一种颗粒间相对运动的DNA步行器及其生物传感的应用的制作方法

本发明属于dna步行器技术领域，具体涉及一种颗粒间相对运动的dna步行器及其应用于rna核酸片段检测的应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

dna因其精确的碱基配对能力、序列可编程性，结构可控性和易于修饰等特点，而被认为是最有前途的分子机器构建材料之一。dnawalker是一类核酸可以沿着预定的轨道自发地、逐步移动的dna分子机器。由于其独特的机械运动、高度方向性和固有的信号放大能力而备受关注。dnawalker已经从基于一维(1-d)轨道发展到基于dna折叠或dna修饰的平面的二维(2-d)轨道，甚至是基于球形颗粒的三维(3d)轨道。与1-d和2-ddnawalker相比，3-ddnawalker可以行走更多的步数，这是由于其具有较大的比表面积可承载高密度dna轨道，赋予它们更高的运行持续能力和更好的信号放大能力。

目前构建的3-ddnawalker通常分为两类：固定型dnawalker和游离型dnawalker。固定型dnawalker通常通过行走链与粒子表面共价结合作用或将步行链与辅助链结合的方式而将行走链的一端固定在粒子表面。这类3-ddnawalker通常将行走链和轨道链修饰在同一个球形粒子上。行走链的运动受限于粒子表面，并且行走链的有限的长度只能允许其在立足点附近摆动，因此3-ddnawalker的行走区域可能会受到限制。游离型dnawalker的工作原理是，自由的单足或双足步行链沿着轨道链功能化的颗粒表面行走。游离型dnawalker的运行过程中，行走链可能会脱离轨道以暂停步进，随后才能稳定地重新连接到另一个dna轨道。总体而言，有限的步行区域或脱轨有可能降低步行速度和持续性，这将进一步削弱3-ddnawalker的快速信号累积能力。发明人认为，现有dna步行器的上述缺陷不利于dna步行器在生物检测应用中的持续运行能力及检测灵敏性，限制了其分析能力。

技术实现要素：

针对上述研究背景，发明人认为有必要开发新型的dnawalker，本发明提供了一种颗粒间相对运动的dna步行器，其可以快速地持续行走并且具有提升的行走自由度以及与轨道增强的亲和力。该dnawalker由行走颗粒(wps)和轨道颗粒(tps)组成。wps是通过将包含dnazyme序列的封闭行走链功能化到aunps上来获得。tps是通过将荧光团标记的包含底物序列的轨道链功能化到aunps上而获得，在刺激的触发下，wp上的行走链协同杂交tp上的轨道链。轨道链被dnazyme切割，并伴随着荧光团的释放和荧光的恢复。随后wp上相邻的行走链与下一个轨道链杂交，从而诱导wp在tp周围作相对运动。当沿着一个tp的表面行走结束后，wp寻找新的tp，继续作相对运动并重复上述过程。行走链与轨道链的协同结合是稳定的，wp不易从tp脱轨。与颗粒内运行的dnawalker相比，所设计的dnawalker的行走自由度和区域得到了提升，进而提高了行走速度和持续性，最终促进了信号的快速积累。本发明以致病性病毒片段zikv-rna为模型靶标对上述dna步行器的检测性能进行了验证，证实该dnawalker具有良好的灵敏度和特异性。

基于上述研究成本，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种颗粒间相对运动的dna步行器，所述dna步行器包括行走颗粒及轨道颗粒，所述行走颗粒由第一金纳米粒及封闭的行走链构成，所述行走链为单链dna，其中包含dnazyme序列，其中一端与金纳米粒连接，另一端结合封闭链；所述封闭链包含待测目标的互补序列；

