基于金纳米颗粒聚集分散的多重miRNA检测方法与流程

本发明涉及mirna检测技术领域，特别涉及一种基于金纳米颗粒聚集分散的多重mirna比色检测方法。

背景技术：

microrna(mirna)是一类长度为18-25个核苷酸的内源性非编码小分子单链rna。mirna普遍存在于真核细胞中，可以作为疾病标志物用于相关疾病的早期诊断。传统的检测方法包括northern印迹杂交法，微阵列分析法和实时定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)等。尽管这些方法的准确性好，但在实际应用中仍存在一些不足。例如northern印迹杂交法耗时费力，对待测样品都需求量大，不能用于低丰度mirna的检测；微阵列分析法可以实现mirna的多重检测，但是其灵敏度不足，特异性差，动态范围窄，此外芯片的制作和检测费用高；qrt-pcr的灵敏度高，但是mirna序列短，限制了其逆转录步骤，此外，qrt-pcr通常需要复杂的引物设计和精确控温。因此需要发展新型的mirna分析方法。

dna计算是计算机科学和分子生物学结合而发展起来的新型研究领域。到目前为止，dna计算已经取得了令人瞩目的进展。逻辑与门是构成计算机集成电路的基本元件，同时也是实现逻辑操作和运算的最简单的基本单元。dna具有精准的分子识别能力以及强大的信息存储能力，完美契合构建逻辑与门的要求。近些年来，基于dna的分子逻辑与门发展迅速，已广泛应用于分子检测等各个领域。dna逻辑与门主要是通过杂交反应、配体识别来实现其目标识别、信号输出等功能。由于dna逻辑与门对输入没有要求，并且它的输出可以作为后续逻辑与门的输入，完全满足多目标检测的要求，因此在多目标的检测中备受关注。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种多重mirna的检测方法，它基于金纳米颗粒聚集分散和dna自组装的逻辑与门实现对三重mirna的定性检测分析；此方法可以同时对三种mirna分子进行检测，具有对设备和技术人员的要求低以及较高的灵敏度等优点。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种多重mirna的检测方法，用于对多种待测mirna是否同时共存进行定性检测，包括：

向待测液中至少加入第一信号识别探针和第二信号识别探针，其中，第一信号识别探针被设置为至少能与部分待测mirna特异性结合，并释放出第一活性单链，第二信号识别探针被设置为至少能与剩余部分的待测mirna特异性结合，并释放出第二活性单链；

加入与第一颈环结构dna和第二颈环结构dna混合的金纳米颗粒；其中，所述第一颈环结构dna和第二颈环结构dna被设置为：第一颈环结构dna和第二颈环结构dna能够吸附于金纳米颗粒表面，且第二活性单链能够触发第一颈环结构dna和第二颈环结构dna之间的杂交链式反应，使第一颈环结构dna和第二颈环结构dna从金纳米颗粒表面解离出来；

加入无机盐；通过对溶液颜色的变化或者通过结合光学仪器获得对多种待测mirna的定性检测。

优选的是，所述的多重mirna的检测方法，其中，待测mirna有三种，分别是：

mirna-141：5’-uaacacugucugguaaagaugg-3’；

mirna-21：5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’；

mirna-155：5’-uuaaugcuaaucgugauagggguu-3’。

优选的是，所述的多重mirna的检测方法，其中，所述第一信号识别探针是由三条单链自组装形成的y型结构探针。

优选的是，所述的多重mirna的检测方法，其中，组成y型结构探针的三条单链分别是y1、y2、y3，它们的序列分别为：

y1：5’-acactggatcaacatcagtctgataagcta-3’；

y2：5’-ccatctttaccagacagtgtta-3’；

y3：5’-cagactgatgttgatgtctggtaaagatgg-3’。

优选的是，所述的多重mirna的检测方法，其中，所述第二信号识别探针是由三条单链自组装形成的h型结构探针。

优选的是，所述的多重mirna的检测方法，其中，组成h型结构探针的三条单链分别是h1、h2、h3，它们的序列分别为：

h1：5’-aacccctatcacgattagcattaaccatctttaccagacatcaacat-3’；

h2：5’-gtaaagatggttaatgctaatcg-3’；

h3：5’-aatagatgttgatgtctg-3’。

优选的是，所述的多重mirna的检测方法，其中，所述第一颈环结构dna的序列为：5’-cagacatcaacatctattcaaagtaatagatgttga-3’。

优选的是，所述的多重mirna的检测方法，其中，所述第二颈环结构dna的序列为：5’-aatagatgttgatgtctgtcaacatctattactttg-3’。

优选的是，所述的多重mirna的检测方法，其中，所述无机盐为无机钠盐。

优选的是，所述的多重mirna的检测方法，其中，所述无机钠盐为氯化钠。

本发明的有益效果是：本案的基于金纳米颗粒聚集分散的多重mirna比色检测方法，可以同时对三种mirna分子进行定性检测，具有对设备和技术人员的要求低以及较高的灵敏度等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于金纳米颗粒聚集分散的多重mirna比色检测方法的原理示意图。

