一种链球菌新型选择性标记和应用的制作方法

本发明属于分子生物技术领域，涉及用于转化生物的选择标记基因，尤其是一种链球菌新型选择性标记和应用。

背景技术：

选择性标记是一种可以检测的遗传性状或能够被鉴定和追踪的dna区段。选择性标记基因在基因功能研究和工程菌株构建过程中具有重要的作用。目前，链球菌常用的选择性标记有：红霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、氯霉素抗性基因。这些选择性标记都是基于抗生素抗性的选择性标记。抗生素抗性标记使用具有一定的安全风险，特别是在工业微生物领域受到很大的限制。一种新的基于非抗生素抗性的选择性标记不仅能够在基因功能研究方面与现有的遗传标记互相补充，还能够降低抗生素抗性的使用所造成的安全风险。

氟是地球上存在的主要元素之一，约占地壳组成的0.78g/kg。主要以氟化物的形式存在于岩石和土壤中。日常使用的口腔护理产品、某些国家和地区的饮用水中也有一定浓度的氟化物，氟化物在龋齿预防方面发挥着重要的作用。高浓度的氟化物对细菌细胞有毒性。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种链球菌新型选择性标记和应用，该标记增加了一个新的非抗生素抗性的筛选标记，其能够代替传统的抗生素抗性基因作为遗传筛选标记使用，从而能够降低因抗生素抗性的使用所造成的安全风险。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种链球菌新型选择性标记，所述标记由启动子ldhp和基因smu1289组成。

而且，所述启动子ldhp的核苷酸序列为seqidno.1，所述基因smu1289的核苷酸序列为seqidno.2。

而且，所述启动子ldhp与基因smu1289组合而成的功能性氟化物抗性基因序列为seqidno.3。

如上所述的链球菌新型选择性标记在作为链球菌选择性标记方面中的应用。

而且，所述应用为：将启动子ldhp和基因smu1289连接入质粒pdl278构建重组质粒，所述重组质粒导入宿主菌，在氟化钠抗性条件下筛选，获得转化子。

而且，所述氟化钠抗性条件为：含有氟化钠抗性的固体培养基。

而且，所述固体培养基为：ph6.0，氟化钠浓度为75ug/ml的thb培养基。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明标记增加了一个新的非抗生素抗性的筛选标记，其能够代替传统的抗生素抗性基因作为遗传筛选标记使用，从而能够降低因抗生素抗性的使用所造成的安全风险。

2、本发明涉及氟化物转运蛋白编码基因作为选择性标记在链球菌遗传转化中的应用。氟化物广泛存在于自然界中，高浓度的氟化物能够抑制细胞的生长。我们前期研究在变型链球菌中发现一个氟化物转运蛋白编码基因，该基因的过表达能够赋予细胞对高浓度氟化物的抗性。利用该氟化物抗性基因作为选择性标记，成功实现了遗传转化子筛选。在基因功能研究和遗传工程菌株改造方面，该氟化物抗性基因能够代替传统的抗生素抗性基因作为遗传筛选标记使用，从而能够降低因抗生素抗性的使用所造成的安全风险。

附图说明

图1为本发明中变形链球菌野生型与smu1291转座子的耐氟性检测图；

图2为本发明中变形链球菌野生型与△smu1291的耐氟性检测图；

图3为本发明中变形链球菌野生型与ldhp::smu1289-1290的耐氟性检测图；

图4为本发明中变形链球菌野生型与△smu1289的耐氟性检测图；

图5为本发明中变形链球菌野生型与ldhp::smu1289的耐氟性检测图；

图6为本发明中pdl278::ldhp::smu1289的选择性标记转化子图；其中，左图：n，右图：转化子；

图7为本发明中pdl278::ldhp::smu1289的选择性标记转化子pcr验证图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种链球菌新型选择性标记，所述标记由启动子ldhp和基因smu1289组成。

