相关申请的交叉引用本申请要求于2018年1月31日提交的美国临时申请序列号62/624,748的优先权，其出于所有目的通过引用整体并入本文。联邦资助支持条款本发明是在由国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth，nih)授予的基金号hl-130253、hl-077439、dk-099653和ar-067294的政府支持下完成的。政府对本发明具有某些权利。序列表本申请包含已经以ascii格式电子提交且在此通过引用整体并入的序列表。2019年1月31日创建的所述ascii拷贝名称为utfdp0002wo.txt且大小为1,722,119字节。本公开内容涉及分子生物学、医学和遗传学领域。更具体地，本公开内容涉及用于基因组编辑的组合物及其在使用外显子跳读(exon-skipping)方法校正体内突变中的用途。
背景技术：
：：肌营养不良(musculardystrophy，md)是超过30种遗传性疾病的组，其特征在于控制运动的骨骼肌的进行性无力和退行。迪谢内肌营养不良(duchennemusculardystrohpy，dmd)是最严重的md形式之一，其影响约五千分之一的男孩，并且特征在于进行性肌无力和早夭。心肌病和心力衰竭是dmd的常见、无法治愈和致死的特征。该疾病是由编码肌养蛋白(dystrophin)(dmd)的基因中的突变引起的，肌养蛋白是一种大的细胞内蛋白，其将细胞表面的肌养蛋白聚糖(dystroglycan)复合体与下面的细胞骨架连接起来，从而在收缩期间保持肌细胞膜的完整性。肌养蛋白基因的突变导致肌养蛋白的表达丧失，导致肌膜脆性和进行性肌肉萎缩。发明概述用crispr/cas9进行基因组编辑是用于校正或减轻致病突变的有前景的新方法。迪谢内肌营养不良(dmd)与由x连锁肌养蛋白基因(dmd)的超过3000种不同突变引起的心肌和骨骼肌的致死性变性有关。这些突变中的大多数簇集在“热点”中。如本文中实施例中所述，对能够通过非同源末端连接引入插入/缺失(插失，indel)突变的最佳指导rna进行筛选，所述插失突变破坏了12个外显子中保守的rna剪接位点，从而可允许跳读突变热点内或附近的最常见突变体或框外(out-of-frame)dmd外显子。通过外显子跳读对dmd突变的校正在本文中被称为“肌编辑(myoediting)”。在概念验证研究中，肌编辑在来自多个患者的具有dmd基因内的大缺失、点突变或重复的代表性诱导多能干细胞中进行，并且有效地恢复了来源的心肌细胞中的肌养蛋白蛋白质表达。在三维工程化心肌(engineeredheartmuscle，ehm)中，dmd突变的肌编辑恢复了肌养蛋白表达和相应的收缩机械力。仅校正心肌细胞部分(30％至50％)就足以将突变体ehm表型挽救至接近正常的对照水平。因此，示出了消除保守rna剪接接纳体/供体位点并指导剪接机制以通过肌编辑来跳读突变体或框外外显子允许通过消除疾病的潜在遗传基础来校正与dmd相关的心脏异常。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在心肌细胞中编辑突变体肌养蛋白基因的方法，所述方法包括使心肌细胞与cas9核酸酶或编码cas9核酸酶的序列以及grna或编码grna的序列接触，其中grna靶向肌养蛋白基因的剪接供体或剪接接纳体位点。本公开内容还提供了用于在有此需要的对象中治疗或预防迪谢内肌营养不良(dmd)的方法，所述方法包括向所述对象施用cas9核酸酶或编码cas9核酸酶的序列以及grna或编码grna的序列，其中grna靶向肌养蛋白基因的剪接供体或剪接接纳体位点；其中所述施用恢复了所述对象至少10％的心肌细胞中的肌养蛋白表达。本公开内容还提供了用于在有此需要的对象中治疗或预防迪谢内肌营养不良(dmd)的方法，所述方法包括：使诱导多能干细胞(ipsc)与cas9核酸酶或编码cas9核酸酶的序列以及grna或编码grna的序列接触，其中grna靶向肌养蛋白基因的剪接供体或剪接接纳体位点；使ipsc分化成心肌细胞；以及将所述心肌细胞施用于所述对象。还提供了根据本公开内容的方法产生的细胞(例如诱导多能干细胞(ipsc)或心肌细胞)及其组合物。在一些实施方案中，细胞表达肌养蛋白蛋白质。还提供了诱导多能干细胞(ipsc)，其包含cas9核酸酶或编码cas9核酸酶的序列以及grna或编码grna的序列，其中grna靶向肌养蛋白基因的剪接供体或剪接接纳体位点。如在说明书中所使用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如在权利要求书中所使用的，当与词语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，除非明确地指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的限定。如本文中使用的“另一/另一些”可意指至少第二或更多个/种。在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括装置的误差、用于确定该值的方法的固有变化，或者存在于研究对象之间的固有变化。这样的固有变异可以是标注值的±10％的变异。在整个申请中，除非另有说明，否则核苷酸序列以5’至3’方向列出，并且氨基酸序列以n端至c端方向列出。通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，尽管表明了本发明的一些优选实施方案，但是详细描述和具体实施例仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。附图简述以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步示出本公开内容的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并与本文中所示具体实施方案的详细描述相结合，本公开内容可被更好地理解。图1a至1c。靶向dmd前12个外显子的最佳指导rna的肌编辑策略和鉴定。(图1a)保守的剪接位点包含多个nag和ngg序列，其使得能够被spcas9切割。数字指示发生频率(％)。(图1b)人dmd外显子结构。内含子-外显子连接的形状指示在剪接之后保持开放阅读框的互补性。红色箭头指示前12个靶向的外显子。数字指示外显子的顺序。(图1c)用表达前12个外显子的相应指导rna(grna)、spcas9和gfp的质粒转染的人293细胞中的t7e1测定。用t7内切核酸酶i(t7endonucleasei，t7e1)切割来自gfp+和gfp-细胞的pcr产物，t7内切核酸酶i对由crispr/cas9介导的基因组编辑引起的异源双链dna具有特异性。红色箭头指示t7e1的切割条带。m表示标记泳道大小。bp表示标记条带的碱基对长度。图2a至2j。通过肌编辑在具有多种突变的ipsc来源的心肌细胞中挽救肌养蛋白mrna表达。(图2a)基于dmdipsc和3d-ehm的功能性测定的肌编辑示意图。(图2b)肌编辑靶向deldmdipsc中的外显子51剪接接纳体位点。dmd患者中的缺失(外显子48至50)在外显子51中产生移码突变。红色框指示具有终止密码子的框外外显子51。dmdipsc中外显子51剪接接纳体的破坏允许从外显子47至52进行剪接，并恢复了肌养蛋白开放阅读框。(图2c)使用指导rna文库，选择了靶向外显子51的序列5’的三个指导rna(ex51-g1、ex51-g2和ex51-g3)。图2c公开了seqidno：2481。(图2d)从未经校正的dmd(del)、经校正的dmdipsc(del-cor.)和wt分化的心肌细胞的rt-pcr。外显子51的跳读允许从外显子47至52进行剪接(下方条带)，并恢复dmd开放阅读框。(图2e)用于假外显子47a(pex)的肌编辑策略。dmd外显子表示为蓝色框。具有终止密码子的假外显子47a(红色)被终止标志标记。黑色框指示肌编辑介导的插失。(图2f)pex的假外显子47a的指导rna的序列。dmd外显子表示为蓝色框，并且假外显子表示为红色框(47a)。sgrna，单指导rna。图2f按出现的顺序分别公开了seqidno2482至2484。(图2g)通过指导rnain47a-g1和in47a-g2，从wt、未经校正的dmd(pex)和经校正的dmdipsc(pex-cor.)分化的人心肌细胞的rt-pcr。假外显子47a的跳读允许从外显子47至48进行剪接(下方条带)，并恢复dmd开放阅读框。(图2h)用于外显子55至59的复制(dup)的肌编辑策略。dmd外显子表示为蓝色框。复制的外显子表示为红色框。黑色框表示肌编辑介导的插失。(图2i)dup的内含子54的指导rna(in54-g1、in54-g2和in54-g3)的序列。图2i按出现的顺序分别公开了seqidno2485至2487。(图2j)从wt、未经校正的dmd(dup)和经校正的dmdipsc(dup-cor.)分化的人心肌细胞的rt-pcr。重复的外显子55至59的跳读允许从外显子54至55进行剪接，并恢复dmd开放阅读框。用指定的引物组(f和r)(表4)进行rna的rt-pcr。图3a至3f。免疫细胞化学和western印迹分析示出通过肌编辑挽救了肌养蛋白蛋白质表达。(图3a至3c)肌养蛋白表达的免疫细胞化学(绿色)示出了缺乏肌养蛋白表达的dmdipsc心肌细胞。成功进行肌编辑之后，经校正的dmdipsc心肌细胞表达肌养蛋白。免疫荧光(红色)检测心肌标志物肌钙蛋白i。细胞核被hoechst染料标记(蓝色)。(图3d至3f)wt(100％和50％)、未经校正的(del、pex和dup)和经校正的dmd(del-cor#27、pex-cor#19和dup-cor#6)icm的western印迹分析。红色箭头(高于250kd)指示肌养蛋白的免疫反应条带。蓝色箭头(高于150kd)指示myhc加载对照的免疫反应条带。kd表示蛋白质分子量。比例尺＝100mm。图4a至4f。挽救的dmd心肌细胞来源的ehm显示foc(forceofcontraction)(收缩力)增强。(图4a)用于ehm制备、培养和收缩功能分析的实验装置。(图4b至4d)dmdehm中的收缩障碍可通过肌编辑来挽救。foc响应于提高的细胞外钙浓度相对于每个单独ehm的肌含量而归一化；n＝8/8/6/4/6/6/4/4；通过双向方差分析(anova)和tukey多重比较检验的*p＜0.05。wtehm数据是从具有指定dmd线的并行实验中收集的，并应用于图4(b至d)。(图4e)相对于wt归一化的最大心肌细胞foc。n＝8/8/6/4/6/6/4/4；通过单向anova和tukey多重比较检验的*p＜0.05。(图4f)经校正的心肌细胞的滴定表明，在ehm中需要修复30％的心肌细胞以部分挽救表型，并且需要修复50％的心肌细胞以完全挽救表型(100％del-cor.)。wt、del和100％del-cor.是合并的数据，如图4中所示。图5a至5b。通过crispr/cas9的对dmd前12个外显子进行的基因组编辑。(图5a)通过spcas9使用相应的指导rna(表5)编辑的来自gpf+人293细胞的dmd前12个外显子(51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8和55)的dna序列。将来自每个样品的基因组dna的pcr产物亚克隆到pcrii-topo载体中，并对独立的克隆进行挑选和测序。未编辑的野生型(wt)序列在顶部，并且代表性的已编辑序列在底部。缺失的序列被黑色虚线替代。红色小写字母(ag)表示剪接接纳体位点(sa，内含子的3’端)。蓝色小写字母(gt)表示剪接供体位点(sd，内含子的5’端)。图5a按出现的顺序分别在左栏中公开了seqidno2488至2526并且在右栏中公开了seqidno2427至2546。