所述轨道颗粒由第二金纳米粒及荧光基团标记的轨道链构成，所述轨道链为单链dna，包括与行走链互补的序列；

所述dna步行器还包括补充组件，所述补充组件用于提供mg²⁺。

优选的，所述行走链包括8-17ednazyme序列。

优选的，所述第一金纳米粒和/或第二金纳米粒粒径为10～15nm。

优选的，所述第一金纳米粒和/或第二金纳米粒均为以haucl4为原料，通过柠檬酸还原法制备。

dnawalker的构建和运行原理如附图1所示。dnawalker由两种dna功能化的aunps组成，封闭的行走链功能化的aunps表示为wps，而轨道链功能化的aunps表示为tps。其中，行走链包含8-17ednazyme序列，该序列是具有高催化活性和结构识别能力的单链dna片段，封闭链包含目标序列的互补序列。轨道链包含dna-rna嵌合底物序列，并用荧光染料羧基荧光素(fam)标记，该荧光团最开始由于靠近aunps而被猝灭。在目标序列存在的情况下，通过链置换反应，目标序列与封闭链杂交形成双链产物，同时行走链被释放。然后，wp上的行走链与轨道链协同杂交。利用mg²⁺作为辅因子，轨道链被dnazyme序列切割，并且荧光团fam远离aunps产生荧光信号。wp上相邻的行走链与tp的下一个轨道链杂交，诱导wp在tp周围作相对运动，并伴随着轨道链的逐步切割。当wp完成沿一个tp的表面行走结束之后，它将寻找新的tp，继续相对运动并重复上述过程，从而释放大量的荧光团并产生信号累积。然而，当目标序列不存在时，行走链上的dnazyme序列被封闭，其催化活性被抑制，从而无法触发dnawalker的运行而获得微弱的背景信号。

本发明第二方面，提供第一方面所述颗粒间相对运动的dna步行器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将行走链及封闭链混合，以加热退火的方式对行走链进行封闭，还原行走链中的dna二硫键，将行走链与第一金纳米粒混合，在搅拌过程中加入nacl继续搅拌并通过水洗步骤以及将修饰好的第一金纳米粒最终分散于tris-hcl缓冲液中得到行走颗粒；

将还原后的轨道链与第二金纳米粒混合搅拌，并通过加盐，水洗，重新分散于tris-hcl缓冲液的步骤得到轨道颗粒。

优选的，所述行走链与封闭链的比例为0.8～1.2:4～6.

优选的，所述行走链及封闭链混合后加热至88～92℃。

优选的，所述封闭后的行走链与第一金纳米粒加入的摩尔比为140～160:1。

优选的，所述轨道链与第二金纳米粒加入的摩尔比为190～210:1。

本发明第三方面，提供第一方面所述颗粒间相对运动的dna步行器在制备核酸生物传感器中的应用。

优选的，所述核酸生物传感器用于检测rna核酸片段，为包括与生物分子相关的rna序列，包括rna病毒特异性rna片段。

本发明第四方面，提供一种核酸生物传感器，所述传感器包括第一方面所述颗粒间相对运动的dna步行器。

优选的，所述核酸生物传感器的检测方法如下：将待测序列、行走颗粒及mgcl2加入缓冲溶液中得到混合溶液，孵育一段时间之后加入轨道颗粒后进行反应，反应一段时间后离心检测上清液中的荧光。

进一步优选的，所述缓冲溶液为ph为8～9、包含nacl的tris-hcl缓冲溶液。

进一步优选的，所述混合溶液在35～39℃下孵育1～2小时。

进一步优选的，所述反应时间为2～3小时。

本发明第五方面，提供一种核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括第一方面所述颗粒间相对运动的dna步行器。

优选的，所述检测试剂盒中还包括缓冲溶液。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

相比现有的dna步行器，本发明提供了一种dna行走链与轨道链分别设置于不同纳米粒载体的方式，通过对比颗粒间相对运动的dnawalker与传统的颗粒内相对运行的dnawalker证实了该步行器切实能够通过颗粒间的相对运动，显著提高步行器的步行速度和持续性；并且相同浓度下，信号累积程度为颗粒内相对运动步行器的两倍之多，有效提高了检测的灵敏度。除此之外，该步行器还具有良好的检测特异性，能够应用复杂基质中样本的检测。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明中目标触发的颗粒间相对运动的dnawalker的原理示意图。

