本发明涉及一种多维复合交联透明质酸凝胶的制备方法及所得产品和应用，属于医学美容和生物医疗
技术领域：
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背景技术：
：透明质酸(hyaluronicacid，ha)又名玻尿酸，是由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖交替排列构成的长链高分子，具有良好的亲水性、黏弹性、润滑性和生物相容性，并且已经在医学领域得到广泛的应用，如包括眼科黏弹性手术、关节炎治疗、防止术后组织粘连、药物缓释等。由于天然ha存在稳定性差、对透明质酸酶及自由基敏感、在体内保留时间短、在水体系中缺乏力学强度等缺点，限制了它在生物医学领域的发展应用，因此有必要对其进行结构修饰，以提高其力学强度和抗降解性能、获得新的生物活性和功能性的ha交联衍生物、进一步开发新型医用生物材料，如新型软组织填充材料、组织工程支架材料、新型药物靶向材料。通过多样的化学修饰和交联反应可以改变ha凝胶的物理和化学性能，以达到预期目的。对ha的修饰不外乎以下两种：1)交联，2)在ha上修饰上一些基团。交联的目的是使ha分子量和分子体积显著增大，形成连续的网状结构，在水中可溶胀但不再溶解。与天然ha凝胶相比，交联ha凝胶衍生物在物理和化学性能上均有明显的提升，并且保持了良好的生物相容性和生物可降解性。目前常用的交联方法是将透明质酸钠和交联剂，如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)、1,2,7,8-二环氧辛烷(deo)和二乙烯基砜(dvs)等，在碱性条件下交联，区别主要在于ha与交联剂的比例及交联反应条件，通过这些条件一定程度上控制交联度。这类型的现有技术较多，如下：公开号为cn104771331b的专利公开了一种透明质酸弹性体的制备方法，其步骤为(1)将透明质酸与交联剂反应，得到交联透明质酸钠凝胶a；(2)取交联透明质酸钠凝胶a，选择不同孔径的筛网分别制粒，得粒径不同的凝胶b和c；(3)将凝胶b和c混合，再次进行交联反应，调节ph值至中性，透析，得透明质酸弹性体。此方法中凝胶b和凝胶c实际为同一种交联凝胶，仅粒径不同，混合后再次反应，交联维度单一。公开号为cn104086788a的专利公开了一种注射用修饰透明质酸钠凝胶的制备方法，分别在ph值>10和ph>9的碱性条件下制备凝胶x和y，然后将二者混合再次交联。此方法中凝胶x和凝胶y均为碱性交联产物，反应机理及点位均相同，仅通过控制交联剂用量使得交联度不同，机械性能较差，且该工艺中最终混合交联仍需加入交联剂，交联剂用量较大。公开号为cn106589424a的专利公开了一种注射用交联透明质酸钠及其制备方法，其步骤为：(1)第一部分透明质酸溶解在含有交联剂的naoh溶液中，混匀，交联得凝胶1；(2)将第二部分透明质酸溶解在含有交联剂的naoh溶液中，混匀后，再与凝胶1混匀交联,交联完成后调节ph至中性、透析，得到注射用交联透明质酸凝胶。该方法采用两步碱性交联，所得产品机械性能较差，且其交联剂用量为透明质酸质量的2％-15％，交联剂用量较大。公开号为cn103055353a的专利公开了一种手术用防粘连膜的制备方法，步骤为：(1)将透明质酸钠与羟乙基纤维素或羟丙基纤维素或羧甲基纤维素溶于去离子水中，配制成溶液，调节ph值10～12，得碱性溶液；(2)向碱性溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚，搅拌均匀，40～50℃反应；(3)调节反应液ph值至2～5，倒入模具中流延成型，40～50℃反应，并干燥成膜。该专利中碱性交联和酸性交联均在同一体系中进行，所得薄膜柔韧性和机械性能适合手术中防粘连使用，但是其粘弹性和抗酶解性能差。公开号为cn106279728a的专利公开了一种多相混合衔接交联透明质酸制备方法，该方法在低温碱性条件让透明质酸原料和交联剂进行浸润缓慢交联反应，而后在高温碱性条件下活化持续交联反应，然后再经过中和酸碱反应，酸性条件下持续交联反应。这样一步步衔接性交联反应，能使透明质酸分子间及分子内链接更充分，交联反应更彻底，交联剂残留更低，交联凝胶分子间三维空间更大，凝胶弹性更结实，皮下修复效果更好、保存时间更长。但是该方法碱性交联后直接调节体系ph进行酸性交联，反应体系ph不均匀，反应体系中心和表层ph相差较大，反应进程无法一致，反应体系的交联均匀性无法得到保证，所得产品的抗降解能力差异较大。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种多维复合交联透明质酸凝胶的制备方法及所得产品，该方法先在酸性和碱性条件下分别交联得到交联方向不同的两种凝胶，后将这两种凝胶经过低温反应进一步交联，降低了透明质酸降解及发生副反应的可能性，减少了交联剂的使用，所得产品无交联剂残留，通过反应条件的选择可以调控所得产品的内聚性、黏弹性、填充能力和抗降解能力，满足不同的需求。