(图5b)来自编辑的293细胞的rna的rt-pcr指示靶向的dmddp140同种型外显子(51、53、46、52、50和55)的缺失。黑色箭头表示具有外显子缺失的rt-pcr产物。m表示标记泳道大小。bp表示标记条带的长度。外显子缺失条带的rt-pcr产物的序列包含两个侧翼外显子，但是跳读了靶向的外显子。例如，δex51条带的rt-pcr产物的序列证实了外显子50直接剪接至外显子52，排除了外显子51。图5b公开了seqidno：2547的“gagcctgcaaca”、seqidno：2548的“atcgaacagttg”、seqidno：2549的“aaagagttactg”、seqidno：2550的“cagaagttgaaa”、seqidno：2551的“gtgaagctccta”和seqidno：2552的“taaaaggacctc”。图6a至6d。dmdipsc和ipsc来源的心肌细胞中的大缺失突变(del.ex47-50)的校正。(图6a)使用用表达spcas9、grna(ex51-g1、g2和g3)和gfp的质粒转染的人293细胞进行的t7e1测定示出了在dmd外显子51处的基因组切割。红色箭头指向切割产物。m，标记；bp，碱基对。(图6b)来自由spcas9和指导rnaex51g3编辑的gpf+dmddelipsc的dmd外显子51的dna序列。如上所述，将来自肌编辑的dmdipsc混合物基因组dna的pcr产物亚克隆到pcrii-topo载体中，并进行测序。未经校正的外显子51序列在顶部，并且代表性的编辑的序列在底部。缺失的序列被黑色虚线替代。红色小写字母(ag)表示剪接接纳体位点。缺失的核苷酸数目由(-)表示。图6b按出现的顺序分别公开了seqidno2553至2561。(图6c)来自图2d的下方rt-pcr条带(del-cor.泳道)的序列证实了外显子51的跳读，其重构了dmdorf(从外显子47至52的肌养蛋白转录物)。图6c公开了seqidno：2562。(图6d)免疫细胞化学示出了在用指导rnaex51-g3进行的spcas9介导的外显子跳读之后，与wt和未经校正的心肌细胞(del)相比，在ipsc来源的心肌细胞混合物(del-cor.)和单一集落(del-cor-sc)中的肌养蛋白表达。绿色，肌养蛋白染色；红色，肌钙蛋白i染色；蓝色，细胞核染色。比例尺＝100μm。图7a至7d。dmdipsc和ipsc来源的心肌细胞中的假外显子突变(pex47a)的校正。(图7a)使用用表达spcas9、grna(pex47a-g1和g2)和gfp的载体进行核转染的dmdpex47aipsc进行的t7e1测定示出了在dmd假外显子47a处的基因组切割。红色箭头指向切割产物。m，标记；bp，碱基对。(图7b)来自由spcas9和指导rnapex47a-g1和g2编辑的gpf+dmddelipsc的dmd假外显子47a的dna序列。如上所述，对来自肌编辑的dmdipsc混合物的基因组dna的pcr产物进行亚克隆并测序。未经校正的假外显子47a序列在顶部，并且代表性的编辑的序列在底部。缺失的序列将被黑色虚线替代。红色小写字母(g)表示隐蔽的剪接接纳体位点的点突变。缺失的核苷酸数目由(-)表示。图7b按出现的顺序分别公开了seqidno2563至2567。(图7c)来自图2g的下方rt-pcr条带(pex和pex-cor.泳道)的序列证实了假外显子47a的跳读，其重构了dmdorf(从外显子47至48的肌养蛋白转录物)。图7c按出现的顺序分别公开了seqidno2568至2569。(图7d)免疫细胞化学示出了在用指导rnapex47a-g2进行的spcas9介导的外显子跳读之后，与wt和未经校正的心肌细胞(pex)相比，在ipsc来源的心肌细胞混合物(pex-cor.)和单一集落(pex-cor-sc)中的肌养蛋白表达。绿色，肌养蛋白染色；红色，肌钙蛋白i染色；蓝色，细胞核染色。比例尺＝100μm。图8a至8e。dmdipsc和ipsc来源的心肌细胞中的大复制突变(dup.ex55-59)的校正。(图8a)通过pcr使用靶向内含子59的正向引物(f2)和靶向内含子54的反向引物(f1)确认了该插入位点(in59-in54连接)(图2h和表4)。重复特异性pcr条带在wt细胞中不存在，而在dup细胞中存在。(图8b)使用具有表达spcas9、grna(in54-g1、g2和g3)和gfp的载体的293细胞进行的t7e1测定示出了在dmd内含子54处的基因组切割。红色箭头指向切割产物。m，标记；bp，碱基对。(图8c)通过rt-pcr使用重复边界外显子53和外显子55的侧翼的引物(ex53f，外显子53中的正向引物，和ex59r，外显子59中的反向引物)对具有重复的外显子的mrna进行半定量。类似地，通过rt-pcr使用重复边界外显子59和外显子60侧翼的引物(ex59f，外显子59中的正向引物，和ex60r，外显子60中的反向引物)对重复的外显子进行半定量。重复特异性rt-pcr上方条带(红色箭头)在wt细胞中不存在，而在dup-cor.细胞中显著降低。(图8d)三个代表性的经校正的单一集落(dup-cor-sc#4、6和26)和未经校正的对照(dup)的pcr结果。在集落4、6和26中不存在重复特异性pcr条带(f2-r1)证实了重复dna区域的缺失。m表示标记泳道大小。bp表示标记条带的长度。(图8e)免疫细胞化学示出了在用指导rnain54-g1进行的spcas9介导的外显子跳读之后，与wt和未经校正的心肌细胞(dup)相比，ipsc来源的心肌细胞混合物(dup-cor.)和单一集落(dup-cor-sc#6)中的肌养蛋白表达。绿色，肌养蛋白染色；红色，肌钙蛋白i染色；蓝色，细胞核染色。比例尺＝100μm。发明详述dmd是一种新的突变综合征，已经在人中发现了超过4,000种独立突变(万维网dmd.nl)。大多数患者突变包括簇集在热点中的缺失，因此跳读某些外显子的治疗方法适用于大量患者。外显子跳读方法的基本原理是基于dmd和贝克肌营养不良(beckermusculardystrophy，bmd)患者之间的遗传差异。在dmd患者中，肌养蛋白mrna的阅读框被破坏，导致过早截短的无功能的肌养蛋白蛋白质。bmd患者在dmd基因中具有突变，其维持阅读框以允许产生内部缺失但具有部分功能的肌养蛋白，导致比dmd患者轻得多的疾病症状。迪谢内肌营养不良(dmd)折磨约五千分之一的男性，并且是由x连锁的肌养蛋白基因(dmd)中的突变引起。这些突变包括大缺失、大重复、点突变和其他小突变。杆状肌养蛋白蛋白质连接肌细胞的细胞骨架和细胞外基质，并维持质膜的完整性。在缺少肌养蛋白的情况下，肌细胞退化。尽管dmd引起许多严重的症状，但扩张型心肌病是dmd患者死亡的主要原因。crispr(成簇规律间隔短回文重复序列)/cas9(crispr相关蛋白9)介导的基因组编辑正在成为用于校正遗传病症的有前景的工具。简而言之，工程化的rna指导的核酸酶(例如cas9或cpf1)在与短的前间区序列邻近基序(protospaceradjacentmotif，pam)序列相邻的靶向的基因组基因座处产生双链断裂(double-strandbreak，dsb)。修复dsb有三种主要途径：(i)非同源末端连接(nonhomologousendjoining，nhej)直接连接两个dna末端，并导致不精确的插入/缺失(插失)突变。(ii)同源指导修复(homology-directedrepair，hdr)使用姐妹染色单体或外源dna作为修复模板，并在靶标位点处产生精确的修饰。(iii)微同源性介导的末端连接(microhomology-mediatedendjoining，mmej)使用原始dsb侧翼的核苷酸同源性短序列(5至25个碱基对)来连接断裂的末端并缺失微同源性之间的区域。尽管nhej可在大多数细胞类型中有效产生插失突变，但通常认为hdr或mmej介导的编辑仅限于增殖细胞。肌养蛋白的内部框内缺失与贝克肌营养不良(bmd)有关，贝克肌营养不良(bmd)是一种相对轻微的肌营养不良形式。受bmd与dmd的降低的临床严重程度的启发，外显子跳读已成为一种治疗策略，其通过调节dmd基因的剪接模式来绕过破坏肌养蛋白开放阅读框的突变。数项最近的研究使用crispr/cas9介导的基因组编辑来校正人细胞和小鼠中多种类型的dmd突变。一些已经部署了指导rna对来校正突变，这需要同时切割dna和切除大的中间基因组序列(23至725kb)。偶然地，酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)cas9(spcas9)的pam序列是cas9的第一也是最广泛使用的形式，它包含nag或ngg，对应于通用剪接接纳体序列(ag)和大多数供体序列(gg)。因此，原则上，将cas9引导至剪接点并通过插失消除这些共有序列可允许有效的外显子跳读。此外，破坏剪接位点的dna的仅单一切割可使得能够跳读整个外显子。考虑到在人中已经鉴定出数千个单独的dmd突变，一个明显的问题是如何通过crispr/cas9介导的基因组编辑校正这样大量的突变。人dmd突变簇集在基因的特定“热点”区域(外显子45至55和外显子2至10)，使得跳读热点内或附近的12个靶向的外显子(称为“前12个外显子”)中的1个或2个原则上可挽救大多数(约60％)dmd患者中的肌养蛋白功能。在此，crispr/cas9与单指导rna一起使用以破坏dmd突变之前的保守剪接接纳体或供体位点，或绕过突变体或框外外显子，从而允许在周围的外显子之间进行剪接以重建缺乏突变的框内肌养蛋白蛋白质。该方法首先通过筛选能够诱导dmd12个外显子的跳读的最佳指导rna进行测试，所述dmd12个外显子的跳读将潜在地允许跳读突变热点内附近最常见的突变的外显子或框外外显子。作为该方法的实例，在具有外显子缺失和假外显子点突变的诱导多能干细胞(ipsc)来源的心肌细胞中证明了肌养蛋白表达的恢复。最后，使用人ipsc来源的三维(3d)工程化心肌(ehm)来测试进行基因编辑以克服与dmd相关的心肌收缩性异常的效力。在dmdehm中观察到收缩障碍，概括了dmd患者的扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy，dcm)临床表型，并且在经校正的dmdehm中有效地恢复了收缩功能。因此，基因组编辑代表了消除遗传原因并校正与dmd相关的肌肉和心脏异常的有力手段。以下进一步详细地描述本公开内容的这些和另一些方面。crispr系统crispr(成簇规律间隔短回文重复序列)是包含碱基序列的短重复的dna基因座。每个重复之后是来自先前暴露于病毒的“间隔区dna”的短区段。在约40％的测序的真细菌基因组和90％的测序的古细菌中发现crispr。crispr通常与编码与crispr相关的蛋白质的cas基因相关。crispr/cas系统是原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件(例如质粒和噬菌体)的抗性并提供获得性免疫的形式。crispr间隔区识别并沉默真核生物体中的这些外源遗传元件(例如rnai)。crispr重复序列的大小为24至48个碱基对。它们通常显示一些二重对称，这意味着形成二级结构例如发夹，但不是真正的回文结构。重复序列被相似长度的间隔区分开。一些crispr间隔区序列与来自质粒和噬菌体的序列准确地匹配，尽管一些间隔区与原核生物的基因组匹配(自靶向间隔区)。响应于噬菌体感染，可迅速添加新的间隔区。指导rna(grna)。作为rna指导的蛋白，cas9需要短rna以指导dna靶标的识别。虽然cas9优先地探询含有pam序列ngg的dna序列，但其可在没有前间区序列靶标的情况下在此结合。然而，cas9-grna复合体需要与grna紧密匹配以产生双链断裂。细菌中的crispr序列在多个rna中表达，并随后被加工以产生rna的指导链。因为真核系统缺乏处理crisprrna所需的一些蛋白质，所以创建合成构建体grna以将用于cas9靶向的rna的必需片段结合到用rna聚合酶iii型启动子u6表达的单个rna中。