较优地，所述启动子ldhp的核苷酸序列为seqidno.1，所述基因smu1289的核苷酸序列为seqidno.2。

较优地，所述启动子ldhp与基因smu1289组合而成的功能性氟化物抗性基因序列为seqidno.3。

如上所述的链球菌新型选择性标记在作为链球菌选择性标记方面中的应用。

较优地，所述应用为：将启动子ldhp和基因smu1289连接入质粒pdl278构建重组质粒，所述重组质粒导入宿主菌，在氟化钠抗性条件下筛选，获得转化子。

较优地，所述氟化钠抗性条件为：含有氟化钠抗性的固体培养基。

较优地，所述固体培养基为：ph6.0，氟化钠浓度为75ug/ml的thb培养基。

本发明中链球菌新型选择性标记基于筛选氟化物抗性菌株的现象所发现。

本发明中运用转座诱变系统获得变形链球菌smu1291转座子具有氟化物抗性，如图1所示。

本发明中smu1291转座子具有氟化物抗性，△smu1291菌株(基因smu1291的敲除菌)未具有氟化物抗性。

本发明中△smu1291菌株(基因smu1291的敲除菌)未具有氟化物抗性，ldhp：：smu1289-1290具有氟化物抗性。

本发明中ldhp::smu1289-1290(基因smu1289-smu1290的过表达菌株)具有氟化物抗性，△smu1289菌株(基因smu1289的敲除菌)未具有氟化物抗性。

本发明中△smu1289(基因smu1289的敲除菌)未具有氟化物抗性，ldhp::smu189(基因smu1289的过表达菌株)具有氟化物抗性，即基因smu1289的过表达菌株恢复氟化物抗性。

本发明中ldhp::smu1289具有氟化物抗性，构建pdl278::ldhp::smu1289，检测氟化物选择性标记可用。

更具体地，相关构建步骤如下：

一、构建基因smu1291的无痕敲除菌，

1.1合成引物

smu1291upf：gtgtaaacttccacgagattc

smu1291downr：gtaaccaaatcagtactcagc

smu1291upr-ifdc2：gctatgagtgttattgttgctccatagcctctccttttactt

smu1291downf-ifdc2：aggtatactactgacagcttctaagatcaagtcttttcttgattt

ifdc2f：gagcaacaataacactcatagc

ifdc2r：gaagctgtcagtagtatacct

smu1291upr：gatcttaatccccatctaatgccatagcctctccttttactt，

smu1291downf：aagtaaaaggagaggctatggcattagatggggattaagatc

1.2以变形链球菌ua159为模板，采用smu1291upf，smu1291upr-ifdc2引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1291upf)2μl，引物2(10μmsmu1291upr-ifdc2)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃31秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1019bp大小片段smu1291up-ifdc2。

1.3以变形链球菌ua159为模板，采用smu1291downf-ifdc2，smu1291downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1291downf-ifdc2)2μl，引物2(10μmsmu1291downr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃27秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约879bp大小片段smu1291down-ifdc2。

1.4以ifdc2为模板，采用ifdc2f，ifdc2r引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmifdc2f)2μl，引物2(10μmifdc2r)2μl，模板(100ng/μlifdc2)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃1分6秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约2156bp大小片段ifdc2。

1.5将上述三个片段进行重叠pcr，采用smu1291upf，smu1291downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1291upf)2μl，引物2(10μmsmu1291downr)2μl，模板(100ng/μlsmu1291up，smu1291down，ifdc2)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃2分2秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约4011bp大小片段△smu1291-ifdc2。

1.6将重叠pcr产物转化变形链球菌ua159。转化方法如下：

挑取变型链球菌ua159的单菌落接种到thye液体培养基(toddhewittbroth,oxoid,36.5g/l,yeastextract,oxoid,3g/l)中，37℃厌氧罐中培养16-18h，待菌液长起后按5％的接种量转接到新的thye培养基中，再放在37℃厌氧罐中培养2-3h，od值为0.2-0.3。取500μlod达0.2-0.3的菌液放入1.5ml无菌离心管中，再加入5μl浓度为0.1mg/ml的csp(competencestimulatingpeptide:sgslstffrlfnrsftqa)，加入连接产物10μl，再放在37℃厌氧罐中培养3h，取100μl涂板bhi(brainheartinfusin,oxoid)平板(含12.5ug/ml红霉素)，厌氧培养24小时。转化子培养提取基因组，经pcr验证，验证引物smu1291upf，smu1291downr。获得基因smu1291的敲除菌。

1.7以变形链球菌ua159为模板，采用smu1291upf，smu1291upr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1291upf)2μl，引物2(10μmsmu1291upr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃31秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1019bp大小片段smu1291upifd。

1.8以变形链球菌ua159为模板，采用smu1291downf，smu1291downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1291downf)2μl，引物2(10μmsmu1291downr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃27秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约893bp大小片段smu1291downifd。

1.9以smu1291upifd、smu1291downifd为模板，采用smu1291upf，smu1291downr引物对进行重叠pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1291upf)2μl，引物2(10μmsmu1291downr)2μl，模板(100ng/μlsmu1291upifd，smu1291downifd)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃57秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1870bp大小片段△smu1291ifd。

