编码鸡血藤无色花青素还原酶的基因及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，涉及鸡血藤活性成分儿茶素生物合成途径中的关键酶及其编码基因，更具体地说，本发明涉及编码鸡血藤无色花青素还原酶的基因及其应用。

背景技术：

鸡血藤来源于豆科(leguminosae)植物密花豆(spatholobussuberectusdunn)的干燥藤茎，为常用中药，味苦、甘，性温，归肝、肾经。具有补血活血，调经止痛，舒筋活络的功效。用于治疗月经不调，痛经，经闭，风湿痹痛，麻木瘫痪，血虚萎黄等病症，广泛用于妇科、风湿痹痛等中成药中。研究结果表明，鸡血藤主要活性成分为黄酮类化合物，其中含量较高的黄酮类成分儿茶素起主要作用具有促进造血等功能。

儿茶素合成途径中，无色花青素还原酶(leucoanthocyanidinreductase,lar)催化无色花青素转变为儿茶素。

然而，目前尚未对鸡血藤lar基因进行克隆，也未发现其作为提高植物儿茶素中含量的应用。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的另一个目的是通过基因克隆，获得鸡血藤无色花青素还原酶(简称sslar)基因的gdna序列、cdna序列及氨基酸序列，为后续利用生物技术手段提高鸡血藤有效部位儿茶素的含量提供重要基础。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供编码鸡血藤无色花青素还原酶的gdna，其中，为下列核苷酸序列之一：

1)具有seqidno.1所示的序列；

2)能编码seqidno.1经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有鸡血藤无色花青素还原酶活性蛋白质的核苷酸序列。

编码鸡血藤无色花青素还原酶的cdna，其中，为下列核苷酸序列之一：

1)具有seqidno.2所示的序列；

2)在严格条件下与seqidno.2的cdna序列杂交且编码具有鸡血藤无色花青素还原酶活性蛋白质的dna分子；

3)编码seqidno.3所示氨基酸序列的核苷酸序列；

4)编码seqidno.3经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有鸡血藤无色花青素还原酶活性蛋白质的核苷酸序列。

具有鸡血藤无色花青素还原酶活性的蛋白质，其中，为下列氨基酸序列之一：

1)具有seqidno.3所示的氨基酸序列；

2)seqidno.3经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有鸡血藤无色花青素还原酶活性的氨基酸序列。

一种用于扩增gdna的引物，其中，所述引物的序列如seqidno.4和seqidno.5所示。

一种用于扩增cdna的引物，其中，所述引物的序列如seqidno.6和seqidno.7所示。

一种gdna或cdna或蛋白质或引物作为提高植物儿茶素含量的应用。

具体说，能够极大程度提高植物的叶和花部位中儿茶素含量的应用。

含有本发明的sslar基因全序列或部分序列的重组载体，如原核类载体、真核类载体及rnai载体均属于本发明的保护范围。

含有本发明的sslar基因全序列或部分序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明针对鸡血藤儿茶素生物合成研究方面的空白，提供了鸡血藤无色花青素还原酶(sslar)蛋白质及其编码基因的gdna序列、cdna序列及氨基酸序列，将上述gdna序列、cdna序列及氨基酸序列通过植物表达载体转化到植物中时，能够有效提高所得转基因植物中儿茶素的含量，同时对不同组织部分的基因表达分析，为今后利用生物技术手段提高鸡血藤有效部位儿茶素含量提供重要理论依据，具有较高的应用价值。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的sslar与大豆、木豆、百脉根、野生大豆、大蛇麻三叶草、狭叶羽扇豆、花生的lar基因构建的系统进化树(nj法)；

图2为本发明所述的sslar在不同组织器官中的表达水平图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

sslar基因克隆

(1)rna和dna的提取：采用trizol试剂(invitrogen，美国)从鸡血藤新鲜幼叶中提取总rna，并用rnasefreednase(promega，美国)进行预处理消除基因组dna污染。用1.5％琼脂糖凝胶分析rna完整性，用分光光度法测定rna的纯度和浓度。

采用植物dna试剂盒(tiangen)从鸡血藤新鲜幼叶中提取总dna。

基因克隆：根据鸡血藤基因组中的lar序列设计引物，以dna为模板，用primer5.0软件设计基因特异性引物：

f1:cccgtccctcatacctactcgc(seqidno：4)

r1:aagacattctcctgcaacac(seqidno：5)