合成的grna的最小长度稍微超过100bp，并且包含靶向就在pam序列ngg之前的20个前间区序列核苷酸的部分；grna不包含pam序列。在一些实施方案中，grna靶向野生型肌养蛋白基因内的位点。示例性的野生型肌养蛋白基因包括位于人x染色体上的人序列(参见genbank登录号nc_000023.11)，其编码蛋白质肌养蛋白(genbank登录号aaa53189；seqidno：5)，其序列复制如下：在一些实施方案中，grna靶向突变体肌养蛋白基因内的位点。在一些实施方案中，grna靶向肌养蛋白内含子。在一些实施方案中，grna靶向肌养蛋白外显子。在一些实施方案中，grna靶向肌养蛋白外显子中的位点，该外显子以表1中所示的一种或更多种肌养蛋白同种型表达并存在。在一些实施方案中，grna靶向肌养蛋白剪接位点。在一些实施方案中，grna靶向肌养蛋白基因上的剪接供体位点。在一些实施方案中，grna靶向肌养蛋白基因上的剪接接纳体位点。表1：肌养蛋白同种型在一些实施方案中，指导rna靶向突变体dmd外显子。在一些实施方案中，突变体外显子是外显子23或51。在一些实施方案中，指导rna靶向肌养蛋白基因的外显子1、23、41、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55中的至少一个。在一些实施方案中，指导rna靶向肌养蛋白基因的内含子44、45、50、51、52、53、54或55中的至少一个。在一些优选的实施方案中，指导rna被设计成诱导外显子51或外显子23的跳读。在一些实施方案中，grna靶向外显子51或外显子23的剪接接纳体位点。用于本文中公开的多种组合物和方法的合适的grna和基因组靶序列作为seqidno：60至705、712至862和947至2377提供。在一些实施方案中，grna或grna靶位点具有表5至19中所示的grna或grna靶位点的任一个的序列。在一些实施方案中，本公开内容的grna包含与编码序列或对应于dmd基因的非编码序列内的靶序列互补的序列，并因此与靶序列杂交。在一些实施方案中，cpf1的grna包含单个crrna，其包含直接重复支架序列，然后是24个核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，crrna的“指导”序列包含与靶序列互补的grna序列。在一些实施方案中，本公开内容的crrna包含与靶序列不互补的grna序列。本公开内容的“支架”序列将grna与cpf1多肽连接。本公开内容的“支架”序列不等同于grna-cas9构建体的tracrrna序列。在一些实施方案中，核酸可包含一个或更多个编码grna的序列。在一些实施方案中，核酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个编码grna的序列。在一些实施方案中，所有序列编码相同的grna。在一些实施方案中，所有序列编码不同的grna。在一些实施方案中，至少2个序列编码相同的grna，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个序列编码相同的grna。核酸酶cas核酸酶。crispr相关(cas)基因通常与crispr重复-间隔区阵列相关。截至2013年，已描述了超过四十个不同的cas蛋白家族。在这些蛋白家族之中，cas1看来在不同的crispr/cas系统中是普遍存在的。cas基因和重复序列结构的特定组合已用于限定8种crispr亚型(ecoli、ypest、nmeni、dvulg、tneap、hmari、apem和mtube)，其中一些与编码重复序列相关神秘蛋白(repeat-associatedmysteriousprotein，ramp)的另外的基因模块相关。在单个基因组中可存在多于一种crispr亚型。crispr/cas亚型的散发性分布(sporadicdistribution)表明该系统在微生物进化期间经历水平基因转移。外源dna明显地由cas基因编码的蛋白质加工成小元件(长度为约30个碱基对)，然后以某种方式将其插入到靠近前导序列的crispr基因座中。来自crispr基因座的rna是组成型表达的，并且被cas蛋白加工成由具有侧翼重复序列的单独外源来源序列元件构成的小rna。rna指导其他cas蛋白在rna或dna水平上沉默外源遗传元件。证据表明crispr亚型之间的功能多样性。cse(cas亚型ecoli)蛋白(在大肠杆菌(e.coli)中称为casa-e)形成功能性复合体cascade，其将crisprrna转录物加工成保留cascade的间隔区-重复序列单元。在另一些原核生物中，cas6加工crispr转录物。有趣的是，大肠杆菌中基于crispr的噬菌体灭活需要cascade和cas3，但不需要cas1和cas2。在激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)和另一些原核生物中发现的cmr(casramp模块)蛋白与小的crisprrna形成功能性复合体，其识别和切割互补靶rna。rna指导的crispr酶被分类为v型限制酶。cas9是核酸酶(专用于切割dna的酶)，具有两个活性切割位点，双螺旋的每条链各一个。一个或这两个位点可失活，同时保留cas9定位其靶dna的能力。jineketal.(2012)将tracrrna与间隔区rna组合成“单指导rna”分子，其与cas9混合，可找到并切割正确的dna靶标，并且这样的合成指导rna用于基因编辑。cas9蛋白在致病菌和共生细菌中高度富集。crispr/cas介导的基因调节可有助于内源细菌基因的调节，特别是在与真核宿主的细菌相互作用期间。例如，新凶手弗朗西斯氏菌(francisellanovicida)的cas蛋白cas9使用独特的小的crispr/cas相关rna(scarna)来抑制编码细菌脂蛋白的内源性转录物，所述细菌脂蛋白对于新凶手弗朗西斯氏菌(f.novicida)抑制宿主应答和促进毒力是至关重要的。已经示出cas9mrna和sgrna共注射到种系(合子)中可用于产生具有突变的小鼠。也考虑了cas9dna序列的递送。crispr/cas系统分为三类。1类使用数种cas蛋白与crisprrna(crrna)一起构建功能性内切核酸酶。2类crispr系统使用单个cas蛋白和crrna。cpf1最近已被鉴定为含有约1,300个氨基酸蛋白质的ii类v型crispr/cas系统。还参见美国专利公开2014/0068797，其通过引用整体并入。在一些实施方案中，本公开内容的组合物包含来自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(uniprot登录号j7rua5)的cas9的小版本。cas9的小版本提供了优于野生型或全长cas9的优点。在一些实施方案中，cas9是酿脓链球菌(spcas9)。cpf1核酸酶。来自普雷沃氏菌属(prevotella)和弗朗西斯氏菌属1的成簇规律间隔短回文重复序列或crispr/cpf1是与crispr/cas9系统共享一些相似性的dna编辑技术。cpf1是ii类crispr/cas系统的rna指导的内切核酸酶。这种获得性免疫机制在普雷沃氏菌属和弗朗西斯氏菌属细菌中发现。其防止来自病毒的遗传损害。cpf1基因与crispr基因座相关，编码使用指导rna来发现和切割病毒dna的内切核酸酶。cpf1是比cas9更小且更简单的内切核酸酶，克服了一些crispr/cas9系统限制。cpf1出现在许多细菌物种中。被开发成用于基因组编辑的工具的最终cpf1内切核酸酶取自已知携带它的前16种物种之一。在一些实施方案中，cpf1是来自氨基酸球菌属(acidaminococcus)(物种bv3l6，uniprot登录号u2umq6；seqidno：870)的cpf1酶，其具有如下所示的序列：在一些实施方案中，cpf1是来自毛螺菌科(lachnospiraceae)(物种nd2006，uniprot登录号a0a182dwe3；seqidno：871)的cpf1酶，其具有如下所示的序列：在一些实施方案中，cpf1经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，cpf1经密码子优化以在人细胞或小鼠细胞中表达。cpf1基因座包含混合的α/β结构域、ruvc-i、其后是螺旋区、ruvc-ii和锌指样结构域。cpf1蛋白具有与cas9的ruvc结构域类似的ruvc样内切核酸酶结构域。此外，cpf1不具有hnh内切核酸酶结构域，并且cpf1的n端不具有cas9的α-螺旋识别叶。cpf1crispr-cas结构域结构显示cpf1在功能上是独特的，被归类为2类v型crispr系统。cpf1基因座编码cas1、cas2和cas4蛋白，其相比于ii型系统更类似于i型和iii型。数据库检索示出了许多细菌物种中cpf1家族蛋白的丰度。功能性cpf1不需要tracrrna。因此，仅需要crrna。这有利于基因组编辑，因为cpf1不仅比cas更小，而且它还具有更小的sgrna分子(大约与cas9的一半核苷酸一样多)。cpf1-crrna复合体通过鉴定前间区序列邻近基序5’-ytn-3’(其中“y”是嘧啶且“n”是任何核碱基)或5’-ttn-3’来切割靶dna或rna，与cas9靶向的富含g的pam相反。在鉴定pam之后，cpf1引入了4或5个核苷酸突出端的黏性末端样dna双链断裂。crispr/cpf1系统由cpf1酶和指导rna组成，其存在于双螺旋上的正确位点处并定位复合体以切割靶dna。crispr/cpf1系统活动具有三个阶段：适应，在适应期间cas1和cas2蛋白促进dna的小片段适应crispr阵列；crrna的形成：处理pre-cr-rna产生成熟crrna以指导cas蛋白；以及干扰，其中cpf1与crrna结合以形成二元复合体以鉴定并切割靶dna序列。cas9对比cpf1。cas9需要两个rna分子来切割dna，而cpf1需要一个。该蛋白质还在不同的地方切割dna，为研究人员在选择编辑位点时提供了更多选择。cas9在相同的位置切割dna分子中的两条链，留下“平”末端。cpf1留下比另一条更长的一条链，产生更易于使用的“黏性”末端。与cas9相比，cpf1看来更能够在切割位点插入新的序列。虽然crispr/cas9系统可高效地使基因失能，但插入基因或产生敲入是具有挑战性的。cpf1缺乏tracrrna，利用富含t的pam并通过交错的dnadsb切割dna。总之，cpf1与cas9系统之间的重要差异是cpf1识别不同的pam，实现新的靶向的可能性，产生4至5个nt长的黏性末端，而不是由cas9产生的平末端，提高遗传插入的效率和nhej或hdr期间的特异性，并远离pam、远离cas9切割位点切割靶dna，实现切割dna的新的可能性。表2：cas9与cpf1之间的差异特征cas9cpf1结构需要两个rna(或1个融合转录物(crrna+tracrrna＝grna))需要一个rna切割机制平末端切割交错末端切割切割位点识别位点的近端识别位点的远端靶位点富含g的pam富含t的pam其他核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是cas9或cpf1核酸酶。除cas9核酸酶和cpf1核酸酶之外，其他核酸酶也可用于本公开内容的组合物和方法。例如，在一些实施方案中，核酸酶是ii型、v-a型、v-b型、v-c型、v-u型、vi-b型核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是cas9、cas12a、cas12b、cas12c、tnp-b样、cas13a(c2c2)或cas13b核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是tal核酸酶、兆核酸酶或锌指核酸酶。crispr/cpf1介导的基因编辑。