1.10将重叠pcr产物转化变形链球菌smu1291敲除菌。转化方法如下：

挑取变型链球菌smu1291敲除菌的单菌落接种到thye液体培养基(toddhewittbroth,oxoid,36.5g/l,酵母膏,oxoid,3g/l)中，37℃厌氧罐中培养16-18h，待菌液长起后按5％的接种量转接到新的thye培养基中，再放在37℃厌氧罐中培养2-3h，od值为0.2-0.3。取500μlod达0.2-0.3的菌液放入1.5ml无菌离心管中，再加入5μl浓度为0.1mg/ml的csp(competencestimulatingpeptide:sgslstffrlfnrsftqa)，加入连接产物10μl，再放在37℃厌氧罐中培养3h，取100μl涂板bhi(brainheartinfusin,oxoid)平板(含对氯苯丙氨酸)，厌氧培养24小时。转化子培养提取基因组，经pcr验证，验证引物smu1291upf，smu1291downr。获得基因smu1291的无痕敲除菌。

1.11检测smu1291无痕敲除菌的氟化物抗性：

变形链球菌野生型在培养基ph6.0，氟化物75ug/ml时不生长，smu1291的无痕敲除菌在氟化物75ug/ml时不生长。说明未增加其耐氟性，如图2所示。

二、构建基因smu1289-1290的过表达菌株

2.1构建基因smu1289和smu1290的过表达，

合成引物：

smu1289-1290upf：gtgtaaacttccacgagattc

smu1289-1290upr：gctatgagtgttattgttgctccatagcctctccttttactt

smu1289-1290downf：

attataaggagatgttctcgaggcattagatggggattaagatc

smu1289-1290downr：gtaaccaaatcagtactcagc

ldhf：gagcaacaataacactcatagc

ldhr：ctcgagaacatctccttataat

2.2以变形链球菌ua159为模板，采用smu1289-1290upf，smu1289-1290upr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1289-1290upf)2μl，引物2(10μmsmu1289-1290upr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃31秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1020bp大小片段smu1289-90up。

2.3以变形链球菌ua159为模板，采用smu1289-1290downf，smu1289-1290downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1289-1290downf)2μl，引物2(10μmsmu1289-1290downr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃27秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约895bp大小片段smu1289-1290down。

2.4以ifdc2为模板，采用ldhf，ldhr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmldhf)2μl，引物2(10μmldhr)2μl，模板(100ng/μlifdc2)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃9秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约273bp大小片段ldhp。

2.5将上述三个片段进行重叠pcr，采用smu1289-1290upf，smu1289-1290downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1289-1290upf)2μl，引物2(10μmsmu1289-1290downr)2μl，模板(100ng/μlsmu1289-1290up，smu1289-1290down)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃1分6秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约2143bp大小片段ldhp::smu1289-1290。

2.6将重叠pcr产物转化变形链球菌smu1291敲除菌。转化方法如下：

挑取变型链球菌smu1291敲除菌的单菌落接种到thye液体培养基(toddhewittbroth,oxoid,36.5g/l,yeastextract,oxoid,3g/l)中，37℃厌氧罐中培养16-18h，待菌液长起后按5％的接种量转接到新的thye培养基中，再放在37℃厌氧罐中培养2-3h，od值为0.2-0.3。取500μlod达0.2-0.3的菌液放入1.5ml无菌离心管中，再加入5μl浓度为0.1mg/ml的csp(competencestimulatingpeptide:sgslstffrlfnrsftqa)，加入连接产物10μl，再放在37℃厌氧罐中培养3h，取100μl涂板bhi(brainheartinfusin,oxoid)平板(含对氯苯丙氨酸)，厌氧培养24小时。转化子培养提取基因组，经pcr验证，验证引物smu1289-1290upf,smu1289-1290downr。获得基因smu1289-1290的过表达菌株。

2.7检测smu1289-1290过表达菌株的氟化物抗性：

变形链球菌野生型在培养基ph6.0，氟化物为75ug/ml时不生长，smu1289-1290的过表达菌株在氟化物75ug/ml时生长。说明耐氟性增加，如图3所示。

三、构建基因smu1289的敲除菌株

3.1合成引物：

smu1289upf：gtatcaaaggaatgagtttg

smu1289upr-ifdc2：gctatgagtgttattgttgctcttcaatcataatgctttcttt

smu1289downf-ifdc2：aggtatactactgacagcttcgattagagaaaagtagcttactc

smu1289downr：gaaacgaagattattcggc

smu1289upr：gagtaagctacttttctctaatcttcaatcataatgctttcttt

smu1289downf：aaagaaagcattatgattgaagattagagaaaagtagcttactc

3.2以变形链球菌ua159为模板，采用smu1289upf，smu1289upr-ifdc2引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1289upf)2μl，引物2(10μmsmu1289upr-ifdc2)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃34秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1105bp大小片段smu1289up-ifdc2。