本发明的另一目的是提供上述多维复合交联透明质酸凝胶的应用，与未交联透明质酸相比，该产品具有很好的内聚性、黏弹性、抗降解性和组织填充性，具有优异的皮肤组织填充、填充塑形能力，又可以显著延长在体内的降解周期，在化妆品、关节腔注射液、组织填充剂中有广泛的应用前景。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种多维复合交联透明质酸凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)透明质酸或其盐在高温碱性环境下进行交联，得凝胶i；(2)透明质酸或其盐在高温酸性环境下进行交联，得凝胶ii；(3)将凝胶i和凝胶ii在低温下混合并交联，得凝胶iii；(4)将凝胶iii透析、制粒，得多维复合交联透明质酸凝胶。进一步的，本发明多维复合交联透明质酸凝胶中的“多维”指的是透明质酸或其盐在多个维度上进行交联，所述“复合”指的是不同交联得到的凝胶i和凝胶ii的复合。进一步的，本发明上述方法中，通过控制透明质酸或其盐的分子量、交联温度、交联时间、交联剂用量、交联ph、凝胶i与ii的质量比等条件可以调控最终所得多维复合交联透明质酸凝胶的内聚性、黏弹性、抗降解性和组织填充性，满足不同的使用需求。通过对这些条件的优化，可以得到内聚性高、黏弹性高、抗降解能力强和组织填充塑形能力好的产品，在组织填充塑形领域有很好的应用前景。进一步的，步骤(1)中，所述透明质酸或其盐的分子量优选为50万-350万道尔顿。所述透明质酸盐可以是透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐，常用的为钠盐。进一步的，步骤(1)中，所述高温指的是35～65℃，即交联温度为35～65℃。一般的，交联时间为0.5～12小时。通过控制交联温度和时间，可以控制凝胶i的交联度，该交联温度和时间可以保证交联反应的高效进行，且避免ha原料发生较强的高温碱降解。进一步的，步骤(1)中，交联在交联剂存在下进行，交联剂与透明质酸或其盐的质量比优选为0.003-0.1：1。通过控制交联剂的用量，可以调控交联的程度。所用交联剂没有特殊要求，可以是现有技术中报道的任意可以用于透明质酸交联的交联剂，例如二乙烯基砜、二缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷、1,3-二环氧丁烷和三偏磷酸钠中的一种或多种。进一步的，步骤(1)中，交联在ph值为9～13的碱性环境下进行，所述碱性环境由碱提供。所述碱可以是现有技术中报道的任意可以用于透明质酸交联的碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、季铵碱等，常用的为氢氧化钠。交联时，碱以水溶液的形式存在，将透明质酸或其盐、交联剂溶于碱的水溶液中进行交联反应。进一步的，步骤(1)中，透明质酸或其盐与碱液的质量比为1：2～40。通过控制碱液的用量，可以控制反应体系的碱含量及底物浓度，在此范围内，可以有效调节交联度，以得到满足不同要求的凝胶i。进一步的，步骤(2)中，所述透明质酸或其盐的分子量优选为50万-350万道尔顿，步骤(1)和(2)中透明质酸或其盐的分子量可以相同，也可以不同。所述透明质酸盐可以是透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐，常用的为钠盐。进一步的，步骤(2)中，所述高温指的是35～65℃，即交联温度为35～65℃。一般的，交联时间为0.5～12小时。通过控制交联温度和时间，可以控制凝胶ii的交联度，该交联温度和时间可以保证交联反应的高效进行，且不会使ha原料发生较强的高温酸降解。进一步的，步骤(2)中，交联在交联剂存在下进行，交联剂与透明质酸或其盐的质量比优选为0.003-0.1：1。通过控制交联剂的用量，可以调控交联的程度。所用交联剂没有特殊要求，可以是现有技术中报道的任意可以用于透明质酸交联的交联剂，例如二乙烯基砜、二缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷、1,3-二环氧丁烷和三偏磷酸钠中的一种或多种。进一步的，步骤(2)中，交联在ph值为3～5的酸性环境下进行，所述酸性环境由酸提供，所述酸可以是无机酸，也可以是有机酸。优选的，所述酸为冰乙酸。交联时，酸以水溶液的形式存在，将透明质酸或其盐、交联剂溶于酸的水溶液中进行交联反应。进一步的，步骤(2)中，透明质酸或其盐与酸液的质量比为1：2～40。进一步的，步骤(3)中，将步骤(1)和(2)得到的凝胶i和凝胶ii混合后再在低温下进行交联。此步骤(3)的交联无须再额外加入交联剂，混合后调整温度可以直接进行交联，这是因为在前两步反应过程中有交联剂存在在凝胶i和凝胶ii，此部分交联剂可以继续在步骤(3)中发挥作用。