使用crispr/cpf1或crispr/cas9(或另一核酸酶)编辑dmd基因的第一步骤是鉴定基因组靶序列。本公开内容的grna的基因组靶标可以是任何约24个核苷酸的dna序列，前提是该序列与基因组的其余部分相比是独特的。在一些实施方案中，基因组靶序列对应于在人肌养蛋白基因的外显子51、外显子45、外显子44、外显子53、外显子46、外显子52、外显子50、外显子43、外显子6、外显子7、外显子8和/或外显子55内的序列。在一些实施方案中，基因组靶序列是人肌养蛋白基因的外显子51、外显子45、外显子44、外显子53、外显子46、外显子52、外显子50、外显子43、外显子6、外显子7、外显子8和/或外显子55的5’或3’剪接位点。在一些实施方案中，基因组靶序列对应于紧邻人肌养蛋白基因的外显子51、外显子45、外显子44、外显子53、外显子46、外显子52、外显子50、外显子43、外显子6、外显子7、外显子8和/或外显子55的上游或下游的内含子内的序列。示例性基因组靶序列可见于表2、6、8、10、12、14和19中。编辑dmd基因的下一步骤是鉴定待靶向的遗传区域内的所有前间区序列邻近基序(pam)序列。靶序列必须紧邻pam的上游。一旦确定了所有可能的pam序列和推定的靶位点，下一步骤就是选择哪个位点可能导致最高效的靶上(target-on)切割。grna靶向序列需要匹配靶序列，并且grna靶向序列必须不匹配基因组内的另外位点。在一些优选的实施方案中，grna靶向序列与靶标具有完美的同源性而在基因组的其他地方没有同源性。在一些实施方案中，给定的grna靶向序列将在整个基因组中在存在部分同源性的地方具有另外的位点。这些位点被称为“脱靶(off-target)”，并在设计grna时应予以考虑。一般来说，当在pam序列附近发生错配时，脱靶位点不会被高效地切割，因此没有同源性的grna或具有邻近pam序列的错配的那些将具有最高的特异性。除了“脱靶活性”之外，必须考虑使期望的靶序列的切割最大化的因子(“靶上活性”)。两种grna靶向序列(每种与靶dna具有100％同源性)可以不产生相等的切割效率是本领域技术人员已知的。事实上，切割效率可依赖于所选的靶序列内的具体核苷酸而提高或降低。仔细检查每个潜在的grna靶向序列的预测的靶上活性和脱靶活性是设计最佳grna所必需的。已经开发了数种grna设计操作，其能够定位潜在的pam和靶序列，并基于其的预测的靶上活性和脱靶活性对相关的grna进行排序(例如，crisprdirect，可在www.crispr.dbcls.jp获得)。下一步骤是合成并且克隆期望的grna。可以合成、退火靶向寡聚物并使用标准限制性连接克隆将其插入到包含grna支架的质粒中。然而，准确的克隆策略将取决于所选择的grna载体。cpf1的grna明显比cas9的grna更简单，并且仅由单个crrna组成，该单个crrna包含直接重复支架序列，然后是约24个核苷酸的指导序列。然后，应在一个或更多个靶细胞系中验证每种grna。例如，在将cas9或cpf1和grna递送至细胞之后，可使用pcr扩增基因组靶区域并根据本领域技术人员已知的方法进行测序。在一些实施方案中，基因编辑可在体外或离体进行。在一些实施方案中，细胞在体外或离体与cas9或cpf1和靶向肌养蛋白剪接位点的grna接触。在一些实施方案中，细胞与编码cas9或cpf1和指导rna的一种或更多种核酸接触。在一些实施方案中，使用例如脂质体转染或电穿孔将一种或更多种核酸引入细胞。基因编辑也可在合子中进行。在一些实施方案中，可用编码cas9或cpf1和靶向肌养蛋白剪接位点的grna的一种或更多种核酸注射合子。随后可将合子注射到宿主中。在一些实施方案中，在载体上提供cas9或cpf1。在一些实施方案中，载体包含来源于酿脓链球菌(s.pyogenes)的cas9(spcas9，seqidno.872)。在一些实施方案中，载体包含来源于金黄色葡萄球菌(s.aureus)的cas9(sacas9，seqidno.873)。在一些实施方案中，载体包含来源于毛螺菌科细菌的cpf1序列。参见例如uniprot登录号a0a182dwe3；seqidno.871。在一些实施方案中，载体包含来源于氨基酸球菌属细菌的cpf1序列。参见例如uniprot登录号u2umq6；seqidno.870。在一些实施方案中，cas9或cpf1序列经密码子优化以在人细胞或小鼠细胞中表达。在一些实施方案中，载体还包含编码荧光蛋白(例如gfp)的序列，其允许使用荧光激活细胞分选(fluorescenceactivatedcellsorting，facs)来分选表达cas9或cpf1的细胞。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体。在一些实施方案中，grna在载体上提供。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体。在一些实施方案中，cas9或cpf1和指导rna在相同载体上提供。在一些实施方案中，cas9或cpf1和指导rna在不同载体上提供。在一些实施方案中，细胞另外地与单链dmd寡核苷酸接触以实现同源定向修复。在一些实施方案中，小的插失恢复肌养蛋白的蛋白质阅读框(“重构”策略)。当使用重构策略时，细胞可与单种grna接触。在一些实施方案中，剪接供体位点或剪接接纳体位点被破坏，这导致外显子跳读和蛋白质阅读框的恢复(“外显子跳读”策略)。当使用外显子跳读策略时，细胞可与两种或更多种grna接触。可使用本领域技术人员已知的技术(例如t7e1测定)来评估体外或离体cas9或cpf1介导的dna切割的效率。可使用本领域技术人员已知的技术(例如rt-pcr、western印迹和免疫细胞化学)来证实dmd表达的恢复。在一些实施方案中，体外或离体基因编辑在肌细胞或卫星细胞中进行。在一些实施方案中，基因编辑在ipsc或icm细胞中进行。在一些实施方案中，ipsc细胞在基因编辑之后分化。例如，ipsc细胞可在编辑之后分化成肌细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，ipsc细胞分化成心肌细胞、骨骼肌细胞或平滑肌细胞。在一些实施方案中，ipsc细胞分化成心肌细胞。可根据本领域技术人员已知的方法诱导ipsc细胞分化。在一些实施方案中，使细胞与cas9或cpf1和grna接触恢复了肌养蛋白表达。在一些实施方案中，已经在体外或离体编辑的细胞或由其来源的细胞显示出与野生型细胞相当的肌养蛋白蛋白质水平。在一些实施方案中，编辑的细胞或由其来源的细胞以野生型肌养蛋白表达水平的50％、60％、70％、80％、90％、95％或其间的任何百分比的水平表达肌养蛋白。在一些实施方案中，已经在体外或离体编辑的细胞或由其来源的细胞具有与野生型细胞相当的线粒体数量。在一些实施方案中，编辑的细胞或由其来源的细胞具有50％、60％、70％、80％、90％、95％或其间的任何百分比的与野生型细胞一样多的线粒体。在一些实施方案中，与基线处的未编辑细胞相比，编辑的细胞或由其来源的细胞显示氧消耗速率(oxygenconsumptionrate，ocr)的提高。核酸表达载体。如上所述，在某些实施方案中，表达盒(expressioncassette)用于表达转录因子产物，以用于随后纯化和递送至细胞/对象，或直接用于基于遗传的递送方法。本文中提供了表达载体，其包含编码cas9或cpf1和至少一种靶向肌养蛋白剪接位点的dmd指导rna的一种或更多种核酸。在一些实施方案中，在相同载体上提供编码cas9或cpf1的核酸和编码至少一种指导rna的核酸。在另一些实施方案中，在分开的载体上提供编码cas9或cpf1的核酸和编码至少一种指导rna的核酸。表达需要在载体中提供适当的信号，并且包括多种来自病毒和哺乳动物来源二者的驱动目的基因在细胞中表达的调节元件(例如增强子/启动子)。还定义了设计用于优化宿主细胞中信使rna稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用多种显性药物选择标志物以建立表达产物的永久稳定细胞克隆的条件，以及将药物选择标志物的表达与多肽的表达联系起来的元件。在本申请通篇，术语“表达盒”意在包括含有编码基因产物的核酸的任何类型遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录和翻译，即，在启动子的控制下。“启动子”是指由起始基因的特异性转录所需的细胞的合成机器或引入的合成机器识别的dna序列。短语“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向中以控制rna聚合酶起始和基因的表达。“表达载体”意在包括包含在遗传构建体中的能够复制的表达盒，并因此包括一个或更多个复制起点、转录终止信号、polya区、可选择标志物和多用途克隆位点。调节元件。术语启动子在此将用于指在rna聚合酶ii的起始位点周围簇集的一组转录控制模块。关于如何组织启动子的大多数想法来自对数种病毒启动子的分析，包括hsv胸苷激酶(thymidinekinase，tk)和sv40早期转录单位的那些。通过更新的工作而加强的这些研究已经示出启动子由离散的功能性模块构成，各自由约7至20bp的dna组成，并含有转录激活蛋白或阻遏蛋白的一个或更多个识别位点。每个启动子中至少一个模块发挥定位rna合成的起始位点的作用。其最著名的实例是tata盒(tatabox)，但是在缺少tata盒的一些启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和sv40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始位置。rna聚合酶和poliii启动子。在真核生物中，rna聚合酶iii(也称为poliii)转录dna以合成核糖体5srrna、trna和其他小rna。rnapoliii转录的基因属于“管家”基因类别，其表达在所有细胞类型和大多数环境条件下都是必需的。因此，poliii转录的调节主要与细胞生长和细胞周期的调节相关，因此相比于rna聚合酶ii需要更少的调节蛋白。但是，在应激条件下，蛋白maf1抑制poliii活性。在(通过任何聚合酶)转录的过程中，存在三个主要阶段：(i)起始，需要在基因的启动子上构建rna聚合酶复合体；(ii)延长，rna转录物的合成；以及(iii)终止，rna转录的完成和rna聚合酶复合体的分解。在rnapoliii控制下的启动子包括以下的那些：核糖体5srrna、trna和少数其他小rna，例如u6剪接体rna、rnasep和rnasemrprna、7slrna(信号识别颗粒的rna组分)、vaultrna、yrna、sine(短散在重复元件)、7skrna、两个微rna、数个小核仁rna和数个调节性反义rna。另外的启动子和元件在一些实施方案中，本公开内容的cas9或cpf1构建体由肌细胞特异性启动子表达。该肌细胞特异性启动子可以是组成型活性的或者可以是诱导型启动子。另外的启动子元件调节转录起始的频率。一般来说，这些位于起始位点上游30至110bp的区域中，但是最近已经示出许多启动子在起始位点下游也包含功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，以使得当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔在活性开始下降之前可提高至相距50bp。根据启动子，看来单个元件可合作地或独立地发挥作用以激活转录。在某些实施方案中，病毒启动子例如人巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)立即早期基因启动子、sv40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(roussarcomaviruslongterminalrepeat)、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获得目的编码序列的高水平表达。