一种快速高效提取百合花瓣总RNA的方法与流程

本发明涉及rna提取技术领域，特别是涉及一种快速高效提取百合花瓣总rna的方法。

背景技术：

目前，植物总rna的提取最常用的方法有异硫氰酸胍/酚法、sds法和ctab法。这些方法已广泛应用于植物组织总rna的提取，并已有实验数据证实从拟南芥，桃子/葡萄果实、棉花组织、非洲菊花瓣和文冠果花药等组织中成功提取到了高质量总rna。

异硫氰酸胍/酚法：这是一种传统的rna提取方法，异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将rna释放到溶液中，采用酸性酚-氯仿混合液抽提，低ph值的酚将使rna进入水相，而蛋白质和dna仍留在有机相，从而可以完成rna的提取工作。该法适用于次生代谢物较少的植物性材料，如幼苗、幼叶等。

sds/edta法：sds与异硫氰酸胍作用相似，可以使细胞裂解，使与核酸紧密相连的组蛋白分开和变性。edta：可以与镁离子螯合，从而有助于阻止核酸分子间的聚集，及核酸与蛋白质分子的聚集，与sds一样，还可抑制核酸酶的活性。之后用苯酚/氯仿去除变性的蛋白质及多糖、脂类等杂质。得到质量较高的样本总rna以满足后续实验的需要。

ctab法：ctab是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中，ctab与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂(苯酚/氯仿)抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。得到质量较高的样本总rna以满足后续实验的需要。

但不同植物或同一种植物的不同品种内含物组分及含量有很大差别，尤其是富含多糖、多酚等次生代谢物的组织，用以上3种提取rna的方法不能够完全适用。百合花瓣组织多糖、多酚含量高，我们比较了常规的异硫氰酸胍法/sds/酚法和ctab法在提取百合花瓣rna的效果，对ctab法进行了改进，获得了适合于百合花瓣总rna提取的改进ctab-licl法。

不同植物或同一种植物的不同品种内含物组分及含量有很大差别，尤其是富含多糖、多酚等次生代谢物的组织，用以上3种提取rna的方法不能够完全适用，用异硫氰酸胍法、sds法和ctab法等常用的提取植物rna的方法无法在含有多糖多酚的样本中提取到高质量的rna，原因在于其组织中富含大量多糖类物质，多糖理化性质与rna相似，提取过程中往往与rna形成难溶的共沉淀，在除去多糖的同时rna也被裹携带走，造成rna产量的减少，或者多糖溶解后形成粘稠的溶液污染rna样品，使之无法用于进一步的分子生物学研究。

技术实现要素：

本发明主要目的是针对上述的现有方案的缺点，提供一种快速高效提取百合花瓣总rna的方法，能够适用于百合花瓣等多糖多酚类植物组织总rna提取的高效改进方案，可以通过较为简单的实验过程，获得较高质量的样本总rna。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种快速高效提取百合花瓣总rna的方法，该方法包括如下步骤：

(1)百合花瓣的裂解、总rna的抽提：取百合花瓣组织块研磨，得研磨料，于裂解液中加入研磨料混合均匀，于65℃水浴，室温离心，加入等体积异丙醇混匀，于-20℃静置，再于4℃离心，弃上清，收集离心物加入200ul焦碳酸二乙酯(depc)溶解，得样本rna液；

(2)rna的洗涤、纯化：于样本rna液中加入等体积的沉淀剂混匀后，于-20℃静置，再于4℃，离心，弃上清，瞬离后将液体完全吸出，静置晾干，加入溶剂溶解其中的rna，于-80℃保存，得纯化rna液，取纯化rna液于4℃离心，弃上清后，使用溶剂进行溶解后加入等体积的沉淀剂去除溶液中的多糖组分，加入辅助除多糖剂，震荡混匀后加入磁珠，移液枪吹吸混匀，室温静置，漂洗，待磁珠室温晾干，加入溶剂溶解rna，于-80℃保存，得待测rna液；