进一步的，步骤(3)中，所述低温指的是5～35℃，即交联温度为5～35℃，步骤(3)的交联温度均低于步骤(1)和(2)的交联温度。一般的，交联时间为2-48小时。较低的交联温度能有效降低ha原料的高温降解，控制适当的交联时间，能准确控制交联反应进程，又能有效反应掉残留的交联剂。进一步的，步骤(3)中，凝胶i与凝胶ii的质量比为1:5～5:1。通过控制此质量比可以控制碱性交联凝胶与酸性交联凝胶在低温交联反应中的配比，以控制最终产品的粘弹性与内聚性。进一步的，步骤(4)中，将形成的凝胶iii进行透析、制粒，得到纯度高的、所需粒度的产品。进一步的，还可以在制粒后包括灌装和灭菌的步骤，得到可以直接市售的产品。透析可以采用常规的透析方法进行，用水或pbs对凝胶iii进行透析，以除去其中的交联剂以及小分子物质，制粒可以采用不同粒径的筛网进行，将凝胶iii过筛网，即可得到所需粒径的产品。进一步的，本发明还提供了一种具体的多维复合交联透明质酸凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)将透明质酸或其盐溶解在混有交联剂的碱液中，控制温度35～65℃，时间为0.5～12小时，进行高温碱性交联，得凝胶i。(2)将透明质酸或其盐溶解在混有交联剂的酸液中，控制温度35～65℃，时间为0.5～12小时，进行高温酸性交联，得凝胶ii。(3)将凝胶i和凝胶ii混匀，控制温度5～35℃，时间为2-48小时，进行低温混合交联，得凝胶iii。(4)将凝胶iii透析、制粒、灌装、灭菌，得多维复合交联透明质酸凝胶成品。进一步的，通过反应步骤和反应条件的设计，按照上述方法得到的多维复合交联透明质酸凝胶内聚性、黏弹性、抗酶解性、组织填充性等性能均较佳，与现有技术中公开的产品存在较大的差异。因此，按照上述方法所得的产品也在保护范围之内。该多维复合交联透明质酸凝胶为无色透明凝胶，或为含透明或半透明颗粒的粘稠混悬液。进一步的，本发明还提供了该多维复合交联透明质酸凝胶在化妆品、关节腔注射液、组织填充剂等中的应用，尤其是本发明产品具有优异的黏弹性和抗酶解性能，在满足皮肤组织填充所要求的塑形、除皱的前提下，还能有效延长其在体内的维持时间，因此可以作为组织填充剂广泛用于医美领域。本发明在酸性和碱性条件下交联，分别形成一个交联方向，然后将两个不同交联方向形成的凝胶经过低温反应进一步交联，整个工艺过程缩短了高温交联的时间，降低了较高温度下透明质酸降解及发生副反应的可能性，也减少了交联剂的使用，使反应体系混合更为均匀，所得产品性能更稳定。所得多维复合交联透明质酸凝胶具有优异的黏弹性、抗酶解性能、和内聚性，可以用于化妆品、关节腔注射液、组织填充剂中。尤其是，该产品组织填充塑形能力优异，在满足皮肤组织填充所要求的塑形、除皱的前提下，还能有效延长其在体内的维持时间，在医美领域具有广泛的应用前景。具体实施方式为更好地理解本发明，下面结合具体实施例进一步说明，实施例的描述旨在揭示本发明的原理、主要特征和优势，但不用来限制本发明的范围。实施例1考察高温交联温度按照以下步骤制备多维复合交联透明质酸凝胶：(1)将0.032g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于20gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入4g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度：甲35℃、乙50℃及丙65℃，分别反应2h得凝胶i。(2)将0.048g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于16gph值为3～5的冰乙酸溶液中，混合均匀后加入4g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度：a35℃、b55℃及c65℃，分别反应2h得凝胶ii。(3)将三种凝胶i和三种凝胶ii按质量比1:1混合均匀，控制反应温度20℃，反应20h得凝胶iii。(4)将凝胶iii切块，经pbs透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得多维复合交联透明质酸凝胶，各凝胶命名规则见下表1。表1实施例1命名规则实施例凝胶i凝胶ii实施例1-1甲a实施例1-2甲b实施例1-3甲c实施例1-4乙a实施例1-5乙b实施例1-6乙c实施例1-7丙a实施例1-8丙b实施例1-9丙c实施例2考察高温交联时间按照以下步骤制备多维复合交联透明质酸凝胶：(1)将0.032g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于20gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入4g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度为50℃，分别反应：甲0.5h、乙2h及丙12h，得凝胶i。