3.3以变形链球菌ua159为模板，采用smu1289downf-ifdc2，smu1289downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1289downf-ifdc2)2μl，引物2(10μmsmu1289downr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃31秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1082bp大小片段smu1289down-ifdc2。

3.4以ifdc2为模板，采用ifdc2f，ifdc2r引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmifdc2f)2μl，引物2(10μmifdc2r)2μl，模板(100ng/μlifdc2)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃1分6秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约2156bp大小片段ifdc2。

3.5将上述三个片段进行重叠pcr，采用smu1289upf，smu1289downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1289upf)2μl，引物2(10μmsmu1289downr)2μl，模板(100ng/μlsmu1289up，smu1289down，ifdc2)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃2分9秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约4300bp大小片段△smu1289-ifdc2。

3.6将重叠pcr产物转化变形链球菌smu1289-1290过表达菌株。转化方法如下：

挑取变型链球菌smu1289-1290过表达菌株的单菌落接种到thye液体培养基(toddhewittbroth,oxoid,36.5g/l,yeastextract,oxoid,3g/l)中，37℃厌氧罐中培养16-18h，待菌液长起后按5％的接种量转接到新的thye培养基中，再放在37℃厌氧罐中培养2-3h，od值为0.2-0.3。取500μlod达0.2-0.3的菌液放入1.5ml无菌离心管中，再加入5μl浓度为0.1mg/ml的csp(competencestimulatingpeptide:sgslstffrlfnrsftqa)，加入连接产物10μl，再放在37℃厌氧罐中培养3h，取100μl涂板bhi(brainheartinfusin,oxoid)平板(含12.5ug/ml红霉素)，厌氧培养24小时。转化子培养提取基因组，经pcr验证，验证引物smu1289upf,smu1289downr。获得基因smu1289的敲除菌株。

3.7以变形链球菌ua159为模板，采用smu1289upf，smu1289upr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1289upf)2μl，引物2(10μmsmu1289upr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃34秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1106bp大小片段smu1289up。

3.8以变形链球菌ua159为模板，采用smu1289downf，smu1289downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1289downf)2μl，引物2(10μmsmu1289downr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃31秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1082bp大小片段smu1289down。

3.9将上述两个片段进行重叠pcr，采用smu1289upf，smu1289downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmsmu1289upf)2μl，引物2(10μmsmu1289downr)2μl，模板(100ng/μlsmu1289up，smu1289down)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃1分6秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约2144bp大小片段△smu1289ifd。

3.10将重叠pcr产物转化变形链球菌smu1289敲除菌株。转化方法如下：

挑取变型链球菌smu1289敲除菌的单菌落接种到thye液体培养基(toddhewittbroth,oxoid,36.5g/l,yeastextract,oxoid,3g/l)中，37℃厌氧罐中培养16-18h，待菌液长起后按5％的接种量转接到新的thye培养基中，再放在37℃厌氧罐中培养2-3h，od值为0.2-0.3。取500μlod达0.2-0.3的菌液放入1.5ml无菌离心管中，再加入5μl浓度为0.1mg/ml的csp(competencestimulatingpeptide:sgslstffrlfnrsftqa)，加入连接产物10μl，再放在37℃厌氧罐中培养3h，取100μl涂板bhi(brainheartinfusin,oxoid)平板(含对氯苯丙氨酸)，厌氧培养24小时。转化子培养提取基因组，经pcr验证，验证引物smu1289upf,smu1289downr。获得基因smu1289的无痕敲除菌株。

3.11检测smu1289无痕敲除菌的氟化物抗性：

变形链球菌野生型在培养基ph6.0，氟化物为75ug/ml时不生长，smu1289无痕敲除菌株在氟化物75ug/ml时不生长。说明未提高耐氟性，如图4所示。

四、构建smu1289的过表达菌株

4.1合成引物：

ldhp::smu1289upf：gtgtaaacttccacgagattc

ldhp::smu1289upr：aatcaggtgatattaagcagtaacgatcttaatccccatctaatgc

ldhp::smu1289downf：gcattagatggggattaagatcgttactgcttaatatcacctgatt

ldhp::smu1289downr：gaaggtattagttgcactgc

4.2以变形链球菌ldhp::smu1289-1290为模板，采用ldhp::smu1289upf，ldhp::smu1289upr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmldhp::smu1289upf)2μl，引物2(10μmldhp::smu1289upr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃40秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1316bp大小片段ldhp::smu1289up。