图2为不同浓度mirna的紫外可见吸收光谱及标准曲线图。

图3为mirna逻辑门验证图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例1

以mirna-141、mirna-21和mirna-155作为目标mirna为例，本实施例涉及的dna与rna序列如表1：

表1dna与rna序列

本案的检测原理如图1所示：当mirna-141、mirna-21和mirna-155共存时，mirna-21和mirna-141先与第一信号识别探针(y型结构探针)反应，置换出第一活性单链，随后置换出的第一活性单链和mirna-155继续与第二信号识别探针(h型结构探针)反应置换出第二活性单链；第二活性单链与吸附在金纳米颗粒表面的第一颈环结构dna和第二颈环结构dna反应，第二活性单链触发第一颈环结构dna和第二颈环结构dna之间的杂交链式反应，第一颈环结构dna和第二颈环结构dna彼此形成稳定的长双链结构，从而无法继续吸附在金纳米颗粒表面进行保护，在na⁺环境下，金纳米颗粒发生团聚，溶液颜色发生变化，通过对溶液颜色的变化或者通过结合光学仪器的数据分析获得对这三种mirna是否共存的定性判断。

特殊设计的y型结构和h型结构探针用来进行多重输入识别以及逻辑与门的构建。当需要检测的mirna同时共存的时候，通过与信号识别探针之间发生的支点介导链置换反应从而实现信号捕获以及其转化；并且在该过程中释放的活性单链可以激活两个颈环结构dna之间的杂交链式反应。由于杂交链式反应只要具有单个核酸分子便可以诱发大量自稳定的颈环结构形成缺口长的双链dna的特点，该反应的运用可以实现信号放大与信号输出同步进行的目的。金纳米颗粒是一种表面带负电的纳米材料，正常情况下可以很好的分散在溶液中。但是如果溶液中盐的浓度过高(达到50mm)，就会对其表面的负电荷有一个中和作用从而诱导其发生聚集，同时引起明显的颜色以及紫外吸收光谱的变化。而颈环结构dna的末端具有一段单链结构，其暴露的碱基可以与金纳米颗粒通过静电吸附作用附着到金纳米颗粒表面，由于dna具有较强的电负性从而可以增加其整体的电负性，使其可以很好的重悬在高浓度的盐溶液中。但是，由于杂交链式反应而形成长双链dna具有较强的刚性，并且其暴露的磷酸盐骨架使dna与带负电荷的金纳米颗粒产生强烈的排斥作用；失去单链dna保护的金纳米颗粒在较高浓度的盐溶液中发生团聚，使其颜色由红变紫，通过对溶液的颜色以及其光谱的监控可以间接的对目标物浓度进行检测。至此，本按实现了针对与多目标的逻辑与门的构建。

具体操作为：

1)将合成1.0nmy型结构探针和1.0nmh型结构探针所需的三条单链dna分别混合均匀，放置在95℃孵育5分钟后，缓慢降温到25℃并且在25℃保持60分钟；

2)将步骤1)中合成好的y型结构探针和h型结构探针与标准品的目标mirna(mirna-141、mirna-21和mirna-155)混合，在25℃下孵育240分钟，标准品含有浓度相同的三种目标mirna，并且标准品浓度选择为：0nm、0.01nm、0.05nm、0.1nm、0.2nm、0.3nm、0.4nm、0.8nm、1.0nm；

3)将步骤2)中得到的反应液与100nm的第一颈环结构dna和100nm的第二颈环结构dna混合的10nm的金纳米颗粒溶液反应，在室温下孵育30分钟；

4)向步骤3)中得到的反应液中加入50mm的氯化钠溶液；

5)肉眼观察溶液颜色变化，或者用紫外分光光度计检测步骤4)得到的混合物在520nm以及675nm处的吸光度值，并绘制675nm处吸光度与520nm处吸光度的比值与三种mirna浓度的关系图，得出标准曲线图。试验结果参见图2。

图2(a)为不同浓度标准品运用该方法分析后得到的光谱图，图中显示随着溶液中目标物浓度增加，在520nm处吸光度下降并且在675nm处吸光度上升，金纳米颗粒的聚集程度也随之加剧，这表明目标物的浓度与金纳米颗粒的聚集程度呈正相关。图2(b)为通过分析目标物浓度和675nm处与520nm处吸光度比值的关系所得到的标准曲线，研究发现该标准曲线在一定范围内具有良好的线性关系，这说明该方法除了可以进行定性检测外，还可以在一定浓度范围内有效地指示目标物的浓度。

图3为mirna逻辑门验证图。图3(b)为dna逻辑与门在不同输入组合时的输出真值表，其中输入1代表mirna-141，输入2代表mirna-21，输入3代表mirna-155。图3(a)为不同输入组合的输出颜色以及光谱响应，内嵌图中a-h分别表示：a为没有任何输入存在，b只有输入1存在，c只有输入2存在，d只有输入3存在，e为输入1、2同时存在，f为输入1、3同时存在，g为输入2、3同时存在，h为输入1、2、3同时存在。由图3可知，通过对不同目标物的输入组合的研究，发现只有在三种目标物同时存在情况下才会引发溶液明显的颜色变化以及光谱图响应。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

发明名称：基于金纳米颗粒聚集分散的多重mirna检测方法

申请人名称：济南国科医工科技发展有限公司、苏州市中心血站

序列名称序列(5’to3’)

mirna-141uaacacugucugguaaagaugg

mirna-21uagcuuaucagacugauguuga

mirna-155uuaaugcuaaucgugauagggguu

y1acactggatcaacatcagtctgataagcta

y2ccatctttaccagacagtgtta

y3cagactgatgttgatgtctggtaaagatgg

h1aacccctatcacgattagcattaaccatctttaccagacatcaacat

h2gtaaagatggttaatgctaatcg

h3aatagatgttgatgtctg

第一颈环结构dnacagacatcaacatctattcaaagtaatagatgttga

第二颈环结构dnaaatagatgttgatgtctgtcaacatctattactttg