(2)将0.048g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于16gph值为3～5的冰乙酸溶液中，混合均匀后加入4g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度为55℃，分别反应：a0.5h、b2h及c12h得凝胶ii。(3)将三种凝胶i和三种凝胶ii按质量比1:1混合均匀，控制反应温度20℃，反应20h得凝胶iii。(4)将凝胶iii切块，经pbs透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得多维复合交联透明质酸凝胶，各凝胶命名规则见下表2。表2实施例2命名规则实施例凝胶i凝胶ii实施例2-1甲a实施例2-2甲b实施例2-3甲c实施例2-4乙a实施例2-5乙b实施例2-6乙c实施例2-7丙a实施例2-8丙b实施例2-9丙c实施例3考察交联剂用量按照以下步骤制备多维复合交联透明质酸凝胶：(1)分别将1,4-丁二醇二缩水甘油醚：甲0.006g、乙0.016g、丙0.2g溶于10gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度50℃，反应2h得凝胶i。(2)分别将1,4-丁二醇二缩水甘油醚：a0.006g、b0.028g、c0.2g溶于8gph值为3～5的冰乙酸溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度55℃，反应2h得凝胶ii。(3)将三种凝胶i和三种凝胶ii按质量比1:1混合均匀，控制反应温度20℃，反应20h得凝胶iii。(4)将凝胶iii切块，经pbs透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得多维复合交联透明质酸凝胶，各凝胶命名规则见表3。表3实施例3命名规则实施例4考察碱液与酸液用量(1)将0.016g1,4-丁二醇二缩水甘油醚分别溶于：甲10g、乙40g、丙80gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度50℃，反应2h得凝胶i。(2)将0.024g1,4-丁二醇二缩水甘油醚分别溶于：a8g、b40g、c80gph值为3～5的冰乙酸溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度55℃，反应2h得凝胶ii。(3)将三种凝胶i和三种凝胶ii按质量比1:1混合均匀，控制反应温度20℃，反应20h得凝胶iii。(4)将凝胶iii切块，经pbs透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得多维复合交联透明质酸凝胶，各凝胶命名规则见表4。表4实施例4命名规则实施例凝胶i凝胶ii实施例4-1甲a实施例4-2甲b实施例4-3甲c实施例4-4乙a实施例4-5乙b实施例4-6乙c实施例4-7丙a实施例4-8丙b实施例4-9丙c实施例5考察低温交联温度按照以下步骤制备多维复合交联透明质酸凝胶：(1)将0.016g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于10gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度50℃，反应2h得凝胶i。(2)将0.024g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于8gph值为3～5的冰乙酸溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度55℃，反应2h得凝胶ii。(3)将凝胶i和凝胶ii按质量比1:1混合均匀，控制反应温度分别为：5℃、20℃及35℃，反应20h得凝胶iii。(4)将凝胶iii切块，经pbs透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得多维复合交联透明质酸凝胶，5℃所得凝胶命名为实施例5-1，20℃所得凝胶命名为实施例5-2，35℃所得凝胶命名为实施例5-3。实施例6考察低温交联时间按照以下步骤制备多维复合交联透明质酸凝胶：(1)将0.016g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于10gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度50℃，反应2h得凝胶i。