(3)琼脂糖凝胶电泳：采用琼脂糖凝胶、电泳缓冲液，与待测rna液进行电泳，完成后取出琼脂糖凝胶，在紫外灯下观察，采用凝胶成像系统拍照保存；

(4)系统检测：仪器系统检测提取总rna的浓度及完整性。

在上述技术方案中，所述步骤(1)中对百合花瓣组织块的研磨的过程以50～60hz频率进行组织研磨15～25s。

在上述技术方案中，所述步骤(1)中的裂解液是研磨料的质量7～10倍。

在上述技术方案中，优选的，所述裂解液的配制为于800ul、2×ctab溶液中加入10ul巯基乙醇混合均匀。

在上述技术方案中，所述步骤(2)中的沉淀剂为licl溶液，其浓度为4mol/l。

在上述技术方案中，所述步骤(2)中的溶解rna样本所用溶剂为体积分数0.1％的焦碳酸二乙酯(depc)，用量为30～50ul。

在上述技术方案中，所述所述步骤(2)中的辅助除多糖剂为浓度5mol/l的nacl溶液。

在上述技术方案中，所述步骤(2)中的漂洗所用试剂为体积分数为80％的乙醇溶液。

在上述技术方案中，所述步骤(3)的电泳过程中，所述琼脂糖凝胶的质量分数为1.5％，所述电泳缓冲液为1×tae电泳缓冲液，选用dl2000作为maker，控制电压为500v，10～12v/cm。

在上述技术方案中，该提取方法也可应用于其它含有多糖多酚植物组织总rna的提取。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供一种改良的ctab-licl方法，实验中对ctab法进行了改进，获得了适合于百合花瓣总rna提取的改良ctab-licl法，这为进一步的分子操作以及ngs测序奠定了基础；

(2)本发明公布的技术方案相比于其它方法，不仅提高了rna的得率，本研究中我们在裂解液中的ctab和高浓度的nacl协同作用，使部分多糖随着抽提过程而逐渐去除，其次利用高盐licl可以选择性地沉淀总rna，使得部分多糖留在溶液中而不随rna沉淀下来，这样极大地降低了沉淀中多糖的含量，在此基础上我们进一步引入了磁珠法除多糖的步骤，使用上述几种去多糖的步骤，可以有效地去除百合花瓣组织中的多糖干扰，提取出较为理想的总rna；

(3)本实验通过rna提取过程的优化从而得到了质量更高的rna，为后续的分子实验、qpcr实验、ngs测序等相关实验解决前期的前处理问题，解决了技术难题，极大地提高了后续实验的成功率，本研究中使用的改良ctab-licl法不仅适用于百合花瓣总rna的提取，同样可以用于从类似的多糖多酚植物组织中提取高质量的总rna。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是采用本发明实施例1的方案所得总rna样本的凝胶电泳图；

图2是采用传统的异硫氰酸胍/sds法所得总rna样本的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种快速高效提取百合花瓣总rna的方法，包括如下步骤：

(1)百合花瓣的裂解、总rna的抽提：取百合花瓣组织块直接放入研磨管中，使用组织研磨仪以50～60hz频率液氮研磨15～20s，得研磨料，于含有800ul、2×ctab的2ml离心管中加入10ul巯基乙醇，再加入研磨料混匀，于65℃温浴5～7min，再移至离心机以13000rpm室温离心5min，转移至新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇混匀，于-20℃静置30min，再于4℃，以13000rpm离心10min，弃上清，收集离心物加入200ul焦碳酸二乙酯(depc)溶解，得样本rna液；

(2)rna的洗涤、纯化：于样本rna液中加入等体积的浓度4mol/l的licl混匀后，于-20℃静置2～12h，再于4℃，以13000rpm速率离心10min，弃上清，瞬离后将液体完全吸出，静置晾干8min，加入30～50ul体积分数0.1％的depc溶解rna，于-80℃保存，得纯化rna液，取纯化rna液于4℃离心10min，弃上清后，使用depc进行溶解后加入等体积的浓度4mol/l的licl去除溶液中的多糖组分，然后加入10ul的浓度5mol/l的nacl，震荡混匀后加入适量的磁珠，移液枪吹吸混匀，室温静置5min，然后使用80％的无水乙醇进行2次洗涤，最后待磁珠室温晾干加入30～50uldepc溶解rna，于-80℃保存，得待测rna液；

(3)琼脂糖凝胶电泳：制备质量分数为1.5％琼脂糖凝胶，使用1×tae电泳缓冲液作为电泳缓冲液，dl2000作为maker，设置电压500v，10～12v/cm，加入待测rna液保持10min；电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，rna存在则会显示出荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存；

