小麦TaMADS6基因在调控植物穗和籽粒发育以及开花时间中的应用的制作方法

本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及小麦tamads6基因在调控植物穗和籽粒发育以及开花时间中的应用。

背景技术：

小麦作为一种重要的粮食作物，全世界约有40％的人以小麦为主要粮食。同时小麦作为三大谷物之一，产量几乎全做食用，是世界上总产量仅次于玉米的粮食作物。随着消费水平的提高，对小麦的产量和品质也提出了更高的要求。小麦产量构成的三要素为单位面积穗数、穗粒数和粒重，三者关系的相互协调，在提高小麦产量方面具有重要的意义。其中，穗粒数取决于小穗数和小花的发育，因此对小麦穗早期的发育的研究具有重要的意义。

mads-box基因家族是在进化上十分保守，在植物生长发育过程中起重要作用的一类基因。植物mads-box家族主要包括i型和ii型两种类型，其中，i型mads-box蛋白根据mads-box功能域的保守关系又可以分为mα、mβ和mγ三类。目前为止，i型mads-box基因的研究相对较少，它们的功能主要集中在雌配子体、胚和胚乳的发育。目前研究最多的是ii型mads-box蛋白，ii型mads-box蛋白又可以分为mikcc型和mikc*型。ii型mads-box基因有四个功能域：mads(m)结构域、intervening(i)结构域、coiled-coilkeratin-like(k)结构域和c-terminus(c)结构域。其中，m结构域最保守，具有结合carg-box并调控下游基因的作用。i结构域保守性较弱，能促进蛋白二聚体的形成和蛋白二聚体与dna的结合。k结构域的保守性仅次于m结构域，蛋白间的互作主要通过k结构域，k结构域又可分为k1、k2和k3结构域，其中k3结构域是最重要的。c结构域保守性最弱，是mads-box基因的转录激活区域。然而，目前为止，tamads6在小麦中的功能研究和生产应用研究却少有报道。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供小麦tamads6基因在调控植物穗和籽粒发育以及开花时间中的应用。

本发明发现小麦tamads6(氨基酸序列分别如seqidno.1-3所示，cds序列分别如seqidno.4-6所示)与植物的花、穗和籽粒的发育相关，提高植物中tamads6的表达量，能够延迟小麦的开花时间，显著提高小麦的小穗数和籽粒数。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供tamads6蛋白或其编码基因或含有tamads6蛋白的编码基因的生物材料在调控植物穗发育中的应用。

第二方面，本发明提供tamads6蛋白或其编码基因或含有tamads6蛋白的编码基因的生物材料在调控植物籽粒发育中的应用。

第三方面，本发明提供tamads6蛋白或其编码基因或含有tamads6蛋白的编码基因的生物材料在调控植物开花时间中的应用。

第四方面，本发明提供tamads6蛋白或其编码基因或含有tamads6蛋白的编码基因的生物材料在植物遗传育种中的应用。

第五方面，本发明提供tamads6蛋白或其编码基因或含有tamads6蛋白的编码基因的生物材料在植物种质资源改良中的应用

具体地，上述应用中，通过提高所述植物中tamads6蛋白的表达量和/或活性，提高植物的小穗数、小穗轴数或穗粒数，或者延迟植物的开花时间。

本发明中，所述tamads6蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的氨基酸序列；

(2)如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)在如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的氨基酸序列的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白；

(4)与如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少95％；更优选为99％。

上述如seqidno.1所示的氨基酸序列为位于小麦6a染色体上的小麦tamads6蛋白(tamads6-a)的氨基酸序列，seqidno.2所示的氨基酸序列为位于小麦6b染色体上的小麦tamads6蛋白(tamads6-b)的氨基酸序列，seqidno.3所示的氨基酸序列为位于小麦6d染色体上的小麦tamads6蛋白(tamads6-d)的氨基酸序列，本领域技术人员可根据小麦tamads6蛋白的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与小麦tamads6蛋白具有相同功能的tamads6蛋白突变体。

上述在n端和/或c端连接标签中，所述标签包括但不限于myc标签、flag标签、ha标签、his标签等。

本发明中，所述tamads6蛋白的cds序列具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如seqidno.4、seqidno.5或seqidno.6所示的核苷酸或其互补序列；

(2)如seqidno.4、seqidno.5或seqidno.6所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

上述如seqidno.4所示的核苷酸序列为位于小麦6a染色体上的tamads6蛋白的cds序列，seqidno.5所示的核苷酸序列为位于小麦6b染色体上的tamads6蛋白的cds序列，seqidno.6所示的核苷酸序列为位于小麦6d染色体上的tamads6蛋白的cds序列。考虑到密码子的简并性，所有编码tamads6蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

