魔鬼弧菌PCR鉴定方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种魔鬼弧菌pcr鉴定方法。

背景技术：

魔鬼弧菌(vibriodiabolicus)在细菌分类中属于弧菌科(vibrionaceae)，弧菌属(vibrio)。魔鬼弧菌最初是从东太平洋的深海热液喷口(深2600米)处的庞贝虫中分离出来。由于在深海热液喷口处的高压、高温和高硫化物等恶劣的生存环境，该菌具有一些独特的基因表达和代谢途径以适应其独特的生存环境。如该菌能分泌表达一种胞外多糖，胞外多糖由线性的四糖重复单位组成(包含两个n-乙酰己糖胺和两个葡萄糖醛酸残基)。研究表明该多糖具有很好的促进组织再生作用，如可显著促进骨组织的再生，魔鬼弧菌分泌胞外多糖在生物医药领域具有良好的应用前景。

弧菌广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。弧菌中对人和动物危害较大的主要包括副溶血性弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌等。如副溶血性弧菌是食品污染的重要病原菌。魔鬼弧菌最初是从远离沿海生态系统和人类活动区域的深海中分离出来的。然而，近年研究表明在近海和人类海产品的养殖区也发现该菌的存在，如在美国华盛顿州普吉特湾养殖的牡蛎以及我国福建省厦门市某鲍鱼养殖场的养殖水体中均发现魔鬼弧菌的存在。随着魔鬼弧菌全基因组测序的完成，人们在对其基因组分析时发现魔鬼弧菌在进化关系上与能引起人和动物发病的副溶血弧菌和溶藻弧菌非常接近。

迄今为止，国内外针对魔鬼弧菌的特异性快速鉴定方法还未见任何报道，通过全基因组测序对菌种鉴定的方法耗时费力，价格昂贵。本专利建立的方法可实现对魔鬼弧菌的快速鉴定，该技术具有高效率，高特异性，高重复性，成本低等优点。能够快速、准确、简便地对魔鬼弧菌进行鉴定。综上，本发明目的在于提供一种魔鬼弧菌快速鉴定方法。该方法的建立对于魔鬼弧菌的鉴定及分子流行病学调查具有重要意义和应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种魔鬼弧菌的快速鉴定方法，应用于魔鬼弧菌的快速鉴定。本发明可以通过采用以下技术方案来实现：

1.本发明提供了两组魔鬼弧菌鉴定引物，用于扩增魔鬼弧菌的特异性基因组片段。

以提取的基因组产物为模板，用seqidno.1/seqidno.2和seqidno.3/seqidno.4两组引物分别进行pcr，可分别扩增出大小为459bp和337bp的特异性基因组片段。

2.以提取的基因组产物为模板，用seqidno.1/seqidno.2和seqidno.3/seqidno.4两组引物，在同一个反应体系中进行pcr，可同时扩增出大小为459bp和337bp的特异性基因组片段。

3.本发明提供一种魔鬼弧菌的快速鉴定方法，包括魔鬼弧菌基因组提取方法和pcr扩增反应体系和条件。扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的特异性目的条带大小为459bp和337bp。

本发明的有益效果体现在：

本发明所述的魔鬼弧菌扩增引物及扩增方法，扩增出的基因组为魔鬼弧菌特异性序列，具有高效率，高特异性，高重复性，成本低等优点。能够快速、准确、简便地对魔鬼弧菌进行鉴定。

附图说明

图1魔鬼弧菌pcr扩增鉴定结果。

图2魔鬼弧菌pcr扩增特异性实验结果。

具体实施方式

实施例1：本实施例描述了本发明提供的魔鬼弧菌pcr鉴定所用引物设计和合成。

设计并优化引物：通过对genebank数据库中魔鬼弧菌基因组分析，找出魔鬼弧菌基因组特有序列进行引物设计，上述引物设计原则如下：①上下游位置间距不大于500bp；②引物自身不形成二级结构；③引物tm值适中，g+c含量在40％～60％之间；④引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物序列如下表所示：

实施例2：本实施例描述了本发明提供的魔鬼弧菌基因组提取策略。

取200μl魔鬼弧菌样品置于1.5ml离心管中，加入200μl裂解液，室温裂解30min；按照基因组提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提供的操作步骤，提取魔鬼弧菌基因组；最后用30μl无菌水溶解，低温保存备用。

实施例3：本实施例描述了本发明提供的扩增魔鬼弧菌特异性片段1反应条件。

(1)使用生工生物工程(上海)股份有限公司pfudna聚合酶配制如下反应体系：

(2)按下列条件进行反转录反应：

(3)上述反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，可扩增出较亮的目的条带(图1)。

实施例4：本实施例描述了本发明提供的扩增魔鬼弧菌特异性片段2反应条件。

(1)使用生工生物工程(上海)股份有限公司pfudna聚合酶配制如下反应体系：

(2)按下列条件进行反转录反应：

(3)上述反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，可扩增出较亮的目的条带(图1)。

实施例5：本实施例描述了本发明提供的同时扩增魔鬼弧菌特异性片段1和特异性片段2反应条件。

(1)使用生工生物工程(上海)股份有限公司pfudna聚合酶配制如下反应体系：

(2)按下列条件进行反转录反应：

(3)上述反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，可扩增出两条目的条带(图1)。

实施例6：本实施例描述了使用本发明试剂盒中单独进行魔鬼弧菌特异性片段1或单独进行魔鬼弧菌特异性片段2以及同时进行片段1和片段2扩增的特异性。

魔鬼弧菌在进化关系上与副溶血弧菌和溶藻弧菌非常接近。为了检测该专利所涉方法的特异性，本实施例检测了本方法的特异性。分别选取副溶血弧菌，溶藻弧菌，河口弧菌，溶藻希瓦氏菌，中间气单胞菌，嗜冷杆菌，大肠杆菌进行特异性实验。按实施例2描述的方法提取基因组dna，分别作为模板，按照实施例3、实施例4和实施例5进行pcr扩增反应。如图2所示，应用该方法可以从魔鬼弧菌中成功扩增出目的条带，并且条带单一，而副溶血弧菌和溶藻弧菌等菌种未扩增处任何条带，说明该方法具有良好的魔鬼弧菌扩增特异性。

序列表

<110>绍兴文理学院

<120>魔鬼弧菌pcr检测试剂盒

<130>2019.09.20

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

gcattaggcgcagaagttcg20

<210>2

<211>20

<212>dna

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<210>3

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