还考虑使用本领域中公知的另一些病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现目的编码序列的表达，前提是表达水平对于给定目的是足够的。通过使用具有公知性质的启动子，可优化转染或转化之后目的蛋白质的表达水平和模式。此外，选择响应于特定生理信号而被调节的启动子可允许基因产物的诱导型表达。增强子是提高来自位于相同dna分子上的远端位置之启动子的转录的遗传元件。增强子的组织很像启动子。也就是说，它们由许多单个元件构成，其各自与一个或更多个转录蛋白结合。增强子与启动子之间的基本区别是可操作性。增强子区域作为整体必须能够在一定距离处刺激转录；对于启动子区或其组成元件则不需要这样。另一方面，启动子必须具有在特定位点和特定方向上指导起始rna合成的一种或更多种元件，而增强子缺乏这些特异性。启动子和增强子通常是重叠和连续的，通常看来具有非常相似的模块化组织。以下是可与表达构建体中编码目的基因的核酸组合使用的启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表。另外地，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库(eukaryoticpromoterdatabase)epdb)也可用于驱动基因的表达。如果提供合适的细菌聚合酶作为递送复合体的一部分或作为另外的遗传表达构建体，则真核细胞可支持来自某些细菌启动子的胞质转录。启动子和/或增强子可以是例如：免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、t细胞受体、hladqα和/或dqβ、β-干扰素、白介素-2、白介素-2受体、mhcii类5、mhcii类hla-dra、β-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶(musclecreatinekinase，mck)、前清蛋白(甲状腺素视黄质运载蛋白(transthyretin))、弹性蛋白酶i、金属硫蛋白(mtii)、胶原酶、白蛋白、甲胎蛋白、t-珠蛋白、β-球蛋白、c-fos、c-ha-ras、胰岛素、神经细胞黏附分子(neuralcelladhesionmolecule，ncam)、α1-胰蛋白酶(α1-antitrypain)、h2b(th2b)组蛋白、小鼠和/或i型胶原蛋白、葡萄糖调节蛋白(grp94和grp78)、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白a(serumamyloida，saa)、肌钙蛋白i(tni)、血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，pdgf)、迪谢内肌营养不良、sv40、多瘤(polyoma)、逆转录病毒、乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)和长臂猿白血病病毒(gibbonapeleukemiavirus)。在一些实施方案中，可使用诱导型元件。在一些实施方案中，诱导型元件是例如：mtii、mmtv(小鼠乳腺肿瘤病毒)、β-干扰素、腺病毒5e2、胶原酶、溶基质蛋白酶、sv40、鼠mx基因、grp78基因、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、mhci类基因h-2kb、hsp70、增殖蛋白(proliferin)、肿瘤坏死因子和/或促甲状腺激素α基因。在一些实施方案中，诱导物是佛波酯(phorbolester)(tfa)、重金属、糖皮质激素、聚(ri)x、聚(rc)、e1a、佛波酯(tpa)、干扰素、新城疫病毒(newcastlediseasevirus)、a23187、il-6、血清、干扰素、sv40大t抗原、pma和/或甲状腺激素。本文中描述的任何诱导型元件可与本文中描述的任何诱导物一起使用。特别感兴趣的是肌特异性启动子。这些包括：肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子；na+/ca2+交换体启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子和αb-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子和anf启动子。在一些实施方案中，肌特异性启动子是ck8启动子。ck8启动子具有以下序列(seqidno.874)：在一些实施方案中，肌细胞细胞特异性启动子是ck8启动子的变体，称为ck8e。ck8e启动子具有以下序列(seqidno.875)：在使用cdna插入片段的情况下，通常将期望包含多腺苷酸化信号以实现基因转录物的适当多腺苷酸化。可使用任何多腺苷酸化序列，例如人生长激素和sv40多腺苷酸化信号。还考虑作为表达盒元件的是终止子。这些元件可用于增强信息水平并使从盒到其他序列中的通读最小化。治疗性组合物aav-cas9载体在一些实施方案中，cas9可被包装到aav载体中。在一些实施方案中，aav载体是野生型aav载体。在一些实施方案中，aav载体包含一个或更多个突变。在一些实施方案中，aav载体分离自或来源于aav载体的血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav或其任意组合。示例性的aav-cas9载体包含两个itr(反向末端重复)序列，其位于包含cas9序列的中央序列区域的侧翼。在一些实施方案中，itr分离自或来源于aav载体的血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav或其任意组合。在一些实施方案中，itr包含aav血清型的全长和/或野生型序列或由其组成。在一些实施方案中，itr包含aav血清型的截短序列或由其组成。在一些实施方案中，itr包含aav血清型的延长序列或由其组成。在一些实施方案中，itr包含这样的序列或由其组成：所述序列包含与同一aav血清型的野生型序列相比的序列变异。在一些实施方案中，序列变异包括替换、缺失、插入、倒位或转位中的一种或更多种。在一些实施方案中，itr包含至少100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对或由其组成。在一些实施方案中，itr包含100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对或由其组成。在一些实施方案中，itr具有110±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有120±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有130±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有140±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有150±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有115、145或141个碱基对的长度。在一些实施方案中，aav-cas9载体可包含一个或更多个核定位信号(nuclearlocalizationsignal，nls)。在一些实施方案中，aav-cas9载体包含1、2、3、4或5个核定位信号。示例性的nls包括：c-mycnls(seqidno：884)、sv40nls(seqidno：885)、hnrnpaim9nls(seqidno：886)、核质蛋白nls(seqidno：887)、来自输入蛋白-α的imb结构域的序列rmrkfknkgkdtaelrrrrvevsvelrkakkdeqilkrrnv(seqidno：888)、肌瘤t蛋白的序列vsrkrprp(seqidno：889)和ppkkared(seqidno：890)、人p53的序列pqpkkkpl(seqidno：891)、小鼠c-abliv的序列salikkkkkmap(seqidno：892)、流感病毒ns1的序列drlrr(seqidno：893)和kqkkrk(seqidno：894)、肝炎病毒δ抗原的序列rklkkkikkl(seqidno：895)和小鼠mx1蛋白的序列rekkkflkrr(seqidno：896)。另外的可接受的核定位信号包括二分核定位序列，例如人聚(adp-核糖)聚合酶的序列krkgdevdgvdevakkkskk(seqidno：897)或类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列rkclqagmnlearktkk(seqidno：898)。在一些实施方案中，aav-cas9载体可包含另外的元件以促进载体的包装和cas9的表达。在一些实施方案中，aav-cas9载体可包含polya序列。在一些实施方案中，polya序列可以是微型polya序列。在一些实施方案中，aav-cas9载体可包含转座元件。在一些实施方案中，aav-cas9载体可包含调节子元件。在一些实施方案中，调节子元件是活化剂或阻遏物。在一些实施方案中，aav-cas9可包含一个或更多个启动子。在一些实施方案中，一个或更多个启动子驱动cas9的表达。在一些实施方案中，一个或更多个启动子是肌特异性启动子。示例性的肌特异性启动子包括：肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子、na+/ca2+交换体启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子、αb-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子、anf启动子、ck8启动子和ck8e启动子。在一些实施方案中，aav-cas9载体可被优化以在酵母菌、细菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞中生产。在一些实施方案中，aav-cas9载体可被优化以在人细胞中表达。在一些实施方案中，aav-cas9载体可被优化以在杆状病毒表达系统中表达。aav-sgrna载体在一些实施方案中，可以将编码grna的至少第一序列和编码grna的第二序列包装到aav载体中。在一些实施方案中，可以将编码grna的至少第一序列、编码grna的第二序列和编码grna的第三序列包装到aav载体中。在一些实施方案中，可以将编码grna的至少第一序列、编码grna的第二序列、编码grna的第三序列和编码grna的第四序列包装到aav载体中。在一些实施方案中，可以将编码grna的至少第一序列、编码grna的第二序列、编码grna的第三序列、编码grna的第四序列和编码grna的第五序列包装到aav载体中。在一些实施方案中，将编码grna的多个序列包装到aav载体中。例如，可以将编码grna的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个序列包装到aav载体中。在一些实施方案中，编码grna的每个序列是不同的。在一些实施方案中，编码grna的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个序列是相同的。在一些实施方案中，编码grna的所有序列都是相同的。在一些实施方案中，aav载体是野生型aav载体。在一些实施方案中，aav载体包含一个或更多个突变。