图2为实施例1中合成的aunps表征结果图；

其中，图2(a)为uv-vis吸收光谱；

图2(b)为tem图像。

图3为实施例1中wps和tps的修饰和表征结果图；

其中，图3(a)为uv-vis吸收光谱；

图3(b)为wps的荧光光谱及修饰的行走链数量的评估图；

图3(c)为tps的荧光光谱及修饰的轨道链数量的评估图。

图4为实施例1中颗粒间相对运动的dnawalker运行的表征结果图；

其中，4(a)为dnawalker的荧光发射光谱；

图4(b)为dnawalker的非变性page分析。

图5为实施例1中颗粒间相对运动的dnawalker的动力学研究结果图；

其中，图5(a)为dnawalker响应不同目标物浓度的荧光随反应时间的变化；

图5(b)为dnawalker在前30min内响应不同目标物浓度的荧光变化；

图5(c)为不同目标物浓度下dnawalker的初始速率。误差棒是三次平行实验结果的标准偏差。

图6为实施例1中颗粒间相对运动的dnawalker与颗粒内运行的dnawalker性能对比结果图；

其中，图6(a)为颗粒间相对运动的dnawalker和颗粒内运行的dnawalker的荧光强度随反应时间的变化；

图6(b)为颗粒间相对运动的dnawalker和颗粒内运行的dnawalker的荧光发射光谱；

图6(c)为颗粒间相对运动的dnawalker和颗粒内运行的dnawalker在前30min的反应速率。误差棒是三次平行实验结果的标准偏差。

图7为实施例1中5nm和25nmaunps表征结果图；

其中，图7(a)为5nm-aunpsuv-vis吸收光谱；

图7(b)为5nm-aunpstem图像；

图7(c)为5nm-aunpsuv-vis吸收光谱；

图7(d)为5nm-aunpstem图像。

图8为实施例1中不同尺寸纳米链荧光性能评估结果图；

其中，图8(a)为tp-au5的荧光光谱及修饰的track链数量的评估图；

图8(b)为tp-au25的荧光光谱及修饰的track链数量的评估图。

图9为实施例1中tps和wps的动态光散射(dls)表征。

图10为实施例1中tps尺寸变化对颗粒间相对运动的dnawalker性能影响；

其中，图10(a)为不同尺寸的tps的dnawalker的荧光随反应时间的变化(相同tps浓度)；

图10(b)为wp与不同大小的t-aunp结合的示意图；

图10(c)为不同尺寸的tps的dnawalker的荧光随反应时间的变化(相同的轨道链浓度)；

图10(d)为不同尺寸的tps存在时的dnawalker的反应速率(相同的轨道链浓度)。

图11为实施例1中dnawalker对zikv-rna的响应结果图；

其中，图11(a)为颗粒间相对运动的dnawalker响应不同浓度的zikv-rna的荧光发射光谱；从a到j分别为0nm，1nm，2nm，4nm，5nm，6nm，8nm，10nm，12nm和15nm；内插图显示荧光信号与zikv-rna浓度之间的线性关系；

图11(b)为颗粒间相对运动的dnawalker的特异性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种颗粒间相对运动的dna步行器，该步行器的制备方法及在rna核酸片段检测中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1.1实验材料与试剂

所有的dna、rna、tris碱，硼酸，乙二胺四乙酸(edta)，40％(w/v)丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液(19：1)，二硫苏糖醇(dtt)和焦碳酸二乙酯水(depc水)均购自上海生工生物技术有限公司(中国，上海)。

三水合氯金酸(haucl4·3h2o)，二水合柠檬酸钠(na3c6h5o7·2h2o)和三(2-羧乙基)膦(tcep)购自sigma-aldrich公司(美国，圣路易斯)。

5nm和25nm的金纳米颗粒(aunps)购自南京先丰纳米材料技术有限公司(中国，南京)。实验中所用化学品均为分析纯，且使用过程中无需进一步纯化。所有的溶液均采用depc水制备。该工作中的dna和rna序列在表格1中列出。