(2)将0.024g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于8gph值为3～5的冰乙酸溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度55℃，反应2h得凝胶ii。(3)将凝胶i和凝胶ii按质量比1:1混合均匀，控制反应温度20℃，反应时间分别为2h、20h及48h，得凝胶iii。(4)将凝胶iii切块，经pbs透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得多维复合交联透明质酸凝胶，2h所得凝胶命名为实施例6-1，20h所得凝胶命名为实施例6-2，48h所得凝胶命名为实施例6-3。实施例7考察低温反应凝胶i与凝胶ii质量比(1)将0.032g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于20gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入4g分子量分别为：a、200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度50℃，反应2h得凝胶i。(2)将0.048g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于16gph值为3～5的冰乙酸溶液中，混合均匀后加入4g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度55℃，反应2h得凝胶ii。(3)将凝胶i和凝胶ii分别按质量比1:5、1:1、5:1混合均匀，控制反应温度20℃，反应20h得凝胶iii。(4)将凝胶iii切块，经pbs透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得多维复合交联透明质酸凝胶，质量比1:5所得凝胶命名为实施例7-1，质量比1:1所得凝胶命名为实施例7-2，质量比5:1所得凝胶命名为实施例7-3。实施例8考察透明质酸钠原料分子量(1)将0.032g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于20gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入4g分子量为：a50万道尔顿、b150万道尔顿、c250万道尔顿、d350万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度50℃，反应2h得凝胶i。(2)将0.048g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于16gph值为3～5的冰乙酸溶液中，混合均匀后加入4g分子量分别为：甲50万道尔顿、乙150万道尔顿、丙250万道尔顿、丁350万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度55℃，反应2h得凝胶ii。(3)将三种凝胶i和三种凝胶ii分别按质量比1:1混合均匀，控制反应温度20℃，反应20h得凝胶iii。(4)将凝胶iii切块，经pbs透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得多维复合交联透明质酸凝胶，各凝胶命名规则见表5。表5实施例8命名规则实施例凝胶i凝胶ii实施例8-1a甲实施例8-2b乙实施例8-3c丙实施例8-4d丁对比例1参照cn106589424a的方法制备凝胶，步骤如下：(1)将0.016g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于10g1％的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度50℃，反应2h得凝胶i。(2)将0.024g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于8g1％的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，加入凝胶i混合均匀，控制反应温度55℃，反应2h得凝胶ii。(3)将凝胶ii调节ph至中性，然后在pbs中透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得凝胶产品。对比例2(1)将0.016g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于10gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度50℃，反应2h得凝胶i。