本发明涉及一种筛选高效降解苯酚、吡啶、喹啉的菌群的方法及其应用。
背景技术：
焦化废水是在焦炭炼制、煤气净化及焦化回收过程中产生的废水，它包含很多复杂的有机污染物，包括喹啉类、吡啶、酚类、苯类等多种有机物，被列为难处理污水。喹啉化合物，包括喹啉和异喹啉，具有致癌和致突变作用，吡啶及衍生物是有毒化合物，具有致癌和致畸性，被美国环保署(usepa)划为优先控制污染物。多环芳烃不但难以生物降解，通常还是致癌物质。由于多种污染物之间具有加和(additive)、协同(synergism)、拮抗(antagonism)等作用，复合污染是焦化废水的主要特征，应对其进行深入研究，这对此环境问题的有效解决具有重要意义。
生物法是废水处理的传统方法。由于微生物具有易获得、易培养、易变异、繁殖快、适应性强等特性。目前污染修复中单菌种和菌群的使用较多。单菌种的筛选简单，但单菌种在实际环境中的适应能力较弱，容易退化；菌群对复合污染降解具有较好的效果，且抗逆性强，但由于复合污染存在的多种污染物的加和、协同和拮抗等作用，现有生化法处理焦化废水对复合污染物的降解水平较低，亦难于缺乏筛选能够同时降解苯酚、吡啶、喹啉等多种污染物菌群，也限制了生物法处理复合污染焦化废水这一措施的应用。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明的目的在于提供筛选苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群的方法，能够迅速的从焦化废水和/或活性污泥中筛选出苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群，克服各菌株间的拮抗作用和复合污染物对微生物的毒性作用。能够提高了利用复合菌群降解苯酚、吡啶、喹啉的效率。
为解决上述问题，本发明提供的技术方案为：
一种筛选高效降解苯酚、吡啶、喹啉的菌群的方法，包括以下步骤：
1)取样：从焦化废水处理装置中采集带有污泥的废水样品，所述废水样品中包括好氧处理装置出水和厌氧处理装置出水。
2)培养与转接：将样品加入含有苯酚、吡啶、喹啉的液体无机盐培养基中，于27～33℃条件下培养，用紫外扫描检测其降解效果，当扫描曲线趋于平缓及曲线不再下降的时候作为培养终点，以同样培养条件进行多次转接，取多次转接之后的上清液作为筛选得到的高效降解菌群的接种菌，所述液体无机盐培养基配比如下：nacl0.9～1.1g/l，nh4no30.9～1.1g/l，k2hpo41.20～1.8g/l，kh2po40.4～0.6g/l，mgso4·7h2o0.15～0.25g/l，ph7.0-7.2，苯酚10～100mg/l、吡啶10～100mg/l、喹啉10～100mg/l，以及余量的蒸馏水，以苯酚、吡啶、喹啉为唯一碳氮源。
所述的一种筛选高效降解苯酚、吡啶、喹啉的菌群的方法，进一步的，所述液体无机盐培养基的配比优选为nacl1.0g/l，nh4no31.0g/l，k2hpo41.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，苯酚40～60mg/l、吡啶40～60mg/l、喹啉40～60mg/l。
所述的一种筛选高效降解苯酚、吡啶、喹啉的菌群的方法，进一步的，培养条件优选为将培养基置于三角瓶中，于30℃，180rpm条件下，进行培养。
所述的一种筛选高效降解苯酚、吡啶、喹啉的菌群的方法，进一步的还包括以下步骤：
3)分离纯化：采用lb固体培养基对步骤3)得到的降解菌群进行涂布分离、多次反复纯化，并保种；
4)菌种鉴定：从保种的降解菌群中选取株菌落形态和细胞形态各异的菌，测定单菌株对三种底物的降解率，采用pcr方法进行分子鉴定确定菌株的种属。
本发明还提供采用所述方法筛选得到苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群，所述菌群包括数量比为90～110：20～35：200～240：50～70：90～110的赤红球菌(rhodococcusruber)、药用肉毒杆菌(patulibactermedicamentivorans)、蝗科副球菌(paracoccusacridae)、角膜松解微杆菌(microbacteriumkeratanolyticum)和庆笙红球菌(rhodococcusqingshengii)。