表1.该工作中所使用的dna和rna序列。

注：行走链的下划线代表8-17ednazyme的催化序列。轨道链下划线标注的ra表示腺嘌呤核糖核苷酸。

1.2实验仪器

紫外可见吸收光谱是通过uv-2910紫外分光光度计(日本，日立公司)上获得的。透射电子显微镜(tem)图像是在jsm-6700f透射电子显微镜(日本，jeol)上获得的，电压为200kv。荧光光谱在f-7000荧光分光光度计(日本，日立公司)上测量。激发波长设置为488nm，发射波长的范围为510-650nm。激发与发射的狭缝宽度设置为10nm，光电倍增管的电压为700v。聚丙烯酰胺凝胶通过geldoctmxr⁺成像系统(美国，伯乐公司)成像。动态光散射(dls)测量在纳米粒度仪(英国，马尔文)上进行。

2.颗粒间相对运动的dnawalker的制备与表征

参照现有方法合成13nm-aunps。将柠檬酸钠溶液(5ml，38.8mm)快速添加到剧烈搅拌的沸腾haucl4水溶液(50ml，1mm)中，连续沸腾10分钟后，将混合溶液继续搅拌15分钟。在连续的缓慢搅拌下将溶液冷却至室温，通过0.22μm过滤器过滤，并避光保存于4℃冰箱内。利用紫外分光光度计和透射电子显微镜表征aunps,合成的13nmaunps的浓度根据519nm处的吸光度和相应的摩尔吸光系数(2.7×10⁸lmol^-1cm^-1)确定。

dnawalker由wps和tps组成。为了制备wps，将行走链和封闭链以1：5的摩尔比在1xtris-hcl缓冲液(ph8.3)中混合。将混合物加热到90℃并保持10分钟，然后缓慢冷却至室温，形成封闭的行走链。在功能化之前，将硫醇化的dna与tcep以1：100的摩尔比孵育2小时，以还原dna的二硫键。接下来，将含有50μl封闭的行走链(30μm)和1mlaunp(10nm)的混合物在室温下缓慢搅拌16小时。然后以40分钟的间隔将100μl的2mnacl分六次逐渐添加到上述混合物中。继续缓慢搅拌24小时后，将溶液以12,500rpm离心30分钟，进而从未功能化的dna中分离出wps。将wps在tris-hcl缓冲液(ph8.0)中洗涤3次，并分散在1xtris-hcl缓冲液(10mmtris，ph8.3)中。

为了制备tps，将含有20μltcep还原的轨道链(100μm)和1mlaunp(10nm)的混合物在室温下缓慢搅拌16小时。然后通过与上述相同的过程获得tp，包括加盐，分离和洗涤步骤。最后，将tps分散在tris-hcl缓冲液(10mmtris，ph8.3)中。将制备好的wps和tps避光储存于4℃冰箱内，利用紫外可见分光光度计表征wps和tps并确定浓度。

3.1wps和tps上dna链的数量的测定

为了测量wps和tps的每个aunp上的dna链数量，参照文献报道的dtt取代方法，首先使用dtt从aunp中释放dna链到溶液中。将wps和tps分别与20mmdtt混合并在室温下孵育过夜。然后将溶液以12,000rpm离心15分钟以沉淀aunps，并测试包含释放的dna链的上清液的荧光。通过使用上清液的荧光和荧光团标记的dna链的校准曲线来测量dna链的浓度。最后，通过dna链的浓度除以aunp的浓度来确定wps和tps的每个aunp上修饰的dna链的数量。

3.2粒子间相对运动dnawalker的运行实验步骤

对于典型的颗粒间相对运动的dnawalker运行过程，首先，将6μl目标序列(250nm)添加到包含12μlwps(1nm)，12μl5×tris-hcl(100mmtris-hcl，875mmnacl，ph8.3)，12μlmgcl2(50mm)和6μldepc-h2o的溶液中。将上述混合溶液在37℃下孵育1.5小时以暴露wps上自由的行走链，然后添加12μltp(5nm)以启动dnawalker的行走。将混合溶液在37℃下反应2.5小时。dnawalker运行完成后，将上述溶液在12,000rpm下离心15分钟，然后测定上清液的荧光。

