本发明属于生物工程技术领域。具体来说，本发明涉及一种新的猫细小病毒重组蛋白，通过基因工程技术编码合成该猫细小病毒重组蛋白的核苷酸序列，构建含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化有上述质粒载体的大肠杆菌菌株，表达猫细小病毒重组蛋白；使用上述重组蛋白制备单克隆抗体，并应用于猫细小病毒感染的初步诊断。
背景技术：
猫细小病毒(felineparvovirus，fpv)又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性肠炎病毒、猫瘟病毒，猫感染细小病毒后的临床表现主要为高热、呕吐、腹泻和肠炎，能够导致白细胞数目严重减少。该病毒主要感染猫科和鼬科等多种动物，尤其以6月龄以下幼小动物的发病率和死亡率更高，是目前细小病毒属中感染范围最广，致病性最强的一种病毒。
自然条件下，感染动物特别是发病动物的粪便、尿等排泄物和鼻、眼、唾液等分泌物以及呕吐物均带毒，可污染饲料、饮水、器具和周围环境。当感染动物血清中存在fpv抗体时，其粪尿仍可向外界排毒6周之久。随着猫细小病毒危害的加重，许多研究人员对其开展了实验室诊断。主要有猫细小病毒的分离鉴定，该方法利用培养细胞来观察细胞病变，但有些病毒增殖缓慢，不能在细胞培养物中生长，与临床发病时间相比，排毒时间可能很短，而在样本贮存和运输过程中，可能丧失感染性，并且该方法需要操作者有一定的经验，花费较高。电镜检查试验敏感度较低，不能区别形态类似的不同病毒，且样本处理量大，限制了该方法的应用。rt-pcr法检测猫细小病毒核酸，该方法特异性和敏感性好，能快速区分病毒，适合大量样本同时检测，但是设备昂贵，对操作人员要求高，检测时间较长，并且检测费用高。
目前，免疫学方法检测猫细小病毒由于操作简便、结果易于判定，已成为主流方向。免疫学方法采用单克隆抗体识别检测血液样本中的猫细小病毒抗原，该方法特异性及灵敏度俱佳。若结合胶体金平台，一般能在10～15分钟内获得准确结果，适合大批量样本快速检测，无特殊设备及人员要求，主人在家就可以检测。
技术实现要素：
设计目的：通过设计一种猫细小病毒重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现猫细小病毒的特异性识别检测，既增强了检测灵敏度，又不会导致检测结果失真。
设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以猫细小病毒衣壳蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原的两个特异性优势表位，序列比对结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为了促进所选择优势抗原表位对balb/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，将所选择的两个优势抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)串联后四次重复，形成猫细小病毒重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将猫细小病毒重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于该重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入原核表达载体pet-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。(5)猫细小病毒重组蛋白表达载体转化大肠杆菌er2566感受态细胞，利用卡那青霉素抗性筛选培养基筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化的猫细小病毒重组蛋白。(7)纯化的猫细小病毒重组蛋白多次免疫balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮筛选并最终得到杂交瘤细胞株。(8)将杂交瘤细胞株分别制备balb/c小鼠腹水，使用正辛酸-硫酸铵沉淀法及proteina亲和层析分两步纯化单克隆抗体，并分别标记胶体金颗粒。(9)正交实验筛选显示3a6单抗包被与7b9胶体金标记单抗配对是检测猫细小病毒感染的最佳组合。
具体实施方案：以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
实施例1：猫细小病毒优势抗原表位选择
以猫细小病毒衣壳蛋白为靶抗原，利用生物软件dnassist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择a优势抗原表位(seqidno:1)和b优势抗原表位(seqidno:2)。序列比较结果表明所选择的a、b两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。
实施例2：猫细小病毒优势抗原表位串联
为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将猫细小病毒衣壳蛋白的a、b两个优势抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后重复四次，得到猫细小病毒重组蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表seqidno:1所示。
实施例3：优化编码猫细小病毒重组蛋白核苷酸序列
为提高猫细小病毒重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码猫细小病毒重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表seqidno:4所示，并在其上下游分别添加酶切位点bamhi和ecori对应的核苷酸序列，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pmd19-t载体(宝生物工程大连有限公司)中。
实施例4：构建猫细小病毒重组蛋白表达载体
用限制性内切酶bamhi和ecori(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pmd19-t载体和pet-28a(+)载体(德国novagen公司)12小时，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pet-28a(+)载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均购自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用t4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和pet-28a(+)载体按一定比例于25℃连接3小时后，连接产物转化dh5α感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/ml)的lb平板上，37℃恒温倒置培养12小时，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/ml)的lb液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均购自于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经bamhi和ecori双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
实施例5：构建猫细小病毒重组蛋白表达菌株
将构建好的重组表达载体转化e.colier2566感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/ml)的lb平板上，于37℃过夜培养。次日挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/ml)的lb液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，取1ml保存，剩余加诱导剂iptg(异丙基硫代-β-d-半乳糖苷)(终浓度为1.0mmol/l)诱导表达4小时后制备蛋白电泳样品。13％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到猫细小病毒重组蛋白表达菌株。
实施例6：纯化猫细小病毒重组蛋白