4.3以变形链球菌ua159为模板，采用ldhp::smu1289downf，ldhp::smu1289downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmldhp::smu1289downf)2μl，引物2(10μmldhp::smu1289downr)2μl，模板(100ng/μlua159)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃37秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1208bp大小片段ldhp::smu1289down。

4.4将上述两个片段进行重叠pcr，采用ldhp::smu1289upf，ldhp::smu1289downr引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmldhp::smu1289upf)2μl，引物2(10μmldhp::smu1289downr)2μl，模板(100ng/μlsmu1289up，smu1289down)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃1分6秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约2143bp大小片段。

4.5将重叠pcr产物转化变形链球菌smu1289-1290过表达菌株。转化方法如下：

挑取变型链球菌smu1289-1290过表达菌株的单菌落接种到thye液体培养基(toddhewittbroth,oxoid,36.5g/l,yeastextract,oxoid,3g/l)中，37℃厌氧罐中培养16-18h，待菌液长起后按5％的接种量转接到新的thye培养基中，再放在37℃厌氧罐中培养2-3h，od值为0.2-0.3。取500μlod达0.2-0.3的菌液放入1.5ml无菌离心管中，再加入5μl浓度为0.1mg/ml的csp(competencestimulatingpeptide:sgslstffrlfnrsftqa)，加入连接产物10μl，再放在37℃厌氧罐中培养3h，取100μl涂板bhi(brainheartinfusin,oxoid)平板(含对氯苯丙氨酸)，厌氧培养24小时。转化子培养提取基因组，经pcr验证，验证引物ldhp::smu1289upf,ldhp::smu1289downr。获得基因smu1289的过表达菌株。

4.6检测smu1289过表达菌的氟化物抗性：

变形链球菌野生型在培养基ph6.0，氟化物为75ug/ml时不生长，smu1289无痕敲除菌株在氟化物75ug/ml时生长。说明耐氟性增加，如图5所示。

五、构建smu1289过表达载体

5.1合成引物

ldhp::smu1289f：cggaattcgagcaacaataacactcatagc

ldhp::smu1289r：cgggatccgagtaagctacttttctctaatctc

5.2以变形链球菌smu1289过表达菌株为模板，采用ldhp::smu1289f，ldhp::smu1289r引物对进行pcr扩增，50ul扩增体系中含有如下组分：5xphusionhfbuffer(neb)10μl，2.5mmdntps4μl，引物1(10μmldhp::smu1289f)2μl，引物2(10μmldhp::smu1289r)2μl，模板(100ng/μlsmu1289过表达菌株)1μl，phusiondnapolymerase(2u/ul)(neb)0.5μl，去离子水30.5μl。pcr扩增条件如下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃51秒，共30个循环；72℃5分钟。pcr扩增产物进行纯化获得约1646bp大小片段ldhp::smu1289(seqidno.3ldhp::smu1289)。

5.3用ecori、bamhi酶切载体pdl278和上述片段。用t4连接酶25℃连接30min，然后加入大肠杆菌感受态中，静置30min，42℃热激90秒，冰浴5min，加入1mllb培养基，37℃200rpm摇45min，离心涂布lb(壮观霉素)培养基。37℃培养12h后，挑菌，提质粒，pcr验证pdl278::ldhp::smu1289。

5.4构建正确的重组质粒转化变形链球菌ua159。转化方法如下：

挑取变型链球菌ua159的单菌落接种到thye液体培养基(toddhewittbroth,oxoid,36.5g/l,yeastextract,oxoid,3g/l)中，37℃厌氧罐中培养16-18h，待菌液长起后按5％的接种量转接到新的thye培养基中，再放在37℃厌氧罐中培养2-3h，od值为0.2-0.3。取500μlod达0.2-0.3的菌液放入1.5ml无菌离心管中，再加入5μl浓度为0.1mg/ml的csp(competencestimulatingpeptide:sgslstffrlfnrsftqa)，加入连接产物10μl，再放在37℃厌氧罐中培养3h，取100μl涂板bhi(brainheartinfusin,oxoid)平板(含75ug/ml氟化钠，ph6.0)，厌氧培养24小时。转化子培养提取基因组，经pcr验证，验证引物ldhpf,smu1289r。验证结果表明所有克隆都包含目标质粒，说明氟化物抗性标记可以作为遗传标记进行遗传转化子的筛选，如图6和图7所示。

seqidno.1ldhp：

ccgagcaacaataacactcatagcatagtcaataaaactcgtcttcatttcacttgttaaattgacatctactaaatttctatcttgcattaaaaaatgcctcatttctagtctaaaactcttttatattatatcacaaataaggctctttttcagctattctactatagttttccgctgagaaaggtaaatattagtgactttcttaacaaaaagtgttagaatgaaaatgtatagaatatatacttaataaattataaggagatgttseqidno.2smu1289：