在一些实施方案中，aav载体分离自或来源于aav载体的血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav或其任意组合。示例性的aav-sgrna载体包含两个itr(反向末端重复)序列，其位于包含sgrna序列的中央序列区域的侧翼。在一些实施方案中，itr分离自或来源于aav载体的血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav或其任意组合。在一些实施方案中，itr分离自或来源于aav载体的第一血清型，并且编码aav-sgrna载体的衣壳蛋白的序列分离自或来源于aav载体的第二血清型。在一些实施方案中，第一血清型和第二血清型是相同的。在一些实施方案中，第一血清型和第二血清型是不同的。在一些实施方案中，第一血清型是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav。在一些实施方案中，第二血清型是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav。在一些实施方案中，第一血清型是aav2，并且第二血清型是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav。在一些实施方案中，第一血清型是aav2，并且第二血清型是aav9。在一些实施方案中，第一itr分离自或来源于aav载体的第一血清型，第二itr分离自或来源于aav载体的第二血清型，并且编码aav-sgrna载体的衣壳蛋白的序列分离自或来源于aav载体的第三血清型。在一些实施方案中，第一血清型和第二血清型是相同的。在一些实施方案中，第一血清型和第二血清型是不同的。在一些实施方案中，第一血清型、第二血清型和第三血清型是相同的。在一些实施方案中，第一血清型、第二血清型和第三血清型是不同的。在一些实施方案中，第一血清型是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav或绵羊aav。在一些实施方案中，第二血清型是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav或绵羊aav。在一些实施方案中，第三血清型是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav或绵羊aav。在一些实施方案中，第一血清型是aav2，第二血清型是aav4，并且第三血清型是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10或aav11。在一些实施方案中，第一血清型是aav2，第二血清型是aav4，并且第三血清型是aav9。示例性的aav-sgrna载体包含两个itr(反向末端重复)序列，其位于包含sgrna序列的中央序列区域的侧翼。在一些实施方案中，itr分离自或来源于aav载体的血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav或其任意组合。在一些实施方案中，itr包含aav血清型的全长和/或野生型序列或由其组成。在一些实施方案中，itr包含aav血清型的截短序列或由其组成。在一些实施方案中，itr包含aav血清型的延长序列或由其组成。在一些实施方案中，itr包含这样的序列或由其组成：所述序列包含与同一aav血清型的野生型序列相比的序列变异。在一些实施方案中，序列变异包括替换、缺失、插入、倒位或转位中的一种或更多种。在一些实施方案中，itr包含至少100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对或由其组成。在一些实施方案中，itr包含100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个碱基对或由其组成。在一些实施方案中，itr具有110±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有120±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有130±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有140±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有150±10个碱基对的长度。在一些实施方案中，itr具有115、145或141个碱基对的长度。在一些实施方案中，aav-sgrna载体可包含另外的元件以促进载体的包装和sgrna的表达。在一些实施方案中，aav-sgrna载体可包含转座元件。在一些实施方案中，aav-sgrna载体可包含调节元件。在一些实施方案中，调节元件包含活化剂或阻遏物。在一些实施方案中，aav-sgrna序列可包含非功能性或“填充”序列。本公开内容的示例性填充序列可以与哺乳动物(包括人)的基因组序列具有某些(非零百分比)同一性或同源性。或者，本公开内容的示例性填充序列可与哺乳动物(包括人)的基因组序列没有同一性或同源性。本公开内容的示例性填充序列可包含天然存在的非编码序列或在将aav载体施用于对象之后既不转录也不翻译的序列，或由其组成。在一些实施方案中，aav-sgrna载体可被优化以在酵母菌、细菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞中生产。在一些实施方案中，aav-sgrna载体可被优化以在人细胞中表达。在一些实施方案中，aav-cas9载体可被优化以在杆状病毒表达系统中表达。在一些实施方案中，aav-sgrna载体包含至少一种启动子。在一些实施方案中，aav-sgrna载体包含至少两个启动子。在一些实施方案中，aav-sgrna载体包含至少三个启动子。在一些实施方案中，aav-sgrna载体包含至少四个启动子。在一些实施方案中，aav-sgrna载体包含至少五个启动子。示例性的启动子包括，例如：免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、t细胞受体、hladqα和/或dqβ、β-干扰素、白介素-2、白介素-2受体、mhcii类5、mhcii类hla-dra、β-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶(mck)、前清蛋白(甲状腺素视黄质运载蛋白)、弹性蛋白酶i、金属硫蛋白(mtii)、胶原酶、白蛋白、甲胎蛋白、t-珠蛋白、β-球蛋白、c-fos、c-ha-ras、胰岛素、神经细胞黏附分子(ncam)、α1-胰蛋白酶、h2b(th2b)组蛋白、小鼠和/或i型胶原蛋白、葡萄糖调节蛋白(grp94和grp78)、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白a(saa)、肌钙蛋白i(tni)、血小板源性生长因子(pdgf)、迪谢内肌营养不良、sv40、多瘤、逆转录病毒、乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒(cmv)和长臂猿白血病病毒。另外的示例性启动子包括u6启动子、h1启动子和7sk启动子。在一些实施方案中，编码grna的序列或基因组靶序列包含选自seqidno.60至705、712至862和947至2377的序列。药物组合物和递送方法本文中还提供了包含本公开内容的一种或更多种载体和/或核酸的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。对于临床应用，药物组合物以适于预期应用的形式制备。通常来说，这需要制备基本上不含热原以及可对人或动物有害的其他杂质的组合物。使用合适的盐和缓冲液以使药物、蛋白质或递送载体稳定并允许被靶细胞摄取。本公开内容的水性组合物包含溶解或分散在可药用载体或水性介质中的有效量的药物、载体或蛋白质。短语“可药用的或药理学上可接受的”是指当向动物或人施用时不产生不利的、变应性的或其他不良反应的分子实体和组合物。本文中使用的“可药用的载体”包括用于配制药物(例如适合向人施用的药物)可接受的溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中公知的。可使用与本公开内容的活性成分不相容的任何常规介质或试剂、其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可并入到组合物中，前提是它们不使组合物的载体或细胞失活。在一些实施方案中，本公开内容的活性组合物可包括经典的药物制剂。根据本公开内容的这些组合物的施用可通过任何常见途径，只要通过该途径可到达靶组织即可，但通常包括全身施用。这包括经口、经鼻或含服(buccal)。或者，施用可通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射，或通过直接注射到肌组织中。如上所述，这样的组合物通常作为可药用组合物施用。活性化合物也可肠胃外或腹膜内施用。例如，作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在水中与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当地混合而制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制备物通常含有防腐剂以防止微生物的生长。可适于注射使用的药物形式包括例如无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。通常来说，这些制备物是无菌的和流动的，达到容易注射的程度。制备物在制造和储存条件下应当是稳定的，并且应当防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。合适的溶剂或分散介质可包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，以及植物油。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，通过在分散体的情况下维持所需的粒度并通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。微生物作用的预防可通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。可通过将适量的活性化合物以及所期望的任何其他成分(例如如上所列的)一起并入到溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常来说，通过将多种灭菌的活性成分并入到含有基础分散介质和所期望的其他成分(例如，如上面列举的)的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自其先前无菌过滤溶液的活性成分的粉末以及任何另外的所期望成分。在一些实施方案中，本公开内容的组合物被配制成中性或盐形式。可药用盐包括例如来自于无机酸(例如，盐酸或磷酸)，或来自于有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等)的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与蛋白质的游离羧基形成的盐也可来自于无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或来自于有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。在配制时，优选以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量施用溶液。