纤维二糖差向异构酶基因、重组质粒及酶的生产方法与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉纤维二糖差向异构酶基因、重组质粒及酶的生产方法。

背景技术：

乳果糖(lactulose)是一种不易消化的二糖，其成品为黄色澄明液体，甜度相当于乳糖，但小于蔗糖，约48％-60％蔗糖，口感凉醇，粘度低，热量低，安全性高，稳定性好。此外，乳果糖可增值双歧杆菌的活性，是一种良好的双歧杆菌促进因子，因而，乳果糖在医药行业、食品和动物饲料领域得到了广泛的应用。

商业化的乳果糖主要是通过化学法制备的，但是化学法需要添加大量的催化剂，反应所需要的条件一般也比较激烈，得到的产物副产品较多，这些混合物给后续的产品分离带来了很大的不便。相比之下，生物酶法制备乳果糖具有很多优势，其反应条件温和，卫生安全，符合低碳经济和绿色环保的要求。

目前主要用于催化乳糖生成乳果糖的酶主要有糖苷水解酶(glycosidehydrolase，ec3.2.1)和纤维二糖差向异构酶(ces，ec5.1.3.11)。其中，纤维二糖差向异构酶(ces)能够直接催化单一乳糖生产乳果糖，是目前最高效的乳果糖制备用酶，因而受到了广泛的研究。然而，野生型的纤维二糖差向异构酶活力较低，一般通过构建基因工程菌的方式提高其表达水平。纤维二糖差向异构酶能够直接将乳糖上的葡萄糖基异构成果糖基从而生成乳果糖，是目前已知的酶法合成乳果糖方法中最为有效的酶。纤维二糖差向异构酶是一种嗜热酶，在高温下底物溶解度、反应速率都会提高，应用纤维二糖差向异构酶的好处在于它不需要额外添加底物果糖，成本低廉；而且转化率高、反应过程不易染菌，所以未来利用它进行商业化生产乳果糖的前景十分广阔。目前有研究表明利用重组大肠杆菌产纤维二糖差向异构酶并催化生产乳果糖的转化率较高。但是，乳果糖作为一种功能性低聚糖，在医药、保健、食品等领域有着较广泛的应用，安全性至关重要。大肠杆菌本身会产内毒素，带来很大的安全隐患，不适合在食品领域进行工业化应用。

因此，提供一种条件温和、易于纯化、卫生安全、环保、活力较高的纤维二糖差向异构酶生产方法，对于工业制备乳果糖具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种纤维二糖差向异构酶基因,一种重组质粒,一种用于生产乳果糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌,一种枯草芽孢杆菌基因工程菌在生产乳果糖中的应用以及生产纤维二糖差向异构酶的方法和生产乳果糖的方法。

为解决上述技术问题，本发明包含下述技术方案：

一种纤维二糖差向异构酶基因，所述基因具有如seqidno.1或如seqidno.2所示的核苷酸序列。

在本发明的一较佳实施例中，所述基因的核苷酸序列具有组氨酸标签的亲和性，基因下游还包括6-12个组氨酸标签。

一种重组质粒，将如权利要求1或者2所述的纤维二糖差向异构酶基因引入到载体的bamhi和xmal多克隆位点处。

在本发明的一较佳实施例中，所述的载体为pht43。

另外，本发明还提供了一种用于生产乳果糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌，采用如下方法制备，将上述所述重组质粒转入枯草芽孢杆菌而转化得到。

在本发明的一较佳实施例中，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌bacillussubtilisstr.168或bacillussubtiliswb800。

本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌基因工程菌在生产乳果糖中的应用。

另外，本发明还一种生产纤维二糖差向异构酶的方法，应用了上述的枯草芽孢杆菌基因工程菌进行发酵。

在本发明的一较佳实施例中，上述方法挑取枯草芽孢杆菌基因工程菌单菌落接种到lb培养基中，35-39℃、200-220rpm，培养10-20h，将培养液按5-10％的接种量接种到lb培养基中，先于35-39℃、200-220rpm，培养5-10h，当菌体od600在0.6-1.0时转至加入诱导剂，30-34℃、200-220rpm进行摇瓶诱导发酵1-48h，得枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵液，内含纤维二糖差向异构酶。

在本发明的一较佳实施例中，所述的诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷或者乳糖。

本发明的有益效果在于：(1)直接在发酵液中进行转化，避免了酶分离纯化过程中的酶活损失，有效降低成本，提高产率；(2)通过生物法制备乳果糖，安全无毒，操作方便，分离纯化相对简单且能耗低，绿色环保。

附图说明

图1为重组质粒pht43-m5的构建示意图；

图2枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）和枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m9）分别诱导的纤维二糖差向异构酶1和纤维二糖差向异构酶1在3h和6h后的酶活力图；

图3筛选后的wb800n（pht43-m5）在终浓度为0.1、0.5、1mm的iptg和诱导时间为0-48小时的酶活力检测曲线图；

图4枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）终浓度为0.1、0.5、1mm的iptg和诱导时间为18-48小时的sds-page检测蛋白条带图；