接种重组蛋白表达菌株至lb液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/ml，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/ml卡那青霉素的lb液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶，置37℃恒温摇床培养至od600＝0.8，加诱导剂iptg(异丙基硫代-β-d-半乳糖苷)至终浓度为1.0mmol/l，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化重组蛋白。
实施例7：杂交瘤细胞株的获得
取4-6周龄雌性balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg重组蛋白。20天后进行第二次加强免疫，方法为取80ug重组蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射。15天后进行第三次加强免疫，取80μg重组蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射。两周后，取80ug重组蛋白腹腔加强注射，并于72小时后眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1/5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，混和离心后，加入聚乙二醇(peg-4000)使二者融合。此外再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板(200μl/孔)，于5％二氧化碳培养箱培养。5天后，半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中的杂交瘤细胞培养上清。具体方法如下：
重组蛋白经包被液稀释后(终浓度为1μg/ml)，以100μl/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)，4℃包被12小时后通过dem-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；加入封闭液，180μl/孔，37℃封闭1小时，洗板机洗板1次；加待检细胞培养上清、阳性对照血清及阴性对照样本，100μl/孔，37℃孵育35分钟后，洗涤液洗涤3次；加hrp(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃孵育35分钟后，洗涤液洗涤4次；每孔加显色液a和显色液b各50μl，37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μl/孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取od值。以免疫小鼠眼血清作为阳性对照，相关溶液配方如下：
包被液：na2co31.59g，nahco32.93g，加超纯水定容至1000ml(ph9.6)。
封闭液：na2hpo4.12h2o2.68g,nah2po4.2h2o0.39g,nacl8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000ml(ph7.4)。
洗涤液：na2hpo4.12h2o2.68g，nah2po4.2h2o0.39g，nacl8.5g，tween-200.5ml，加超纯水定容至1000ml(ph7.4)。
显色液a：200mgtmb溶于100ml无水乙醇，加超纯水定容至1000ml。
显色液b：柠檬酸2.1g，na2hpo4.12h2o71g，加超纯水定容至1000ml。
使用时：1ml显色液a+1ml显色液b+0.4μl30％h2o2
终止液：2mh2so4，21.7ml浓h2so4加超纯水定容至1000ml。
对于检测阳性的杂交瘤细胞，再使用有限稀释法进行亚克隆。经过三次亚克隆，共筛选得到5株杂交瘤细胞株(2c1、3a6、5f3、7b9、7d8)。
实施例8：单克隆抗体的大量制备及纯化
取6-8周龄的健康balb/c小鼠，腹腔注射液体石蜡，每只500μl，5天后腹腔注射杂交瘤细胞(约1×106个/只)，15天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水，12000rpm离心2分钟，收集上清，按1：2.5的比例加入60mmol/lph4.5的醋酸钠缓冲液，以每毫升腹水上清加入25μl正辛酸比例，在磁力搅拌器搅拌条件下缓慢加入正辛酸，在室温条件下继续搅拌30分钟后，4℃5000rpm离心30分钟，弃沉淀。上清4℃预冷，以1ml体积上清加入0.227g硫酸铵比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温条件下继续搅拌30min后，5000rpm离心15分钟，沉淀溶于体积1/10量的10mmol/lpbs(ph7.4)缓冲液中，10kda透析袋置于10mmol/lpbs(ph7.4)缓冲液中透析至无硫酸铵。将透析后的单抗用proteina亲和层析树脂纯化，洗涤后收集洗脱峰，即得到纯化后的单抗。
实施例9：胶体金颗粒标记单抗
取10ml0.01％胶体金溶液加入0.2mol/l碳酸钾溶液20ul，充分混匀后加入100ug抗体,室温反应2小时后添加10％牛血清白蛋白(bsa)1ml，封闭处理2小时后，离心(7500rpm/min、20分钟)，弃去上清后沉淀用1ml复溶液充分溶解，采用喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将复溶液按照10ul/cm均匀喷涂于玻璃纤维(宽度6mm)，再置于电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置2小时。
以上述方法分别对2c1、3a6、5f3、7b9、7d8单抗进行胶体金标记。相关溶液配方如下:
0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。
1％氯金酸溶液：1gaucl3.hcl.4h2o粉末加超纯水溶解并定容至100ml。
1％柠檬酸三钠溶液：1g柠檬酸三钠加超纯水溶解并定容至100ml。
复溶液：tris碱6.057g溶解于800ml双蒸水，用适量hcl调节ph至8.0，加双蒸水定容到1000ml。
实施例10：配对单抗的筛选
猫细小病毒单克隆抗体(2c1、3a6、5f3、7b9、7d8)分别经包被液稀释后(终浓度为1mg/ml)，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1ul/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(sartorius)，此为t线。通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将羊抗鼠溶液(终浓度为1mg/ml)按照1ul/cm均匀包被于硝酸纤维素膜，此为c线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置12小时。
按照常规工艺将样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、滤纸在pvc垫板上依次组装后切成宽4mm长条，装上试剂卡条壳并压紧。
fpv阳性血清样本和正常猫血清样本,100μl/孔上样，室温放置15min后，通过胶体金层析读数仪(上海捷浩科学仪器有限公司)分别读值并计算p/n值(阳性样本检测值与阴性样本检测值的比值)，详见表1。
以上述方法正交检测各包被单抗与胶体金标记单抗配对，求p/n值(阳性标本检测均值与阴性标本检测均值比值)，见表1。
表1配对单抗p/n值统计
通过上表可知，3a6单抗包被与7b9胶体金标记配对检测猫细小病毒为最佳组合。
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<110>杭州贤至生物科技有限公司
<120>一种猫细小病毒重组蛋白及其单克隆抗体的制备
<130>20191219
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<213>人工序列（artificial）
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<213>猫细小病毒（felineparvovirus）
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