3.3凝胶电泳分析

通过使用15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)实验，来证实颗粒间相对运动的dnawalker运行的可行性。首先将包含1μl封闭的行走链(10μm)、1μl目标序列(10μm)、1μl轨道链(10μm)、2μl5×tris-hcl(ph8.3)、2μlmgcl2(50mm)和3μldepc-h2o的10μl反应溶液在37℃下孵育1h。随后，将2μl的6xloading缓冲液添加到上述溶液中，并将该混合物上样至15％的聚丙烯酰胺凝胶上，以分离不同分子量的dna。接下来，使用1×tbe缓冲液(89mmtris，89mm硼酸，2mmedta，ph8.3)在15℃下以30ma恒定电流跑胶65分钟。然后凝胶用sybrgold染色40分钟并通过凝胶成像系统进行成像。

4.1合成的13纳米的金纳米粒子表征

紫外可见吸收光谱和透射电子显微镜(tem)成像用于表征合成的13nm-aunps。从图2a可见，uv-vis吸收光谱显示aunps的最大吸收波长为519nm。并且图2b显示tem图像表明合成的aunps的形状为圆形，颗粒分布均匀，尺寸约为13nm。这些结果表明成功制备了13nm的aunps。

4.2wps和tps的表征

如图3a所示，uv-vis表征表明金纳米粒子的最大吸收峰在519nm处，修饰dna链后wps和tps的最大吸收峰均红移至522nm，说明aunps上功能化上了dna链。如图3b所示，根据测定的不同浓度的fam标记的walking链荧光建立标准曲线，得到的标准方程为f＝86.6+73.5cdna。将经dtt取代后所测得的wps的荧光强度代入标准方程，得到行走链的浓度，经计算，每个wp上修饰的行走链的数量21条。同样，根据图3c得到每个tp上修饰的track链的数量88条。

5.1可行性研究

为了验证颗粒间相对运动的dnawalker运行的可行性，首先进行了荧光表征。如图4a所示，在目标序列存在下，获得了显着增强的荧光信号。这表明目标序列可以与封闭链杂交并暴露出行走链上的dnazyme序列，并进一步触发dnawalker的运行。相反，在没有目标序列的情况下，仅获得了微弱的荧光信号，这表明行走链上的dnazyme序列被封闭而无法触发dnawalker的运行。当只存在tps时，获得较弱的荧光信号较弱，这表明tps上的轨道是稳定的，除非存在用于行走和切割的wps。当不存在mg²⁺时，可获得与背景几乎相同的荧光强度，这表明wps由于缺少mg²⁺作为dnazyme切割反应的辅因子而不能沿tp行走。接下来进行page实验验证。如图4b所示，与泳道1到6的单个dna标记相比，可以从泳道7得出结论，在靶标和封闭的行走链之间发生链置换反应。其中目标序列与封闭链杂交形成双链体，伴随着行走链的释放。当不存在目标序列时，可以观察到于轨道链对应的条带(泳道8)。这表明行走链上的dnazyme序列被封闭，无法触发dnazyme裂解反应。当存在目标序列时，对应于轨道链的条带会消失(泳道9)，这表明其被行走链切割以及walker被目标物特异性启动。所有结果证明了所设计的dnawalker运行过程的可行性。

5.2颗粒间相对运动的dnawalker响应不同浓度目标物的动力学研究

为了更好地评估wps的多足行走链对walker性能的影响，研究了dnawalker响应不同目标浓度的动力学。如图5a所示，随着反应时间的增加，荧光强度响应从0nm到25nm的目标物浓度也逐渐增强。dnawalker荧光信号的变化在反应的前30分钟迅速增长，随后缓慢增长(0.5-2.5小时)，最终趋于稳定(2.5-3.5小时)。这是由于行走链一开始可与tp上的大量轨道链相互作用，因此在最初的30分钟内呈现出明显的荧光增长。随着dnawalker从0.5小时运行到2.5小时，tps上的行走区域和轨道链数量逐渐减少，荧光变化呈现缓慢增长的趋势。随着轨道链浓度趋于耗尽，反应2.5小时后荧光变化逐渐稳定。通过在反应的前30分钟内以5分钟的间隔测定荧光强度，可获得良好的线性关系(图5b)。随着目标浓度的增加，walker的荧光强度呈线性增加。然后，通过计算前30分钟内单位时间消耗的轨道链浓度来确定dnawalker的初始速率(图5c)。在反应的前30分钟内，随着目标浓度从5nm增加到25nm，dnawallker的初始速率v从2.5×10^-12增加到1.2×10^-11ms^-1。这是因为随着目标浓度的增加，wps上释放的行走链的逐渐数量。随着轨道链的消耗，wp上增加的自由行走链将更容易束缚tps上的剩余轨道，从而诱导wp的行前行走及其沿tp的相对运动，从而加快了dnawalker的行走速度，产生更多的荧光信号。

