一种有效提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种有效提高浸矿优势菌嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法。

背景技术：

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(axidithiobacillusferrooxidans，简称a.ferrooxidans)，是专性化能自养，革兰氏阴性菌，能够固定二氧化碳、氧化亚铁离子、单质硫和还原性无机硫化合物获得能量，是第一个被发现的具有矿石氧化能力的微生物，同时也是浸矿微生物的优势菌株。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌独特的生理代谢机制使得该菌在生物冶金工业中得到广泛的应用和比较深入的研究。

近年来，生物冶金工业迅速发展，通过利用微生物回收重金属得到广泛应用，与传统的物理化学方法相比，在矿石加工冶炼提取有价金属的工业中使用微生物具有一些明显的优势。几乎无一例外，生物冶金更加环保、可持续，低成本，不需要在焙烧或熔炼过程中使用大量的能量并且不产生硫、二氧化碳或其他有害环境的气体，同时对于低品位矿和尾矿的处理具有明显的优势。然而，由于对微生物生长代谢的理解不充分，大多数生物冶金工厂远离微生物的最佳条件，限制了浸矿效率。因此，有必要研究提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的浸矿能力，以改善嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的工业应用，提高生产效率。

细菌密度感应系统(quorumsensing)是重要的代谢控制器和细胞间通讯系统，afei/r操纵子是嗜酸性氧化亚铁硫杆菌中的密度感应系统，涉及三个基因afer(afe_1997),orf3(afe_1998),afei(afe_1999)。但检索发现该密度感应系统基因(afer,orf3,afei)在矿石氧化浸出上的功能，或高表达对矿石的生物浸出的能力，以及通过过表达密度感应系统基因(afer,orf3,afei)的方法提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的策略的文献还未见有报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种有效提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法，以实现提高生物冶金工业的浸矿效率。

本发明所述的有效提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法，步骤是：

(1)以野生型a.ferrooxidansatccno.23270基因组序列设计用于扩增密度感应系统afei/r操纵子的引物；

qssen：ccgctcgaggggtacccgggaaaatgcgtcacgtc

qsant：tggactagtgctctagagagcagcccttcaaatggt

以野生型a.ferrooxidans基因组为模板，以qssen和qsant为引物，pcr扩增获得含有三个基因afer,orf3,afei的核苷酸序列如seqno.1所示的afei/r操纵子基因片段；将该基因片段连接到载体pjrd215上，随后将连接产物转化到大肠杆菌(e.coli)sm10中，挑选阳性克隆pcr和测序验证后获得重组质粒pjrd215-qs；

以含有重组质粒pjrd215-qs的大肠杆菌sm10为供体菌，以野生型a.ferrooxidans为受体菌，通过接合转移的方式将重组质粒pjrd215-qs转移进入a.ferrooxidans，获得同时增加afei/r操纵子三个基因afei,orf3,afer的拷贝数的重组工程菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)；

(2)将重组工程菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)与黄铁矿混合构成浸矿体系进行浸矿反应；其中所述重组工程菌种子液od600nm＝0.5～0.6，所述黄铁矿是粉碎成粒径小于0.5cm³的颗粒矿石，菌株种子液与矿石按1升比6±1千克的比例混合，采用静置堆浸方式，30±1℃培养8～20天，培养过程中可连续补料；

(3)浸矿反应中矿石表面侵蚀能力和浸出液中金属浸出能力的检测；其中，浸矿反应进行8天后取矿石经过固定，临界点干燥，脱水，喷金处理后，用扫描电子显微镜观察矿石表面侵蚀状况；浸矿反应进行15天后取浸出液过滤除去矿渣和菌体，使用icp-ms(电感耦合等离子体质谱仪)测定浸出液中元素的含量。

上述有效提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法中：所述重组工程菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)的构建以野生型a.ferrooxidansatccno.23270为基础，借助于自身启动子和dna正负链，实现了在互不影响的情况下同时增加afei,orf3,afer三个基因的拷贝数。

上述有效提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法中，优选的是实施方式是：所述重组工程菌种子液od600nm＝0.5，所述黄铁矿是粉碎成粒径小于0.5cm³的颗粒矿石，菌株种子液与矿石按1升比6千克的比例混合，采用静置堆浸方式，30℃培养15天。