制剂可易于以多种剂型例如可注射溶液、药物释放胶囊等施用。对于水溶液中的肠胃外施用，例如，溶液通常进行适当地缓冲，并且首先例如用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这样的水溶液可用于例如静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。优选地，特别是根据本公开内容，使用本领域技术人员已知的无菌水性介质。例如，单剂量可溶解在1ml的等张nacl溶液中，并且添加至1000ml的皮下输液流体(hypodermoclysisfluid)或在所推荐的输注部位注射(参见例如“remington’spharmaceuticalsciences”15thedition，pages1035-1038and1570-1580)。根据被治疗的对象的病症，剂量将必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制备物应满足fda生物制品标准办公室(fdaofficeofbiologicsstandards)要求的无菌性、热原性、整体安全性和纯度标准。在一些实施方案中，可使用过继细胞转移(adoptivecelltransfer，act)将本文中所述的cas9或cpf1和grna递送至患者。在过继细胞转移中，将一种或更多种表达构建体离体提供给源自患者(自体)或源自除患者之外的一个或更多个个体(同种异体)的细胞。随后将细胞引入或重新引入到患者中。因此，在一些实施方案中，在将细胞引入或重新引入至患者之前，将编码cas9或cpf1和靶向肌养蛋白剪接位点的指导rna的一种或更多种核酸离体提供给细胞。细胞和细胞组合物还提供了包含本公开内容的一种或更多种核酸的细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干(inducedpluripotentstem，ips)细胞。在一些实施方案中，细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，细胞(例如，心肌细胞)源自ips细胞。还提供了包含本公开内容的组合物的细胞，所述组合物包含一种或更多种载体。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干(ips)细胞。在一些实施方案中，细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，细胞(例如，心肌细胞)源自ips细胞。还提供了通过本公开内容的一种或更多种方法产生的细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干(ips)细胞。在一些实施方案中，细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，细胞(例如，心肌细胞)源自ips细胞。还提供了包含细胞的组合物，所述含有本公开内容的一种或更多种核酸。在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。治疗方法和用途本公开内容还提供了用于在细胞中编辑肌养蛋白基因，例如突变体肌养蛋白基因的方法。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干(ips)细胞。在一些实施方案中，细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，细胞(例如，心肌细胞)源自ips细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在心肌细胞中编辑突变体肌养蛋白基因的方法，所述方法包括使心肌细胞与cas9核酸酶或编码cas9核酸酶的序列以及grna或编码grna的序列接触，其中grna靶向肌养蛋白基因的剪接供体或剪接接纳体位点。突变体肌养蛋白基因可包含一种或更多种突变，例如点突变(例如，假外显子突变)、缺失和/或重复突变。缺失可以是至少20、至少50、至少100、至少500、至少1000、至少3000个核苷酸、至少5000个核苷酸或至少10,000个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，缺失包括一个或更多个外显子、一个或更多个内含子或一个外显子和一个内含子的至少一部分的缺失。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在有此需要的对象中治疗或预防迪谢内肌营养不良(dmd)的方法，所述方法包括向所述对象施用cas9核酸酶或编码cas9核酸酶的序列以及grna或编码grna的序列，其中grna靶向肌养蛋白基因的剪接供体或剪接接纳体位点，其中所述施用恢复了所述对象至少10％的心肌细胞中的肌养蛋白表达。在一些实施方案中，所述施用恢复了所述对象至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的心肌细胞中的肌养蛋白表达。平均来说人心脏具有约20至30亿个心肌细胞。因此，在一些实施方案中，所述施用恢复了至少2×108、至少3×108、至少4×108、至少5×108、至少6×108、至少7×108、至少8×108、至少9×108、至少10×108、至少11×108、至少12×108、至少13×108、至少14×108、至少15×108、至少16×108、至少17×108、至少18×108、至少19×108、至少20×108、至少21×108、至少22×108、至少23×108、至少24×108、至少25×108、至少26×108、至少27×108、至少28×108、至少29×108、至少30×108个所述对象心肌细胞中的肌养蛋白表达。在一些实施方案中，对象患有扩张型心肌病。在一些实施方案中，所述施用至少部分地挽救心肌收缩性，或完全地挽救心肌收缩性。在一些实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗或预防迪谢内肌营养不良(dmd)的方法，所述方法包括：使诱导多能干细胞(ipsc)与cas9核酸酶或编码cas9核酸酶的序列以及grna或编码grna的序列接触，其中grna靶向肌养蛋白基因的剪接供体或剪接接纳体位点；使ipsc分化成心肌细胞；以及将所述心肌细胞施用于所述对象。在一些实施方案中，向患者施用至少1×103、至少1×104、至少1×105、至少1×106、至少1×107或至少1×108个心肌细胞。grna可以靶向例如心肌细胞肌养蛋白基因的外显子51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8或55的剪接供体或剪接接纳体位点。在一些实施方案中，grna或基因组靶向序列具有seqidno.60至705、712至862、947至2377中任一项的序列。cas9核酸酶可分离自或来源于例如酿脓链球菌(spcas9)或金黄色葡萄球菌cas9(sacas9)。在一些实施方案中，使包含grna或编码grna的序列的载体与心肌细胞接触。载体可以是例如非病毒载体，例如质粒或纳米粒。在一些实施方案中，载体可以是病毒载体，例如腺相关病毒(adeno-associatedviral，aav)载体。在一些实施方案中，aav载体选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav。在一些实施方案中，使包含cas9核酸酶或编码cas9核酸酶的序列以及grna或编码grna的序列的单一载体与心肌细胞接触。在另一些实施方案中，使包含cas9核酸酶或编码cas9核酸酶的序列的第一载体和包含grna或编码grna的序列的第二载体与心肌细胞接触。第一载体和第二载体可以相同或可以不同。例如，第一载体和第二载体均可以是aav，或者第一载体可以是aav，并且第二载体可以是质粒。还提供了用于校正肌养蛋白缺陷的方法，所述方法包括在适合于指导rna、cas9蛋白或其核酸酶结构域表达的条件下使细胞与本公开内容的一种或更多种组合物接触，其中指导rna与cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合体以形成至少一种指导rna-cas9复合体，其中所述至少一种指导rna-cas9复合体破坏肌养蛋白剪接位点并诱导dmd外显子的选择性跳读和/或重构。在一些实施方案中，至少一种指导rna-cas9复合体破坏肌养蛋白剪接位点并诱导肌养蛋白阅读框的重构。在一些实施方案中，至少一种指导rna-cas9复合体破坏肌养蛋白剪接位点并产生插入，这恢复了肌养蛋白蛋白质阅读框。在一些实施方案中，插入包含单个腺苷的插入。还提供了用于诱导dmd外显子的选择性跳读和/或重构的方法，所述方法包括在适合于指导rna和cas9蛋白或其核酸酶结构域表达的条件下使细胞与本公开内容的一种或更多种组合物接触，其中指导rna和第二指导rna与cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合体以形成至少一种指导rna-cas9复合体，其中所述至少一种指导rna-cas9复合体破坏肌养蛋白剪接位点并诱导dmd外显子的选择性跳读和/或重构。还提供了用于在肌养蛋白阅读框中诱导重构事件的方法，所述方法包括在适合于指导rna和cas9蛋白或其核酸酶结构域表达的条件下使细胞与本公开内容的一种或更多种组合物接触，其中指导rna与cas9蛋白或其核酸酶结构域形成复合体以形成至少一种指导rna-cas9复合体，其中所述指导rna-cas9复合体破坏肌养蛋白剪接位点并诱导dmd外显子的选择性跳读和/或重构。在一些实施方案中，至少一种指导rna-cas9复合体破坏肌养蛋白剪接位点并诱导人dmd基因的外显子51的选择性跳读和/或重构。还提供了在有此需要的对象中治疗或预防肌营养不良的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本公开内容的一种或更多种组合物。在一些实施方案中，组合物局部施用。在一些实施方案中，组合物直接施用于肌组织。在一些实施方案中，组合物通过肌内输注或注射施用。在一些实施方案中，肌组织包括胫骨前肌组织(tibialisanteriortissue)、四头肌组织(quadriceptissue)、比目鱼肌组织(soleustissue)、膈肌组织(diaphagmtissue)或心脏组织。在一些实施方案中，组合物通过心内注射施用。在一些实施方案中，组合物全身施用。在一些实施方案中，组合物通过静脉内输注或注射施用。在一些实施方案中，在施用组合物之后，对象表现出正常肌养蛋白阳性肌纤维和含有集中核(centralizednuclei)的嵌合(mosaic)肌养蛋白阳性肌纤维或其组合。在一些实施方案中，在施用组合物之后，当与在施用组合物之前正常肌养蛋白阳性肌纤维的不存在或丰度水平相比，对象表现出正常肌养蛋白阳性肌纤维的出现或丰度水平提高。在一些实施方案中，在施用组合物之后，当与在施用组合物之前含有集中核的嵌合肌养蛋白阳性肌纤维的不存在或丰度水平相比，对象表现出含有集中核的嵌合肌养蛋白阳性肌纤维的出现或丰度水平提高。在一些实施方案中，在施用组合物之后，当与施用组合物之前的血清ck水平相比，对象表现出降低的血清ck水平。在一些实施方案中，在施用组合物之后，当与施用组合物之前的握力(gripstrength)相比，对象表现出改善的握力。在一些实施方案中，对象是新生儿、婴儿、儿童、年轻成人或成人。在一些实施方案中，对象患有肌营养不良。在一些实施方案中，对象是肌营养不良的遗传携带者。在一些实施方案中，对象是男性。在一些实施方案中，对象是女性。在一些实施方案中，对象表现为无症状，并且遗传学诊断(geneticdiagnosis)揭示dmd基因的一个或两个拷贝中有损害dmd基因产物的功能的突变。