5.3颗粒间相对运动的dnawalker与颗粒内运行的dnawalker性能对比

为了更直观地确认行走速度和持续运行能力，对传统的颗粒内运行dnawalker和颗粒间相对运动dnawalker进行了荧光信号比较。结果如图6a所示，颗粒间相对运动的dnawalker显示出快速而增强的荧光信号增长。为了进行比较，通过将封闭的行走链和轨道链共同修饰到与同一个aunps上，从而获得对照的颗粒内运行的dnawalker，其中dna链之间的修饰比例与颗粒间相对运动的dnawalker相同，同时所用的轨道链浓度与修饰tps时保持一致。在与颗粒间相对运动的dnawalker相同的实验条件下，测试了颗粒内运行的dnawalker的荧光变化，显示出缓慢增长的荧光信号。通过计算得到前30分钟的反应速率，颗粒间相对运动的dnawalker(1.21×10^-11ms^-1)的反应速率比颗粒内运行的dnawalker(5.91×10^-12ms^-1)的反应速率提高2倍，说明颗粒间相对运动的dnawalker具有加快的行走速度(图6c)。当反应时间为1h左右时，颗粒内运行的dnawalker没有明显的荧光增长，颗粒间相对运动的dnawalker在2.5h内仍显示出持续增长的荧光信号，如图6b所示，从反应达到平台时的荧光光谱可以直观地得到两种类型的dnawalker的信号累积程度。与颗粒内运行的dnawalker相比，颗粒间相对运动的dnawalker获得了2.1倍的累积信号增加。另外，根据相应的荧光强度和fam标记的轨道链的标准曲线，计算dnawalker运行过程中释放的轨道链浓度，进而计算出tps上释放的轨迹链浓度与总轨迹链浓度的比值。结果表明，颗粒间相对运动的dnawalker行走过程中有52％的轨道链释放，而颗粒内运行的dnawalker的行走过程中有31％的轨道链释放。这是由于颗粒间相对运动的dnawalker行走过程中，wp在沿着一个tp的表面行走完成后，可以继续寻找新的tp进行相对运动，从而扩大了行走区域，从而获得快速增强的荧光信号。

5.4不同尺寸的tps对颗粒间相对运动dnawalker的运行性能的影响

本实施例研究了tps的aunps尺寸变化对dnawalker运行性能的影响。首先，在不同尺寸(5nm，13nm和25nm)的aunps上修饰轨道链，其中5nm和25nmaunp也通过紫外可见光谱仪和tem进行表征(图7)，从而获得了tp-5nmaunps(tp-au5)，tp-13nmaunps(tp-au13)和tp-25nmaunps(tp-au25)。其中tp-au5和tp-au25上的轨道链的修饰量测定分别为17和185条(图8)。利用动态光散射(dls)表征得到tp-au5，tp-au13，tp-au25和wp的水合直径分别为26.0nm，37.8nm，32.2nm和43.8nm(图9)。其中，尽管tp-au25中aunp的直径较大，但轨道链在tp-au25上呈“平躺”构象，这可能是由于aunps上轨道链的密度不同所致，tp-au25上的轨道链的密度(9.4×10¹²/cm²)远小于tp-au13上的轨道链的密度(1.7×10¹³/cm²)，这表明了tp-au25“平躺”构象和较小的水合直径。如图10a所示，在tp浓度相同的情况下，dnawalker的荧光变化取决于tp的尺寸变化。通过将wp和tp视为两个碰撞粒子，可以用wp之间的碰撞效率差异以及它们周围tp的尺寸大小不同来解释这些问题。不同粒径的粒子的碰撞效率小于相同粒径的粒子的碰撞效率，两个碰撞粒子的半径比例越大，碰撞效率就越小。tp-au5，tp-au13和tp-au25的反应溶液中两个粒子的半径比(rwp/rtp)分别为1.68、1.15和1.36。wp和不同大小的tps的组合示意图如图10b所示。当tp-au13存在于反应溶液中，dnawalker体系中wps和tps具有近似的粒径，并且产生最强的荧光信号变化。当体系中存在tp-au5和tp-au20时，wps和tps之间的粒径差异较大，因此会降低碰撞效率。tp-au5体系中wps与tps的半径比大于tp-au25体系，且tp-au5上的轨道链修饰量最少，因此tp-au5显示出最弱的荧光信号。