(2)将凝胶i的ph用冰乙酸调整至3-5，再加入0.024g1,4-丁二醇二缩水甘油醚和2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度55℃，反应2h得凝胶ii。(3)将凝胶ii在20℃反应20h得凝胶iii。(4)将凝胶iii切块，经pbs透析，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得凝胶产品。对比例3按照以下步骤制备多维复合交联透明质酸凝胶：(1)将0.016g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于10gph值为9～13的氢氧化钠溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度50℃，反应2h得凝胶i。(2)将0.024g1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶于8gph值为3～5的冰乙酸溶液中，混合均匀后加入2g分子量为200万道尔顿的透明质酸钠(以纯品计)，混合均匀至凝胶清澈透明，控制反应温度55℃，反应2h得凝胶ii。(3)将凝胶i和凝胶ii按质量比1:1混合均匀，控制反应温度50℃，反应20h得凝胶iii。(4)将凝胶iii经pbs纯化，60目不锈钢筛网制粒，灌装、灭菌，得凝胶产品。按照国家及行业相关标准对上述实施例制得的产品进行渗透压、重金属残留、蛋白质含量、细菌含量等相关检测，各凝胶产品均符合要求。为了进一步验证本发明产品的优异性能，在相同条件下，从黏弹性、内聚性及体外降解等方面对实施例和对比例的产品性能进行研究，同时以目前市面上应用最为广泛的restylane、润百颜、海薇和juvédermultra作为对照。其中，restylane、润百颜、海薇属于双相产品，juvédermultra属于单相产品。restylane来自瑞典q-medab公司，润百颜来自华熙生物科技股份有限公司，海薇来自上海昊海生物科技股份有限公司，juvédermultra来自艾尔建信息咨询(上海)有限公司。黏弹性用haakers6000(赛默飞世尔科技(中国)公司)仪器测定，转子：p20til；gap值：1.00mm；温度：25℃；测定模式：cd振荡频率扫描；应力：1％；频率范围：0.01～1hz。记录0.1hz时的弹性模量(g’)和粘性模量(g”)。测试结果如下表5所示：表5部分市售产品、实施例产品及对比例产品黏弹性测试结果从上表结果可以看出，目前市售的四种产品中，单相产品的黏弹性都远低于双相产品，而本发明通过反应条件的调整可以得到黏弹性与市售的单相、双相产品类似或处于它们中间的产品，也可以得到黏弹性高于或低于目前市售产品的产品，产品可控性强，可以满足不同需求。内聚性取1g各ha凝胶样品，分别加入0.1mg甲苯胺蓝，混合3min进行染色，将染好色的ha凝胶灌装入1ml预灌封注射器中。以400mm/min的固定速度将凝胶推注到装有700ml纯化水的烧杯中，设定磁力搅拌速度为160rpm。以凝胶进入水中为0秒计，各ha凝胶挤出后开始录像和拍照，拍照时间点为开始后15s，70s，95s，每个样品每个时间点拍三张，按照表6进行评分。评分结果见表7。表6内聚性评分标准内聚性评分描述1完全分散2大部分分散3部分分散，部分凝聚4大部分凝聚5完全凝聚表7内聚性评分结果从上表结果可以看出，市售的4种产品中，单相产品的内聚性优于双相产品。使用本发明方法，可以通过控制反应参数，得到内聚性不同的产品。体外降解我们研究了市售产品、实施例及对比例样品的体外降解情况，取适量各ha凝胶样品(约含ha8mg)，置于西林瓶中，分别加入ha酶(酶活600iu/ml)4ml，涡旋混匀。42℃水浴振摇，每10min取样50μl并适当稀释，在232nm下测吸光度，直至吸光度不再变化，认为降解完全，记录完全降解所用时间。各样品体外降解实验结果如下表8所示：表8体外降解时间凝胶体外降解实验虽然不能完全反映凝胶体内的维持时间，但是对预测体内维持时间具有一定的指导意义，同时对医生使用透明质酸酶及时解决不良反应具有重要的参考价值。从上表数据可以看出，本发明产品体外抗降解能力优于目前市售产品和对比例产品。根据体外降解数据可以推断，使用本发明方法制备的产品在体内降解周期可大于12个月。综上，本发明方法可以制得具有优异黏弹性、内聚性及抗酶解能力的多维复合交联透明质酸凝胶，也可以定向调整产品的某一特性以满足不同消费者的不同需求。本发明所得产品满足组织填充所要求的理化性能和生物相容性，更保证了凝胶在体内的存留时间。该凝胶采用医药级透明质酸或其盐，各项指标均满足国家及行业相关标准，是一种非常理想的组织填充剂。当前第1页1 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