atgattgaaaaaaagattaaagaagcaaatgaactgtcttactctattttgctttacttagcttttatgggattgctaattggtgcccttgtaggtcttgttgatactatctttggacgagttttaatctatttgagtgctgttagagatgctaatccttggtactggcttccctttttgggaatcgctggtttaataattgtttatttatatcaaaagtggggtgctaaaagcagtaaggggatgggtttaatatttcaagtaggttttgaagaggaagaccatatccctaaacgcctcattcccatggttattgtcacaacatggttgactcatctttgtggcggcagcgctggccgtgaaggtgtcgctgtccaactaggtgcgacagtttctcactggtttagccgattattccattttcccaataaatcgcgtatttttctgctttcaggaatggctgcaggttttgcaggtttgtatcagacgcccatggcagctatactatttgctttagaagtattagttcttggtaatctaggactttctgctttggttccaatgaccattgcttcttttacggctagtttgacctctcatagtcttggtttagaaaaatttgcacataccctgtcaaggacaatttctttgacaccgactgtttttattcagttgcttattttaggacttatctttggtttagcaggcaatttatttgcttttttattagcttggtgcaagcaagtgcaagcacgcctgcttcctaatctttatagacgtatttttattgtcggcttgctgcttagtttactttttctagtcctttatcaaggacgttattctggtttggggactaatctgatttctgctagcttttctgatgggaaaatttatgtctatgattggctactaaagctttttctaacagttataactctggcagcaggttttcaaggtggagaagtgacgcctttatttgctatcggttcttctttgggcgttgttttagcaggcatttttcatctgcctttagaatttgtggcagctctgggctatatttctgtctttggcagtgcaactaataccttcttagctccaattttaattggtggtgaagtctttggttatcagaatttaccagcttattttatcgcggtgacctttgcttatgttgttaatcgtaagcagtctatttactcgcttcaaaaaattagagattagseqidno.3ldhp::smu1289：

cggaattcgagcaacaataacactcatagcatagtcaataaaactcgtcttcatttcacttgttaaattgacatctactaaatttctatcttgcattaaaaaatgcctcatttctagtctaaaactcttttatattatatcacaaataaggctctttttcagctattctactatagttttccgctgagaaaggtaaatattagtgactttcttaacaaaaagtgttagaatgaaaatgtatagaatatatacttaataaattataaggagatgttctcgaggcattagatggggattaagatcgttactgcttaatatcacctgattaattaaaaagaagaatcctattgataagataagtatccttttcttatcacgtattttataaaaagaaagcattatgattgaaaaaaagattaaagaagcaaatgaactgtcttactctattttgctttacttagcttttatgggattgctaattggtgcccttgtaggtcttgttgatactatctttggacgagttttaatctatttgagtgctgttagagatgctaatccttggtactggcttccctttttgggaatcgctggtttaataattgtttatttatatcaaaagtggggtgctaaaagcagtaaggggatgggtttaatatttcaagtaggttttgaagaggaagaccatatccctaaacgcctcattcccatggttattgtcacaacatggttgactcatctttgtggcggcagcgctggccgtgaaggtgtcgctgtccaactaggtgcgacagtttctcactggtttagccgattattccattttcccaataaatcgcgtatttttctgctttcaggaatggctgcaggttttgcaggtttgtatcagacgcccatggcagctatactatttgctttagaagtattagttcttggtaatctaggactttctgctttggttccaatgaccattgcttcttttacggctagtttgacctctcatagtcttggtttagaaaaatttgcacataccctgtcaaggacaatttctttgacaccgactgtttttattcagttgcttattttaggacttatctttggtttagcaggcaatttatttgcttttttattagcttggtgcaagcaagtgcaagcacgcctgcttcctaatctttatagacgtatttttattgtcggcttgctgcttagtttactttttctagtcctttatcaaggacgttattctggtttggggactaatctgatttctgctagcttttctgatgggaaaatttatgtctatgattggctactaaagctttttctaacagttataactctggcagcaggttttcaaggtggagaagtgacgcctttatttgctatcggttcttctttgggcgttgttttagcaggcatttttcatctgcctttagaatttgtggcagctctgggctatatttctgtctttggcagtgcaactaataccttcttagctccaattttaattggtggtgaagtctttggttatcagaatttaccagcttattttatcgcggtgacctttgcttatgttgttaatcgtaagcagtctatttactcgcttcaaaaaattagagattagagaaaagtagcttactcggatcccg