本实施例进一步研究了相同数量的轨道链分布哪种尺寸的tps上有利于实现dnawalker的有效运行。为了保持相同的轨道链浓度，将反应溶液中wp与tp-au5，tp-au13和tp-au25的摩尔比分别调节为1：25.8、1：5和1：2.3。如图10c所示，tp-au13显示最快的信号增长并获得最高的荧光强度，因为反应溶液中的wp和tp-au13具有近似的粒径。尽管tp-au5反应溶液中的wps和tps之间的碰撞效率通常比tp-au25弱，但tp-au5的浓度较高，因此tp-au25相比，wp可能与周围的多个tp-au5结合产生加速的反应速率和增强的荧光信号(图10d)。结果表明，将轨道链排布在近似于wps尺寸的颗粒表面上有利于提高这种颗粒间dnawalker的行走速度和信号累积。

5.5颗粒间相对运动dnawalker的检测性能

zika病毒(zikv)是黄病毒科的单链正股rna病毒。zikv感染疾病因其高发病率和死亡率对全球人类健康构成巨大威胁，并且迄今尚无有效的药物或许可疫苗。致病性病毒检测的关键是高灵敏度，及早发现和检测有助于提高生存率。在最佳实验条件下测定了不同浓度的zikv-rna，以评估dnawalker的检测性能。如图11a所示，随着zikv-rna浓度的增加，荧光强度逐渐增强。插图中的校准曲线表明，荧光强度与zikv-rna浓度在1nm至15nm范围内显示出良好的线性关系。从线性方程获得的相关系数显示出在zikv-rna的浓度范围内良好的相关性。根据三倍的标准偏差原理(lod＝3σ/k，其中σ是空白平行测定的标准偏差，k是校准曲线的斜率)，估计的检测限(lod)为118pm。此外，提出的dnawalker对zikv相关核酸序列的灵敏度高于某些报道的分析策略(表2)。

为了考察该dnawalker的特异性，在最佳的实验条件下，本实施例比较了目标物zikv(t-zikv)，登革热病毒(t-denv)，日本脑炎病毒(t-jev)和黄热病病毒(t-yfv)的rna序列。这四种病毒均属于黄病毒科，黄病毒属的单链rna病毒，并且具有相似的临床症状。在相同条件下，只有目标rna序列才能引起明显的荧光增强，而其他相似病毒的rna序列仅引起与空白接近的荧光信号(图11b)。该结果表明dnawalker对于zikv-rna的检测具有良好的特异性。

表2.dnawalker与一些报道的zikv相关序列检测策略的比较

5.6复杂生物样品中的分析

为了考察颗粒间相对运动dnawalker在复杂生物样品中的实际应用能力，将人血清作为复杂体系进行加标回收实验。向人血清中添加不同浓度的zikv-rna，并利用dnawalker检测上述样品，然后测定人血清中zikv-rna的加标回收率。根据表格3，人血清中zikv-rna的加标回收率在97.5％至103.5％之间，这表明dnawalker可以有效抵抗人血清中共存的复杂成分的干扰。良好的抗干扰能力应该归因于反应溶液中wps和tps的稳定性，这是因为wps和tps上的aunps具有较强的空间效应和高的离子电荷，可用于有效地稳定dna。此外，结果还证明了dnawalker在实际生物样品分析中具有潜在的应用。

表3.人血清中zikv-rna的加标回收实验

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