(4)agilent2100芯片检测：使用安捷伦公司的2100仪器检测提取总rna的浓度及完整性，具体操作过程详见安捷伦公司的芯片操作指导。

实施例1

一种快速高效提取百合花瓣总rna的方法，包括如下步骤：

(1)rna的裂解、抽提：取百合花瓣组织块直接放入研磨管中，使用组织研磨仪以60hz频率液氮研磨20s，得研磨料，于含有800ul、2×ctab的2ml离心管中加入10ul巯基乙醇，再加入研磨料混匀，于65℃温浴5min，再移至离心机以13000rpm室温离心5min，转移至新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇混匀，于-20℃静置30min，再于4℃，以13000rpm离心10min，弃上清，收集离心物加入200ul焦碳酸二乙酯(depc)溶解，得样本rna液；

(2)rna的洗涤、纯化：于样本rna液中加入等体积的浓度4mol/l的licl混匀后，于-20℃静置5h，再于4℃，以13000rpm速率离心10min，弃上清，瞬离后将液体完全吸出，静置晾干8min，加入50ul体积分数0.1％的depc溶解rna，于-80℃保存，得纯化rna液，取纯化rna液于4℃离心10min，弃上清后，使用depc进行溶解后加入等体积的浓度4mol/l的licl去除溶液中的多糖组分，然后加入10ul的浓度5mol/l的nacl，震荡混匀后加入适量的磁珠，移液枪吹吸混匀，室温静置5min，然后使用80％的无水乙醇进行2次洗涤，最后待磁珠室温晾干加入40uldepc溶解rna，于-80℃保存，得待测rna液；

(3)琼脂糖凝胶电泳：制备质量分数为1.5％琼脂糖凝胶，使用1×tae电泳缓冲液作为电泳缓冲液，dl2000作为maker，电压500v，10～12v/cm，加入rna液保持10min；电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，rna存在则会显示出荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存；

(4)agilent2100芯片检测：使用安捷伦公司的2100仪器检测提取总rna的浓度及完整性，具体操作详见安捷伦公司的芯片操作指导。

对比例1.采用异硫氰酸胍、sds法(以trizol法为例)。

1.液氮研磨：取百合花瓣组织块直接放入研磨管中，使用组织研磨仪迅速研磨，待组织变软，按60mg组织/ml加入trizol，转入离心管进行以下操作；

2.组织加trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；

3.以12000rpm速率离心5min，弃沉淀，按200ul氯仿/mltrizol加入氯仿，振荡混匀后，于4℃以12000g重力离心15min，分层；

4.吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5ml异丙醇/ml的trizol加入异丙醇混匀，室温放置7min，于4℃，以12000g重力离心10min，弃上清，rna沉于管底；

5.按1ml乙醇溶液/mltrizol加入体积分数为75％的乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀，于4℃，以8000g重力离心5min，弃上清，收集离心物；

6.取离心物室温晾干后，得含rna样品，用50ul的tebuffer溶解含rna样品，于57℃，混合6min，得到的rna可用于后续试验。

对比例2.采用ctab法提取百合花组织中rna。

(1)液氮中迅速研磨新鲜的百合花组织样品，充分研磨成均匀的粉末，取0.1g所得均匀粉末置于预先加入体积1ml的ctab提取液的容量为1.5ml的离心管中，迅速涡旋混匀50s后，移至65℃水浴保持5min，得处理物；

(2)取处理物加入等体积的氯仿/异戊醇混液涡旋混匀，在10000g重力下离心15min，离心沉淀蛋白质；

(3)取经步骤(2)离心所得上清液移至新的离心管，加入等体积的浓度4mol/l的licl溶液混合，于4℃条件下沉淀3h，使rna变性，得混物；

(4)取经步骤(3)处理的混物于4℃，以12000g离心10min沉淀rna，弃上清去除dna，然后分别用500ul体积分数为70％和100％的乙醇洗涤沉淀除去杂质；

(5)倒掉乙醇，瞬时离心，吸干离心管中的液体，超净工作台晾干沉淀，10min；

(6)真空干燥7min后，得到干燥样品，用50ul的tebuffer溶解该干燥样品，于56℃，混合7min，得到的rna可用于后续试验。

所述氯仿/异戊醇混液中的氯仿与异戊醇的体积比为24:1。

采用不同的方案所得提取结果如表1、表2，图1、图2所示。

表1、采用本发明实施例1所得百合花瓣总rna质检数据

经凝胶电泳所得marker条带分布：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp。

表2、采用传统异硫氰酸胍/sds法实验数据所得百合花瓣总rna质检数据

经凝胶电泳所得marker条带分布：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp。

由此可知，本发明可以通过较为简单的实验过程，获得较高质量的样本总rna，所得rna质检结果为a，所提取得到的质量比传统的提取方法要多，电泳所得图谱条带也更为清晰。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。