本发明中，所述生物材料包括表达盒、载体、宿主细胞、工程菌、转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官、转基因植株、所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物或所述组织培养物产生的原生质体。

第六方面，本发明提供一种调控植物穗、籽粒发育或开花时间的方法，包括：调控所述植物中tamads6蛋白的表达量和/或活性；所述tamads6蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的氨基酸序列；

(2)如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)在如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的氨基酸序列的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白；

(4)与如seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少95％；更优选为99％。

优选地，上述方法中，通过提高所述植物中所述tamads6蛋白的表达量和/或活性，提高植物的小穗数、小穗轴数或穗粒数，或者延迟所述植物的开花时间。

所述提高植物中所述tamads6蛋白的表达量可通过本领域常规技术手段实现，例如：在所述植物中导入携带所述tamads6蛋白的编码基因的表达载体。

所述携带tamads6蛋白的编码基因的表达载体可为携带tamads6蛋白的编码基因的pcambia3300-ubi-mcs载体(pcambia3300-ubi-mcs载体为以pcambia3300载体为骨架，在其多克隆位点前加入玉米的ubiquition启动子，抗除草剂bar基因由35s启动子驱动)。

本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物包括但不限于小麦、拟南芥、水稻、玉米等。

第七方面，本发明提供tamads6基因的特异性扩增引物，其序列如seqidno.7-8所示，或如seqidno.9-10所示。

第八方面，本发明提供tamads6基因的检测引物，其序列如seqidno.12-13所示。如seqidno.12-13所示的引物可用于tamads6基因过表达转基因植株的鉴定。

本发明的有益效果在于：

本发明发现tamads6蛋白具有调控植物开花、穗和籽粒发育的功能，提高植物中tamads6蛋白的表达量，植物的小穗数、小穗轴数和穗籽粒数显著提高，开花时间明显延迟。本发明通过在小麦中过表达tamads6构建得到的3个转基因植株的开花时间分别推迟21天、16天和4天，小穗数分别提高27.72％、20.09％和8.81％，每穗籽粒数分别提高31.03％、26.47％和17.75％。本发明发现的tamads6的新功能具有较高的应用价值，为培育高产植物提供了基因资源和新思路，tamads6可应用于小麦遗传育种和种质资源改良，对农业生产具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中pahc25中间载体的质粒图谱。

图2为本发明实施例2中pcambia3300-ubi-mcs过表达载体的质粒图谱。

图3为本发明实施例3中tamads6-d转化fielder的t3代阳性植株的鉴定；其中，m代表marker，wt代表野生型fielder，1-10代表不同的t3代植株，所用模板为三叶期幼苗的dna，扩增产物为约700bp的条带的转基因植株是阳性植株。

图4为本发明实施例3中tamads6-d过表达转基因植株中tamads6-d表达量检测结果；其中，fielder代表野生型，oe-l1、oe-l22和oe-l6代表tamads6-d过表达小麦t3代植株；tamads6代表tamads6-d基因，tatubulin代表内参基因。

图5为本发明实施例3中fielder和tamads6-d过表达转基因植株的开花表型及其统计结果；其中，a为生长表型；b为开花时间统计结果；c为抽穗期野生型和过表达植株中tavrn3基因的表达量检测；fielder表示野生型，oe-l1、oe-l22和oe-l6表示tamads6-d过表达小麦t3代植株；*代表差异显著，**代表差异极显著。

图6为本发明实施例3中fielder和tamads6-d过表达转基因植株的小穗数及每穗籽粒表型结果，其中，a为小穗数表型；b为每穗小穗数统计结果，c为每穗小穗轴数统计结果；d为每穗籽粒数表型；e为每穗籽粒数统计结果；fielder表示野生型，oe-l1、oe-l22和oe-l6表示tamads6-d过表达小麦t3代植株；*代表差异显著，**代表差异极显。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1pahc25-6*myc-tamads6-d中间载体的构建

为构建小麦tamads6-d基因的过表达载体，首先将tamads6-d基因连接于pahc25-6*myc载体(pahc25-6*myc是通过pahc25改造的载体，将pahc25中的gus序列替换为6*myc序列，pahc25的质粒图谱如图1所示)，构建中间载体pahc25-6*myc-tamads6-d，具体方法如下：

(1)使用序列如seqidno.7和seqidno.8所示的引物以小麦组织的cdna为模板扩增带有spei和saci酶切位点的tamads6-d片段，使用胶回收试剂盒回收目的片段；