通过pcr扩增，获得长度为2025bp的gdna序列，如seqidno：1。

实施例2

sslar基因克隆

将实施例1将提取的rna进行逆转录(amvfirststrandcdnasynthesiskit：roche，瑞士)，以第一链cdna为模板，利用引物：

f1:atggtgaccgtggaggaaatccg(seqidno：6)

r1:ccttggacctcttcctcacc(seqidno：7)

通过pcr扩增，获得长度为1063bp的cdna序列seqidno：2。

实施例3

根据实施例2的cdna序列翻译后获得编码具鸡血藤无色花青素还原酶(sslar)的氨基酸序列seqidno：3。

实施例4

sslar基因的生物信息学分析

将sslar的开放阅读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列在ncbi上进行同源性检索，发现该基因与其它物种有较高的同源性，其中与木豆(cajanuscajan)的lar基因同源性最高(如图1所示)。

实施例5

sslar基因在不同组织中的表达差异情况

(1)材料准备：采集新鲜鸡血藤的根、茎、叶、花、果实，将样品用自封袋包好，液氮速冻后，于-80℃超低温冰箱中储存。

(2)采用trizol试剂(invitrogen，美国)从鸡血藤的根、茎、叶、花和果实中提取总rna，并用rnasefreednase(promega，美国)进行预处理消除基因组dna污染。用1.5％琼脂糖凝胶分析rna完整性，分光光度法测定rna含量。

(3)cdna制备：采用amv第一链cdna合成试剂盒(roche，瑞士)合成cdna。。

(4)引物设计：选择18s为内源参考基因，利用primer5.0软件设计用于qrt-pcr的特异性引物：

lar-f：accgaagtcaaagatcacgc(seqidno：8)

lar-r：tcctcgacctggtccagaat(seqidno：9)

18s-f：cgttcccgccaatatctcac(seqidno：10)

18s-r：tgttcaataccagccgcacc(seqidno：11)。

(5)qrt-pcr：根据sybrgreenfastqpcrmastermix(bbi，加拿大)的说明在steponereal-timepcr系统(abi，美国)中进行聚合酶链式反应，用熔解曲线法分析目标基因的特异性扩增。

(6)采用2^-δδct法计算sslar基因在不同组织中的表达量。结果显示sslar基因在根、茎、叶、花、果实中均有表达，其中在叶中表达量最高，果实中表达量最低(如图2所示)。

实施例6

sslar基因功能研究和应用

(1)植物表达载体的构建

以鸡血藤cdna为模板，利用引物seqidno：6和seqidno：7进行pcr扩增，用bg1ii和bsteii在37℃下酶切扩增产物2h，利用回收试剂盒(takara公司，中国)纯化酶切产物。

同时利用bg1ii和bsteii在37℃酶切pcambia1301载体2h，利用回收试剂盒(takara公司，中国)纯化酶切产物。

将回收的两个片段混合，在dna连接酶的作用下，于16℃反应12h，连接产物转化dh5α感受态，挑取阳性单克隆在lb培养基中培养，37℃下振荡培养8h，取1μl菌液进行pcr鉴定，将含有两个片段的菌株进行扩繁，提取质粒得到构建的植物表达载体，命名为131-35s-yfp。

(2)转化至本氏烟草

将本氏烟草叶片切割为约1×1cm的小块，将叶块正面向下放置在ms预培养基上，预培养2d后放入含有表达载体的农杆菌悬浮液中浸泡5～10min，无菌纸吸干多余菌液，叶块正面朝下接种到ms固体培养基，暗培养2d。

将共培养后的烟草叶块移至ms筛选培养基，每隔15d更换一次培养基，至有绿色芽生成。待芽长至2cm左右时转移至ms生根培养基上进行生根诱导。幼苗长至5～7cm时炼苗出土，提取叶片dna进行pcr鉴定，筛选阳性植株即为转基因烟草。

(3)转基因烟草代谢产物分析

采用uplc-esi-ms/ms法，测定转基因烟草叶片中儿茶素的含量。结果表明，转基因烟草中的儿茶素含量为非转基因烟草的2.3倍，可见本发明的基因用于提高植物中儿茶素含量能够取得显著的效果。

无色花青素还原酶作为催化无色花青素转变为儿茶素的最后一个限速酶。其表达活性直接影响儿茶素的合成。本发明通过基因克隆，获得sslar基因的gdna序列、cdna序列及氨基酸序列，为后续利用生物技术手段提高鸡血藤有效部位儿茶素的含量提供重要基础。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。

<110>广西壮族自治区药用植物园

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