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110>天津科技大学

<120>一种链球菌新型选择性标记和应用

<160>29

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>269

<212>dna

<213>启动子ldhp(unknown)

<400>1

ccgagcaacaataacactcatagcatagtcaataaaactcgtcttcatttcacttgttaa60

attgacatctactaaatttctatcttgcattaaaaaatgcctcatttctagtctaaaact120

cttttatattatatcacaaataaggctctttttcagctattctactatagttttccgctg180

agaaaggtaaatattagtgactttcttaacaaaaagtgttagaatgaaaatgtatagaat240

atatacttaataaattataaggagatgtt269

<210>2

<211>1221

<212>dna

<213>基因smu1289(unknown)

<400>2

atgattgaaaaaaagattaaagaagcaaatgaactgtcttactctattttgctttactta60

gcttttatgggattgctaattggtgcccttgtaggtcttgttgatactatctttggacga120

gttttaatctatttgagtgctgttagagatgctaatccttggtactggcttccctttttg180

ggaatcgctggtttaataattgtttatttatatcaaaagtggggtgctaaaagcagtaag240

gggatgggtttaatatttcaagtaggttttgaagaggaagaccatatccctaaacgcctc300

attcccatggttattgtcacaacatggttgactcatctttgtggcggcagcgctggccgt360

gaaggtgtcgctgtccaactaggtgcgacagtttctcactggtttagccgattattccat420

tttcccaataaatcgcgtatttttctgctttcaggaatggctgcaggttttgcaggtttg480

tatcagacgcccatggcagctatactatttgctttagaagtattagttcttggtaatcta540

ggactttctgctttggttccaatgaccattgcttcttttacggctagtttgacctctcat600

agtcttggtttagaaaaatttgcacataccctgtcaaggacaatttctttgacaccgact660

gtttttattcagttgcttattttaggacttatctttggtttagcaggcaatttatttgct720

tttttattagcttggtgcaagcaagtgcaagcacgcctgcttcctaatctttatagacgt780

atttttattgtcggcttgctgcttagtttactttttctagtcctttatcaaggacgttat840

tctggtttggggactaatctgatttctgctagcttttctgatgggaaaatttatgtctat900

gattggctactaaagctttttctaacagttataactctggcagcaggttttcaaggtgga960

gaagtgacgcctttatttgctatcggttcttctttgggcgttgttttagcaggcattttt1020

catctgcctttagaatttgtggcagctctgggctatatttctgtctttggcagtgcaact1080

aataccttcttagctccaattttaattggtggtgaagtctttggttatcagaatttacca1140

gcttattttatcgcggtgacctttgcttatgttgttaatcgtaagcagtctatttactcg1200

cttcaaaaaattagagattag1221

<210>3

<211>1646

<212>dna

<213>功能性氟化物抗性基因(unknown)