(2)双酶切pahc25-6*myc和步骤(1)中的纯化产物，使用胶回收试剂盒回收线性化后的载体和目的片段；

(3)连接：反应体系为：目的片段2μl，线性化载体2μl，t4连接酶1μl，t4连接buffer1μl，用ddh2o补足至10μl，16℃过夜连接；

(4)连接产物转化至宿主菌，挑选阳性克隆测序，将测序正确的载体命名为pahc25-6*myc-tamads6-d。

实施例2pcambia3300-ubi-mcs-6*myc-tamads6-d过表达载体的构建

在小麦中过表达tamads6-d基因使用的过表达载体为pcambia3300-ubimcs(以pcambia3300载体为骨架进行改造，在多克隆位点前加入玉米的ubiquition启动子，抗除草剂bar基因由35s启动子驱动，图谱如图2所示)。

使用序列如seqidno.9和seqidno.10所示的引物(如seqidno.9所示的引物带有bamhi酶切位点，如seqidno.10所示的引物带有smai酶切位点；)从实施例1构建的pahc25-6*myc-tamads6-d中间载体中扩增带有6*myc和tamads6-d基因片段的融合基因片段,即6*myc-tamads6-d。

酶切、连接、转化及阳性克隆测序同实施例1的步骤(2)～(4)，测序引物为seqidno.11和seqidno.12，测序正确的即构建成pcambia3300-ubi-mcs-6*myc-tamads6-d，此过表达载体的tamads6-d基因前面带有6*myc标签。

实施例3过表达tamads6-d基因的转基因小麦的构建

1、tamads6-d基因过表达载体转化农杆菌

(1)从-80℃冰箱取出农杆菌感受态c58c1于冰上融化；

(2)每管感受态均分两管，加入2μlpcambia3300-ubi-mcs-6*myc-tamads6-d质粒，轻弹混匀，冰上放置30min；

(3)液氮5min；

(4)37℃水浴5min；

(5)冰上5min；

(6)在超净台里，每管加400μl无抗lb培养基，轻弹混匀，28℃，200r/min，震荡培养3-4h；

(7)菌液涂于含rif和kan固体平板上，封口膜封好，28℃培养箱中倒置培养2d；

(8)挑取单克隆于lb培养基(含rif和载体抗性抗生素)中，28℃震荡培养12-16h，pcr检测筛选阳性克隆；

(9)加甘油后-80℃冰箱保菌。

2、农杆菌转化小麦

选取温室内开花后14-20天的籽粒，提前查看幼胚的状态，选取生长状态良好的穗子取材料。取籽粒放入干净的三角瓶中用70％乙醇洗1min，然后用15％次氯酸钠清洗15min，中间每隔1min晃一下，最后用无菌水清洗4-5次，每次1min。参照日本烟草公司的技术进行农杆菌转化小麦。当生根培养基中的小麦幼苗长到8-10cm高时即可以移栽幼苗。洗净幼苗根部的培养基，将其转移到网室栽培。

采用序列如seqidno.13和seqidno.12所示的引物对tamads6-d转化fieldert3代植株进行阳性植株鉴定，结果如图3所示，其中扩增产物为约700bp条带的植株代表阳性植株。

选取上述鉴定正确的转基因植株oe-l1、oe-l22和oe-l6进行后续的基因表达和植株表型分析。取抽穗期叶子进行半定量检测，以小麦tubulin作为内参基因。野生型fielder和转基因植株中tamads6-d基因表达量的检测结果如图4所示，结果表明，tamads6-d在转基因植株中的表达量远高于野生型植株的表达量，说明tamads6-d已在转基因植株中过表达。

对tamads6-d过表达的转基因植株的表型进行分析，开花表型如图5所示，结果显示，tamads6-d过表达能使fielder表现出不同程度的生长迟缓的表型(图5的a)，最后开花期也晚于野生型，oe-l1相比野生型开花推迟约21天，oe-l22开花推迟约16天，oe-l6推迟开花约4天(图5的b)。以序列如seqidno.14和seqidno.15所示的引物检测抽穗期野生型和过表达植株中tavrn3的表达，发现转基因植株中tavrn3的表达呈现不同程度的降低(图5的c)，表明转基因植株开花推迟。

穗和籽粒发育的表型结果如图6所示，结果显示，tamads6-d过表达植株中小穗数明显增多(图6的a和b)，与野生型相比，oe-l1、oe-l22和oe-l6的小穗数分别增加27.72％、20.09％和8.81％；且小穗数增多主要是小穗轴数增多导致的(图6的c)。进一步对籽粒数统计发现每穗的粒数明显增多(图6的d和e)，与野生型相比，oe-l1、oe-l22和oe-l6的每穗的粒数分别增加31.03％、26.47％和17.75％。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>小麦tamads6基因在调控植物穗和籽粒发育以及开花时间中的应用

<130>khp191116590.3

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>259

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<400>10

ggcccgggtcaaagaacccacccgagcat29

<210>11

<211>22

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<400>11

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<210>12

<211>23

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<400>12

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