图5枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）终浓度为0.1、0.5、1mm的iptg和诱导时间为3-18小时的sds-page检测蛋白条带图；

图6枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m9）在终浓度为0.1、0.5、1mm的iptg和诱导时间为18-48小时的sds-page检测蛋白条带图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

(一)培养基

lb培养基(g/l)：蛋白胨10g/l，酵母提取物5，nacl10。

gm培养基：lb+0.5m山梨醇

rm培养基：lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇

etm电转缓冲液：0.5m山梨醇+0.5m甘露醇+10%甘油

(二)酶活的定义及测定方法

发酵液的酶活的测定。

取0.5ml含有重组菌的细胞发酵液，0.5ml乳糖溶液，使乳糖浓度为200g/l，混合均匀后在75℃反应2小时，沸水浴灭酶5min后取样hplc法测定样液体系中的乳果糖的生成量，以等量的50mmph7.5tris-hcl缓冲液代替发酵液作为空白对照，以每分钟催化乳糖生成1μmol乳果糖所需的发酵液定义为1u，后续生产中以发酵液的酶活力计量。

实施例1：纤维二糖差向异构酶基因1的合成.

根据宿主枯草芽孢杆菌密码子的偏好优化，通过基因全合成的方法合成seqidno.1所示的核苷酸序列，同时，为了便于纯化，在下游引入组氨酸标签his6。

实施例2：纤维二糖差向异构酶基因2的合成.

根据宿主枯草芽孢杆菌密码子的偏好优化，通过基因全合成的方法合成seqidno.2所示的核苷酸序列，同时，为了便于纯化，在下游引入组氨酸标签his6。

实施例3：重组质粒pht43-m5的构建过程

将纤维二糖差向异构酶基因1连接到pht43载体的bamhi和xmal多克隆位点处上，得到重组质粒pht43-m5，其主要结构如图1所示。

实施例4：重组质粒pht43-m9的构建过程

将纤维二糖差向异构酶基因2连接到pht43载体的bamhi和xmal多克隆位点处上，得到重组质粒pht43-m9。

实施例5：bacillussubtiliswb800感受态的制备

从活化的枯草芽孢杆菌bacillussubtiliswb800菌种平板上挑取单菌落于5mllb液体培养基中，在37℃、200rpm培养16h，按1%的接种量转接到100mlgm培养基中，37℃、200rpm培养6h左右至od600=0.8-1.0。于5000rpm、4℃下离心5min，用etm电转缓冲液洗两次后，用1/40etm电转缓冲液重悬菌体，60μl/管分装后保存于-80℃。

实施例6枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）的构建

取出电转化杯，晾干后于冰上预冷。加入含有5μl质粒pht43-m5的bacillussubtiliswb800n感受态细胞于冰上预冷1-1.5min后，在1500kv下电击后立马加入含有1mlrm复苏培养基，取出放入1.5mlep管在37℃水浴3h后，涂布于含有氯霉素（10μg/ml）的lb平板，37℃培养。

实施例7枯草芽孢杆菌工程菌wb800n（pht43-m9）

取出电转化杯，晾干后于冰上预冷。加入含有5μl质粒pht43-m9的wb800n感受态细胞于冰上预冷1-1.5min后，在1500kv下电击后立马加入含有1mlrm复苏培养基，取出放入1.5mlep管在37℃水浴3h后，涂布于含有氯霉素（10μg/ml）的lb平板，37℃培养。

实施例8纤维二糖差向异构酶1和纤维二糖差向异构酶2的诱导表达和酶活力检测

在枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）、枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m9）转化子平板上分别随机挑取2、4个转化子接入5mllb（含有34μg/ml的氯霉素），37℃、200rpm培养16h，转接入含有34μg/ml的氯霉素的100mllb培养基中于37℃、200rpm培养6h左右至od600=0.6-0.8。加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度1mm，分别在37℃、200rpm诱导3h和6h，分别检测枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）诱导的纤维二糖差向异构酶1和枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m9）诱导的纤维二糖差向异构酶2的酶活力，请参阅图2所示。

选择图1中枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）活力较高的5-1和枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m9）活力较高的9-4分别重新记为枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）和枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m9），分别在终浓度为0.1、0.5、1mm的iptg，37℃下诱导3h、6h、18h、24h和48h检测表达酶活力，请参阅图2所示。，sds-page检测蛋白条带（请分别参阅图4、图5、图6）。由此可见，枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）诱导的纤维二糖差向异构酶1的酶活力和枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m9）诱导的纤维二糖差向异构酶2的酶活力的酶活力随浓度和时间变化趋势不大，证明枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m5）、枯草芽孢杆菌基因工程菌wb800n（pht43-m9）的催化稳定性良好。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江苏汉斯通药业有限公司

<120>纤维二糖差向异构酶基因、重组质粒及酶的生产方法

<130>n-1

<160>2

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>1173

<212>dna

<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)

<400>1

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<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)

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