上游和下游700bp分别作为左臂、右臂，通过soe的方法将两者连接起来，通过psti/hindiii双酶切、酶连的方法克隆至pmg36e-se，构建敲除质粒pmg36e-se-lr；

c、将敲除质粒pmg36e-se-lr通过实施例3所述的转化方法转化至乳酸片球菌，用含有5ug/ml红霉素的mrs平板进行筛选，挑取单菌落并进行pcr验证，设计基因组上pyre基因左臂右臂两端的一对引物pyre-f/pyre-r(扩增基因组上包含pyre基因在内的一段序列)，即：

pyre-f：ggacgggcactactttacttgta

pyre-r：cggagcggggtgcatgataa，进行pcr扩增，得到两条大小不同的条

带，判断可知得到混合基因型菌株；

d、将上述混合基因型菌株划线至不含抗生素的mrs平板，挑取单菌落，再次划线，挑取17个单菌落活化并,利用引物pyre-f/pyre-r及引物pyre-f2/pyre-r2(扩增基因组上的pyre基因)，其中，

pyre-f：ggacgggcactactttacttgta

pyre-r：cggagcggggtgcatgataa

pyre-f2：atgacggaaacacaaactcaagc

pyre-r2：ttatttaattgttgtagttgcgcc，

进行pcr验证，pcr验证结果如图5所示：a中2-19泳道为引物pyre-f/pyre-r的pcr验证结果，a中20-26泳道及b中2-11泳道为引物为pyre-f2/pyre-r2的pcr验证结果。说明获得的11#单菌落为pyre缺失的纯基因型敲除菌株。

实施例5

利用编辑质粒pmg36e-c对乳酸片球菌进行基因插入的方法，具体包括以下步骤：

a、以凝结芽孢杆菌转酮醇酶基因tkt为待插入基因，根据3’ngg设计待插入位点pkt基因上一段acttgaacttgcctgacttccgccaatacg序列为spacer，将其通过bbsi单酶切、酶连的方法克隆至pmg36e-c，构建插入质粒pmg36e-st；

b、以乳酸片球菌基因组为模板，设计两对引物，通过pcr的方法扩增基因组上一非编码位点的上下游700bp分别作为左臂、右臂，通过soe的方法将左臂、tkt基因以及右臂连接起来，并通过psti/hindiii双酶切、酶连的方法克隆至pmg36e-st，构建插入质粒pmg36e-st-lr(图谱如图6所示)；

c、将插入质粒pmg36e-st-lr通过实施例3所述的转化方法转化至乳酸片球菌，用含有5ug/ml红霉素的mrs固体培养基平板进行筛选，挑取单菌落，设计基因组上插入位点pkt上下游一对引物，即：

pkt敲除-f：gccggacgaacgctctctaac

pkt敲除-r：tggctgagccagcttttgatg，进行pcr扩增，pcr结果为两条大小不同的条带，判断即为混合基因型菌株；

d、将上述混合基因型菌株划线至不含抗生素的mrs平板，挑取单菌落，再次划线，挑取7个单菌落活化并利用引物tkt-f/tkt-r，即：

tkt-f：ccttaattaaccccttcagcttgagctc，

tkt-r：tggctgagccagcttttgatg

以及引物pkt-f2/pkt-r2，

pkt-f2：atgacagactattcatctaaagctt

pkt-r2：ttatttaacgtctttccataccc，进行pcr验证，结果图7所示：4#单菌

落为pkt基因缺失、tkt基因插入的纯基因型突变菌株。

实施例6

利用编辑质粒pmg36e-c对乳酸片球菌进行基因突变的方法，具体包括以下步骤：

a、以l型乳酸脱氢酶基因l-ldh为待突变基因，根据3’ngg设计aatcatcaacaagaagggtgctacattcta为spacer，将其通过bbsi单酶切、酶连的方法克隆至pmg36e-c，构建突变质粒pmg36e-sldh；

b、以乳酸片球菌基因组为模板，设计两对引物，通过pcr的方法扩增基因组上l-ldh基因的上下游700bp分别作为左臂、右臂，通过soe的方法将左臂、目的基因ldh2以及右臂连接起来，并通过酶切、酶连的方法克隆至pmg36e-sldh，构建突变质粒pmg36e-sldh-lr；

c、将突变质粒pmg36e-sldh-lr通过实施例3所述的转化方法转化至乳酸片球菌，用含有5ug/ml红霉素的mrs平板进行筛选，挑取单菌落。

d、选取上述单菌落划线至不含抗生素的mrs平板，挑取单菌落，再次划线，挑取10个单菌落活化并对ldh基因进行pcr扩增及测序，其中有1个单菌落为待突变基因l-ldh突变为ldh2的的突变菌株。

实施例7

对已完成编辑的乳酸片球菌基因工程菌进行反筛的方法，具体包括以下步骤：

将已完成pkt基因敲除的混合基因型乳酸片球菌在不含抗生素的mrs平板上划线进行传代培养，重复该过程2次，挑取平板上的单菌落21个，利用引物emr-f：agtttatgcatcccttaactta，emr-r：tcgacccatatttaaaaagc，扩增质粒上的emr基因，pcr扩增结果如图8所示：17#单菌落为pkt基因敲除的纯基因型突变菌株，且emr基因丢失，即发生质粒丢失。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与附图。

序列表

<110>华中农业大学

<120>利用内源性crispr系统对乳酸片球菌进行基因编辑的方法

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtttcagaaggatgttaaatcaataaggttaagatc36

<210>2

<211>194

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gtttcagaaggatgttaaatcaataaggttaagatcaggtcttcgacgtcgaagacctgt60

ttcagaaggatgttaaatcaataaggttaagatctgagagcatcaaaaaagaggagccgt120

cccattaagggtcggttcctctttcactatgtaatgcccagatagctgggacaaatggat180

aaactccgcacaaa194

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggcaatcgtttcagcagaaaaattc25

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cgttttcagactttgcaagcttgc24

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aactgcagggctggggggcatggac25

<210>6

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

agttgcgccccattggtttgaacccctttatttggatttc40

<210>7

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

taaaggggttcaaaccaatggggcgcaactacaac35

<210>8

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cccaagcttacccgcaaagtagacttgtgc30

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ggacgggcactactttacttgta23

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<211>20

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<400>11

atgacggaaacacaaactcaagc23

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ttatttaattgttgtagttgcgcc24

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gccggacgaacgctctctaac21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

tggctgagccagcttttgatg21

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ccttaattaaccccttcagcttgagctc28

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<211>21

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