所述的苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群，进一步的，所述菌群包括数量比为95～105：25～30：210～230：55～65：90～100的赤红球菌(rhodococcusruber)、药用肉毒杆菌(patulibactermedicamentivorans)、蝗科副球菌(paracoccusacridae)、角膜松解微杆菌(microbacteriumkeratanolyticum)和庆笙红球菌(rhodococcusqingshengii)。
本发明还提供一种用于筛选苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群的液体无机盐培养基，所述液体无机盐培养基配比如下：nacl0.9～1.1g/l，nh4no30.9～1.1g/l，k2hpo41.20～1.8g/l，kh2po40.4～0.6g/l，mgso4·7h2o0.15～0.25g/l，ph7.0-7.2，苯酚10～100mg/l、吡啶10～100mg/l、喹啉10～100mg/l，以及余量的蒸馏水。
所述一种用于筛选苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群的液体无机盐培养基，进一步的，所述液体无机盐培养基配比优选为nacl1.0g/l，nh4no31.0g/l，k2hpo41.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，苯酚40～60mg/l、吡啶40～60mg/l、喹啉40～60mg/l。
本发明还提供了一种固定化所述苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群的载体，所述载体的制备方法为：
1)在无菌条件下，将菌悬液和灭菌处理的复合材料溶液混合；所述复合材料溶液中由80～120g/l的聚乙烯醇、8～12g/l的海藻酸钠，25～35g/l的sio2，4～6g/l的caco3、4～8g/l的活性炭及余量的水配制而成。
2)在无菌环境下将均匀混合了菌悬液的复合材料溶液逐滴滴入交联剂中，硬化处理后得到固定化载体，所述的交联剂为饱和硼酸溶液中溶解质量分数为1.5～2.5％的氯化钙固体并用氢氧化钠溶液调ph为6.0～6.5后得到。
所述一种固定化所述苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群的载体，进一步的，所述复合材料溶液中由100g/l的聚乙烯醇、10g/l的海藻酸钠，30g/l的sio2，5g/l的caco3、6g/l的活性炭及余量的水配制而成，所述交联剂由饱和硼酸溶液中溶解质量分数为2％的氯化钙固体并用0.5mol/l的氢氧化钠调ph为6.22后得到，所述硬化处理条件为在4℃条件下交联处理12～24h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的筛选焦化废水中苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群的方法，通过优选液体无机盐的配比，意外的发现当采用优选的无机盐比例和浓度时，在适宜的条件下培养的情况下，可以从焦化厂污水处理装置中含污泥的废水样品中，筛选出能够以苯酚、吡啶及喹啉作为唯一碳氮源的高效降解菌群，且操作简易，科学可行且对设备要求低，在较短时间内可以筛选出高效降解菌群。
2.本发明采用聚乙烯醇、海藻酸钠固定化载体将筛选得到的高效降解菌群包埋固定化成球状，投放于污染环境之中进行微生物降解。固定化菌球与菌液相比，具有方便运输，投放均匀的特点。且包埋固定载体给微生物留有适宜的生存空间缓冲焦化废水污染的冲击，使其降解污水中复合污染物的效果更好，更适应处理高污染物浓度的废水。
3.采用本发明方法筛选得到的功能菌群能够继续保持各种菌株间的协同作用，菌群组成稳定，多底物降解，不会因为从自然界的分离而削弱降解能力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：筛选苯酚、吡啶、喹啉高效降解菌群
1)取样
从唐山达丰焦化有限公司的污水处理装置中采集带有污泥的焦化废水，包括1ml原水(带泥)、1ml厌氧池出水(带泥)、1ml好氧池(带泥)、1ml二沉池出水(带泥)
2)培养与转接
将步骤1)采集的各工艺点采集的焦化废水一并投加于100ml液体无机盐培养基，所述液体无机盐培养基配比为nacl1.0g/l，nh4no31.0g/l，k2hpo41.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，苯酚50mg/l、吡啶50mg/l、喹啉50mg/l。置于三角瓶口以封口膜封口(封口膜表面具有透气孔)后置于30℃、180rmp摇床中培养。用紫外全波长扫描检测其降解效果，其中苯酚最大吸收峰在210nm和270nm处，喹啉的最大吸收峰在313nm和225nm处，吡啶的最大吸收峰在256nm处，在培养3天之后扫描曲线趋于平缓及曲线不再下降显示苯酚、吡啶、喹啉均已降解完成，并以此作为培养终点。到达培养终点后，转接上清液作为接种菌液，以同样的培养条件进行多次转接得到高效降解菌群。