实验证实：上述有效提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法中：所述浸矿反应进行8天后，扫描电子显微镜下重组工程菌处理的矿石表面凹凸不平，有明显的侵蚀痕迹。浸矿反应进行15天后，重组工程菌的矿石浸出液经过icp-ms测定显示各种金属(铜，锌，铁，砷，铬)的含量显著提高。

本发明公开了一种有效提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法，是发明人在国际上首次报道。发明人首次发现密度感应系统基因(afer,orf3,afei)在矿石氧化浸出上的功能，并且经过试验证实了密度感应系统的高表达对矿石的生物浸出有明显的优势，进一步利用重组菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)证实了其在浸矿过程中表现出惊人的优势，重组菌处理矿石获得的浸出液中，金属元素含量显著提高。本发明提供的提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法对提高生物冶金工业的浸矿效率具有巨大的理论价值，现实意义和广阔的开发应用前景。

附图说明

图1是重组质粒pjrd215-qs构建图。

图2是重组菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)的pcr验证图；

其中：泳道m为trans2kdnamaker(购买自济南雨同生物科技有限公司)；泳道1为重组菌基因组以km-r/qsant为引物的pcr结果；泳道2为野生型基因组以km-r/qsant为引物的pcr结果；泳道3为重组质粒pjrd215-qs以km-r/qsant为引物的pcr结果。

图3是重组菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)与对照a.ferrooxidans(pjrd215)浸出条件下的矿石表面在扫描电子显微镜下的照片；

其中：图a和c分别是在重组菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)浸出条件下的矿石使用扫描电子显微镜放大5000×倍和20000×的照片，图b和d分别是在对照菌株a.ferrooxidans(pjrd215)浸出条件下的矿石使用扫描电子显微镜放大5000×倍和20000×的照片。

图4是重组菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)与对照a.ferrooxidans(pjrd215)浸出液中各种金属(铜，锌，铁，锰，砷，铬)的含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

本发明实施例中所采用的pcr扩增，质粒提取、转化等基础分子生物学实验技术，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照相关产商提供的说明书执行。

本实施例所涉及的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌为市售菌株，优选a.ferrooxidansatccno.23270；表达质粒pjrd215构建参照(davisonetal.,1987)；e.colism10参照(liuetal.,2007)。

davison,j.,heusterspreute,m.,chevalier,n.,ha-thi,v.,andbrunel,f.(1987).vectorswithrestrictionsitebanks.v.pjrd215,awide-host-rangecosmidvectorwithmultiplecloningsites.gene51,275-280.

liu,x.,lin,j.,zhang,z.,bian,j.,zhao,q.,liu,y.,lin,j.,andyan,w.(2007).

constructionofconjugativegenetransfersystembetweene.coliandmoderatelythermophilic,extremelyacidophilicacidithiobacilluscaldusmth-04.journalofmicrobiologyandbiotechnology17,162-167.

实施例1重组菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)的构建

1、构建重组质粒pjrd215-qs

(1)设计引物，根据ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的a.ferrooxidansatccno.23270基因组序列设计用于扩增密度感应系统afei/r操纵子的引物；

序列信息如下：

qssen：ccgctcgaggggtacccgggaaaatgcgtcacgtc

(划线部分为kpni酶切位点)

qsant：tggactagtgctctagagagcagcccttcaaatggt

(划线部分为xbai酶切位点)

(2)基因组和质粒的提取：利用基因组提取和质粒提取试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)提取野生型a.ferrooxidans菌基因组和pjrd215质粒，备用。

(3)pcr扩增获得目的片段

以a.ferrooxidans基因组为模板，以qssen和qsant为引物，pcr扩增获得含有三个基因的afei/r操纵子基因片段；

上述pcr扩增条件是：预变性95℃3min；95℃15sec；退火58℃15sec；延伸72℃1min/1kb；30个循环；72℃延伸5min；12℃保温。

pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果。

afei/r序列大小为2175bp(核苷酸序列如seqno.1所示)，目的基因产物纯化利用dna纯化回收试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)，具体实验操作按照试剂盒说明书进行。