<400>3

cggaattcgagcaacaataacactcatagcatagtcaataaaactcgtcttcatttcact60

tgttaaattgacatctactaaatttctatcttgcattaaaaaatgcctcatttctagtct120

aaaactcttttatattatatcacaaataaggctctttttcagctattctactatagtttt180

ccgctgagaaaggtaaatattagtgactttcttaacaaaaagtgttagaatgaaaatgta240

tagaatatatacttaataaattataaggagatgttctcgaggcattagatggggattaag300

atcgttactgcttaatatcacctgattaattaaaaagaagaatcctattgataagataag360

tatccttttcttatcacgtattttataaaaagaaagcattatgattgaaaaaaagattaa420

agaagcaaatgaactgtcttactctattttgctttacttagcttttatgggattgctaat480

tggtgcccttgtaggtcttgttgatactatctttggacgagttttaatctatttgagtgc540

tgttagagatgctaatccttggtactggcttccctttttgggaatcgctggtttaataat600

tgtttatttatatcaaaagtggggtgctaaaagcagtaaggggatgggtttaatatttca660

agtaggttttgaagaggaagaccatatccctaaacgcctcattcccatggttattgtcac720

aacatggttgactcatctttgtggcggcagcgctggccgtgaaggtgtcgctgtccaact780

aggtgcgacagtttctcactggtttagccgattattccattttcccaataaatcgcgtat840

ttttctgctttcaggaatggctgcaggttttgcaggtttgtatcagacgcccatggcagc900

tatactatttgctttagaagtattagttcttggtaatctaggactttctgctttggttcc960

aatgaccattgcttcttttacggctagtttgacctctcatagtcttggtttagaaaaatt1020

tgcacataccctgtcaaggacaatttctttgacaccgactgtttttattcagttgcttat1080

tttaggacttatctttggtttagcaggcaatttatttgcttttttattagcttggtgcaa1140

gcaagtgcaagcacgcctgcttcctaatctttatagacgtatttttattgtcggcttgct1200

gcttagtttactttttctagtcctttatcaaggacgttattctggtttggggactaatct1260

gatttctgctagcttttctgatgggaaaatttatgtctatgattggctactaaagctttt1320

tctaacagttataactctggcagcaggttttcaaggtggagaagtgacgcctttatttgc1380

tatcggttcttctttgggcgttgttttagcaggcatttttcatctgcctttagaatttgt1440

ggcagctctgggctatatttctgtctttggcagtgcaactaataccttcttagctccaat1500

tttaattggtggtgaagtctttggttatcagaatttaccagcttattttatcgcggtgac1560

ctttgcttatgttgttaatcgtaagcagtctatttactcgcttcaaaaaattagagatta1620

gagaaaagtagcttactcggatcccg1646

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>smu1291upf(unknown)

<400>4

gtgtaaacttccacgagattc21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>smu1291downr(unknown)

<400>5

gtaaccaaatcagtactcagc21

<210>6

<211>42

<212>dna

<213>smu1291upr-ifdc2(unknown)

<400>6

gctatgagtgttattgttgctccatagcctctccttttactt42

<210>7

<211>45

<212>dna

<213>smu1291downf-ifdc2(unknown)

<400>7

aggtatactactgacagcttctaagatcaagtcttttcttgattt45

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>ifdc2f(unknown)

<400>8

gagcaacaataacactcatagc22

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>ifdc2r(unknown)

<400>9

gaagctgtcagtagtatacct21

<210>10

<211>42

<212>dna

<213>smu1291upr(unknown)

<400>10

gatcttaatccccatctaatgccatagcctctccttttactt42

<210>11

<211>42

<212>dna

<213>smu1291downf(unknown)

<400>11

aagtaaaaggagaggctatggcattagatggggattaagatc42

<210>12

<211>21

<212>dna

<213>smu1289-1290upf(unknown)

<400>12

gtgtaaacttccacgagattc21

<210>13

<211>42

<212>dna

<213>smu1289-1290upr(unknown)

<400>13

gctatgagtgttattgttgctccatagcctctccttttactt42

<210>14

<211>44

<212>dna

<213>smu1289-1290downf(unknown)

<400>14

attataaggagatgttctcgaggcattagatggggattaagatc44

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>smu1289-1290downr(unknown)

<400>15

gtaaccaaatcagtactcagc21

<210>16

<211>22

<212>dna

<213>ldhf(unknown)

<400>16

gagcaacaataacactcatagc22

<210>17

<211>22

<212>dna

<213>ldhr(unknown)

<400>17

ctcgagaacatctccttataat22

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>smu1289upf(unknown)

<400>18

gtatcaaaggaatgagtttg20

<210>19

<211>43

<212>dna

<213>smu1289upr-ifdc2(unknown)

<400>19

gctatgagtgttattgttgctcttcaatcataatgctttcttt43

<210>20

<211>44

<212>dna

<213>smu1289downf-ifdc2(unknown)

<400>20

aggtatactactgacagcttcgattagagaaaagtagcttactc44

<210>21

<211>19

<212>dna

<213>smu1289downr(unknown)

<400>21

gaaacgaagattattcggc19

<210>22

<211>44

<212>dna

<213>smu1289upr(unknown)

<400>22

gagtaagctacttttctctaatcttcaatcataatgctttcttt44

<210>23

<211>44

<212>dna

<213>smu1289downf(unknown)

<400>23

aaagaaagcattatgattgaagattagagaaaagtagcttactc44

<210>24

<211>21

<212>dna

<213>ldhp::smu1289upf(unknown)

<400>24

gtgtaaacttccacgagattc21

<210>25

<211>46

<212>dna

<213>ldhp::smu1289upr(unknown)

<400>25

aatcaggtgatattaagcagtaacgatcttaatccccatctaatgc46

<210>26

<211>46

<212>dna

<213>ldhp::smu1289downf(unknown)

<400>26

gcattagatggggattaagatcgttactgcttaatatcacctgatt46

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>ldhp::smu1289downr(unknown)

<400>27

gaaggtattagttgcactgc20

<210>28

<211>30

<212>dna

<213>ldhp::smu1289f(unknown)

<400>28

cggaattcgagcaacaataacactcatagc30

<210>29

<211>33

<212>dna

<213>ldhp::smu1289r(unknown)

<400>29

cgggatccgagtaagctacttttctctaatctc33