3)分离纯化：
采用稀释平板涂布法分离多次转接后得到的高效降解菌群菌液(以下简称富集菌液)。将10管9ml的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8依次编号。在无菌操作条件下，吸取1ml富集菌液置于第一管9ml无菌水中并震荡，即为10-1浓度的菌液。同样方法依次稀释得到10-8浓度的菌液。分别从10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的菌液中各吸取100μl菌液于具有lb固体培养基的平板上，用玻璃涂布棒在平板上旋转涂布均匀，每个浓度的菌液做2个平板。将接种有微生物的平板置于30℃的恒温培养箱中培养。所述lb固体培养基的成分是蛋白胨10g、氯化钠10g、牛肉膏5g、琼脂20.0～25.0g、蒸馏水1000ml、ph＝7.0～7.2。待平板长出菌落后，选取长势较好的菌下一步纯化。用接种环以无菌操作挑取一环菌落，接种到新制的灭菌平板上，对所选菌株进行进一步纯化。菌株的纯化采用平板划线法，具体过程如下：先用挑有菌落的接种环在新制平板的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线，勿使前后两条线重叠。将接种有微生物的平板置于30℃的恒温培养箱中培养。采用pcr方法对纯化出的优势菌株进行鉴定，所述pcr方法为先提取优势菌株的dna，之后采用pcr扩增仪将提取的dna进行pcr扩增，接着进行dna的琼脂糖凝胶电泳，最后基因组16srdna测序分析确定种属。经鉴定，筛选得到的高效降解菌群主要包括赤红球菌(rhodococcusruber)、药用肉毒杆菌(patulibactermedicamentivorans)、蝗科副球菌(paracoccusacridae)、角膜松解微杆菌(microbacteriumkeratanolyticum)、庆笙红球菌(rhodococcusqingshengii)。赤红球菌(rhodococcusruber)、药用肉毒杆菌(patulibactermedicamentivorans)、蝗科副球菌(paracoccusacridae)、角膜松解微杆菌(microbacteriumkeratanolyticum)、庆笙红球菌(rhodococcusqingshengii)的数量比为100：27：218：58：96。
菌种的保藏：750μl甘油+750μl菌液混匀，-20℃保藏。
实施例2：高效降解菌群在聚乙烯醇/海藻酸钠复合载体的固定化。
降解菌群种子液的制备：将实施例1得到的富集菌液转接在lb液体培养基中，30℃、180rmp环境培养48h，得到种子液。
菌悬液的制备：将上述1ml种子液接种到100ml的lb培养基中，180r/min、30℃培养24h，6000r/min、4℃离心10min，弃去上清，用无菌水吹打重悬，离心，弃上清，如此重复3次，将得到的菌体用无机盐溶液(即不含苯酚、吡啶和喹啉的无机盐液体培养基)制备成od600为2.0的菌悬液。
制备固定化微球：
第一步，制备包埋菌群的固定化载体溶液。将10g聚乙烯醇、1g海藻酸钠和3g二氧化硅、0.5g碳酸钙、0.6g活性炭分散于100ml去离子水，90℃水浴溶解得到复合材料溶液。高温高压灭菌，将5ml菌悬液和复合材料溶液无菌条件下混匀。
第二步，制备交联剂。饱和硼酸溶液中溶解质量分数为2％的氯化钙固体并用0.5mol/l的氢氧化钠调ph为6.22。
第三步，海藻酸钠-聚乙烯醇复合微球的制备。用玻璃注射器吸取均匀混合了菌悬液的复合材料溶液滴入交联剂中，于4℃交联12h。得到固定化高效降解菌群的载体微球。
实施例3：固定化高效降解菌群的载体微球应用效果分析
所述包埋菌群的载体微球为具有多孔隙结构的凝胶小球。在实施例2相同条件下分别制备包埋菌群的载体微球和包埋单一菌株的载体微球。
将载体微球分别投加于含苯酚、吡啶、喹啉三种特征污染物的液体无机盐培养基中。三种特征污染物的初始质量浓度均为100mg/l。于t＝30℃、r＝180r/min下定时取样测定苯酚、吡啶和喹啉的浓度。对比降解效率。菌群和不同菌株在降解时间为10h时对三种特征污染物的降解率如下表所示
从上述数据可以看出，采用包埋不同单一菌株的载体微球对三种污染物降解率水平不一，但仅有包埋菌群的载体微球，能够在降解时间内完全降解三种污染物。