(4)重组质粒pjrd215-qs的构建：

重组质粒构建过程按照酶切-连接-转化-验证步骤依次进行。首先用限制性内切酶kpni和xbai分别对回收的目的pcr产物和质粒载体pjrd215进行双酶切，利用dna纯化回收试剂盒分别回收酶切后的目的基因片段和质粒片段，然后用t4连接酶连接两个酶切dna片段，将目的基因片段连接到载体pjrd215上，随后将连接产物转化到大肠杆菌(e.colism10)中，挑选阳性克隆pcr验证正确后送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证，获得碱基序列的完全正确的重组质粒pjrd215-qs。

2、重组工程菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)的构建

以含有重组质粒的大肠杆菌sm10为供体菌，以野生型a.ferrooxidans为受体菌，通过接合转移的方式将重组质粒pjrd215-qs转移进入a.ferrooxidans，获得重组工程菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)，实现同时增加afei/r操纵子三个基因(afei,orf3,afer)的拷贝数。

重组菌pcr验证如图2，以kmr/qsant为引物pcr验证只有含有重组质粒pjrd215-qs的重组菌株和重组质粒的能够扩增出3733bp的条带(泳道1和3)，野生型菌株pcr扩增不出条带(泳道2)。

kmr：ataccgtaaagcacgaggaag

qsant：tggactagtgctctagagagcagcccttcaaatggt。

实施例2重组菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)和对照a.ferrooxidans(pjrd215)矿石表面侵蚀能力的比较测定

矿石选用黄铁矿，产自中国广东省云浮市。矿石使用前加工破碎成大小小于0.5cm³的颗粒。重组菌与对照菌株的初始接种量都为od600nm＝0.5，加入等量的黄铁矿，30℃，静置培养，八天后分别取重组菌与对照菌培养下的矿石经过固定，临界点干燥，脱水，喷金处理后，用扫描电子显微镜观察矿石表面侵蚀状况。

矿石表面如图3，重组菌培养下的矿石表面沟壑纵横，凹凸不平，低放大倍数的矿石表面整体情况与20000倍放大下的局部均显示了表面被重组菌侵蚀溶解的状况。对照菌培养下的矿石表面平整，光滑，显示了重组菌对矿石的侵蚀能力明显高于对照菌株。

实施例3重组菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)和对照a.ferrooxidans(pjrd215)金属浸出能力的比较测定

重组菌与对照菌株的初始接种量都为od600nm＝0.5，加入等量的加工破碎成大小小于0.5cm³的黄铁矿，30℃，静置培养，15天后取浸出液过滤除去矿渣和菌体，使用icp-ms(电感耦合等离子体质谱仪)测定浸出液中元素的含量。

浸出液中各元素的含量如图4，重组菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)处理矿石的浸出液中铜，锌，铁，砷，铬的含量菌显著高于对照菌株处理矿石的浸出液。

综合上述的结果，可以看出：本发明提供的重组工程菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)与对照a.ferrooxidans(pjrd215)相比，对矿石表面的侵蚀有明显的优势，进一步证实在矿石生物浸出过程中，重组工程菌a.ferrooxidans(pjrd215-qs)处理矿石获得的浸出液中金属元素显著高于对照菌株。

序列表

<110>山东大学

<120>一种有效提高嗜酸性氧化亚铁硫杆菌浸矿能力的方法

<141>2019-10-24

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2175

<212>dna

<213>人工序列

<221>afei/r核苷酸序列

<222>（1）…（2175）

<400>1

cgggaaaatgcgtcacgtcagcgtgtggacaaggccccggccattggttatctcacggcg60

agtgcactggtcgccaccattggcgacgcgaggaacttttcatggccaggggaaactccg120

cctgccagagcgatcacgacagcaacccgagcatcgccgcctgcaatacggcggcggtct180

tgttgacggcgttcagcttggccatggccttgctgatgtgaaaattgaccgtgcgctccg240

taatattaaggatattggcgatttcaccggaggtcttgccctcgccggtccagcgcagca300

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cgcggatcatgctgagatggacagcttggaccaaccacaggatatggcaggcctttgctt420

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