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的早期体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的早期体征或症状包括肌肉量(musclemass)的损失或近侧肌无力。在一些实施方案中，肌肉量的损失或近侧肌无力发生在一条或两条腿和/或骨盆中，接着是一个或更多个上身(upperbody)肌肉中。在一些实施方案中，肌营养不良的早期体征或症状还包括假性肥大、低耐力、站立困难、行走困难、攀登楼梯困难或其组合。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的进行性体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的进行性体征或症状包括肌组织萎缩(muscletissuewasting)、肌组织被脂肪代替、或肌组织被纤维化组织代替。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的晚期体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的晚期体征或症状包括骨发育异常、脊柱弯曲(curvatureofthespine)、运动丧失和瘫痪(paralysis)。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的神经学体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的神经学体征或症状包括智力受损(intellectualimpairment)和瘫痪。在一些实施方案中，组合物的施用发生在对象呈现肌营养不良的一种或更多种进行性、晚期或神经学体征或症状之前。在一些实施方案中，对象大于18岁、大于25岁或大于30岁。在一些实施方案中，对象小于18岁、小于16岁、小于12岁、小于10岁、小于5岁或小于2岁。还提供了治疗有效量的本公开内容的一种或更多种组合物用于在有此需要的对象中治疗肌营养不良的用途。递送载体存在许多可将表达载体引入到细胞中的方式。在某些实施方案中，表达构建体包含病毒或来自于病毒基因组的工程化的构建体。某些病毒通过受体介导的胞吞作用进入细胞，整合到宿主细胞基因组中并稳定且高效地表达病毒基因的能力已使其成为将外源基因转移到哺乳动物细胞中的有吸引力的候选物。这些对外来dna序列具有相对低的容纳力，并且具有受限的宿主谱。此外，它们在允许细胞中的致癌潜力和细胞病变效应引起了安全性问题。它们可仅容纳高达8kb的外来遗传物质，但可容易地被引入到多种细胞系和实验动物中。用于体内递送的一种优选方法涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意在包括含有足以(a)支持构建体包装和(b)表达其中已克隆的反义多核苷酸的腺病毒序列的那些构建体。在本发明上下文中，表达不需要合成基因产物。表达载体包括基因工程形式的腺病毒。对腺病毒(36kb的线性双链dna病毒)的遗传组织的了解允许用高至7kb的外来序列替换大片段腺病毒dna。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，原因是腺病毒dna可以以附加体方式复制而没有潜在的遗传毒性。此外，腺病毒在结构上是稳定的，并且在大量扩增之后没有检测到基因组重排。腺病毒可感染几乎所有上皮细胞，而不论其细胞周期阶段如何。迄今为止，腺病毒感染看来仅与轻度疾病(例如人的急性呼吸系统疾病)相关。腺病毒特别适合用作基因转移载体，原因是其具有中等大小的基因组、易于操作、高滴度、宽靶细胞范围和高感染性。病毒基因组的两端均含有100至200个碱基对的反向重复序列(invertedrepeat，itr)，其是病毒dna复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(e)和晚期(l)区域包含不同的转录单位，其被病毒dna复制的起始分开。e1区(e1a和e1b)编码负责调节病毒基因组和少数细胞基因的转录的蛋白质。e2区(e2a和e2b)的表达导致用于病毒dna复制的蛋白质的合成。这些蛋白质参与dna复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭。晚期基因的产物(包括大多数病毒衣壳蛋白)仅在由主要晚期启动子(majorlatepromoter，mlp)产生的单一初级转录物的显著加工之后表达。在感染的晚期期间mlp(位于16.8m.u.)特别有效，并且从该启动子产生的所有mrna具有5’-三联前导(tripartiteleader，tpl)序列，这使其成为用于翻译的优选mrna。在一个系统中，重组体腺病毒由穿梭载体与原病毒载体之间的同源重组产生。由于两种原病毒载体之间的可能的重组，因此可从该过程产生野生型腺病毒。因此，从单个噬斑(plaque)分离单个病毒克隆并检查其基因组结构是至关重要的。产生和扩增复制缺陷型的现有腺病毒载体取决于独特的称为293的辅助细胞系，其通过ad5dna片段从人胚肾细胞转化并组成型表达e1蛋白。由于e3区是腺病毒基因组所必需的，因此现有腺病毒载体在293细胞的帮助下在e1、d3或这两个区域中携带外来dna。在自然界中，腺病毒可包装大约105％的野生型基因组，提供额外约2kbdna的容量。加上在e1和e3区域中可被替代的约5.5kb的dna，现有腺病毒载体的最大容量在7.5kb或载体总长度的约15％以下。载体骨架中保留超过80％的腺病毒病毒基因组并且是载体携带的细胞毒性的来源。此外，e1缺失的病毒的复制缺陷是不完全的。辅助细胞系可来自于人细胞，例如人胚胎肾细胞、肌细胞、造血细胞或者其他人胚胎间充质或上皮细胞。或者，辅助细胞可来自于允许人腺病毒的其他哺乳动物物种的细胞。这样的细胞包括例如vero细胞或其他猴胚胎间充质或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。用于培养293细胞和繁殖腺病毒的改进方法是本领域已知的。在一种形式中，通过将单独细胞接种到含有100至200ml培养基的1升硅化旋转瓶(techne，cambridge，uk)中来培养天然细胞聚集体。在以40rpm搅拌后，用台盼蓝(trypanblue)评估细胞生存力。在另一种形式中，如下使用fibra-cel微载体(bibbysterlin，stone，uk)(5g/l)。将重悬在5ml培养基中的细胞接种物添加至250ml锥形瓶中的载体(50ml)并静置1至4小时，偶尔进行搅拌。然后用50ml新鲜培养基更换培养基并开始摇动。对于病毒产生，允许细胞生长至约80％汇合，此后更换培养基(至最终体积的25％)，并添加0.05moi的腺病毒。将培养物静置过夜，然后将体积提高至100％，并再开始摇动72小时。本公开内容的腺病毒是复制缺陷的或至少条件性复制缺陷的。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或a至f亚组中的任一种。亚组c的5型腺病毒是优选的起始材料以获得用于本公开内容的条件性复制缺陷型腺病毒载体。如上所述，根据本公开内容的典型载体是复制缺陷型的，并且不具有腺病毒e1区。因此，最方便的将是在e1编码序列已被去除的位置处引入编码目的基因的多核苷酸。然而，构建体在腺病毒序列内的插入位置不是关键的。编码目的基因的多核苷酸也可插入e3替代载体中来代替缺失的e3区，或者插入其中辅助细胞系或辅助病毒补充e4缺陷的e4区。腺病毒易于生长和操作并在体外和体内展示出广泛的宿主范围。这组病毒可以以高滴度获得，例如，109至1012噬斑形成单位/ml，并且它们是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外来基因是附加体，因此对宿主细胞的遗传毒性低。在用野生型腺病毒进行疫苗接种的研究中未报道有副作用，表明了它们作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜力。腺病毒载体已经用于真核基因表达和疫苗开发。动物研究表明，重组体腺病毒可用于基因治疗。将重组体腺病毒施用于不同组织的研究包括气管滴注(tracheainstillation)、肌肉注射、外周静脉内注射以及向脑中立体定向(stereotactic)接种。逆转录病毒是一组单链rna病毒，其特征在于在所感染的细胞中通过逆转录过程将其rna转化为双链dna的能力。然后所得dna稳定地整合到细胞染色体中作为原病毒并指导病毒蛋白的合成。整合导致在接受细胞及其后代中保留病毒基因序列。逆转录病毒基因组含有分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分的三个基因gag、pol和env。在gag基因上游存在的序列含有用于将基因组包装到病毒粒子中的信号。病毒基因组的5’和3’端存在两个长末端重复(longterminalrepeat，ltr)序列。这些包含强启动子和增强子序列，并且也是整合到宿主细胞基因组中所需要的。为了构建逆转录病毒载体，将编码目的基因的核酸插入到病毒基因组中某些病毒序列位置处以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，构建了含有gag、pol和env基因但无ltr的包装细胞系和包装组分。当将含有cdna的重组体质粒与逆转录病毒ltr和包装序列一起引入(例如通过磷酸钙沉淀)到该细胞系中时，包装序列使重组体质粒的rna转录物包装成病毒颗粒，其随后分泌到培养基中。然后收集含有重组体逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛多种的细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂。基于逆转录病毒的化学修饰，通过将乳糖残基化学添加至病毒包膜，最近开发了设计为使逆转录病毒载体特异性靶向的新方法。这种修饰可使得通过唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。可使用重组体逆转录病毒靶向的不同方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特定细胞受体的生物素化抗体。该抗体通过使用链霉亲和素通过生物素组分偶联。使用针对主要组织相容性复合体i类和ii类抗原的抗体，其已经示出在体外用同向性病毒(ecotropicvirus)感染带有那些表面抗原的多种人细胞。在本公开内容的所有方面中使用逆转录病毒载体存在某些限制。例如，逆转录病毒载体通常整合到细胞基因组中的随机位点中。这可通过中断宿主基因或通过插入可干扰侧翼基因功能的病毒调节序列而导致插入诱变(insertionalmutagenesis)。使用缺陷型逆转录病毒载体的另一个问题是在包装细胞中潜在出现有复制能力的野生型病毒。这可由其中来自重组体病毒的完整序列插入整合在宿主细胞基因组中的gag、pol、env序列的上游的重组事件引起。然而，现在可用的新的包装细胞系可大大降低重组的可能性(参见例如，markowitzetal.，1988；hersdorfferetal.，1990)。另一些病毒载体可用作本公开内容中的表达构建体。可采用来源于例如以下病毒的载体：痘苗病毒(vacciniavirus)、腺相关病毒(aav)和疱疹病毒。它们为多种哺乳动物细胞提供了数个有吸引力的特征。在一些实施方案中，aav载体是复制缺陷型的或条件性复制缺陷型的。在一些实施方案中，aav载体是重组体aav载体。在一些实施方案中，aav载体包含分离自或来源于aav载体的血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh74、aav2i8、aavrh10、aav39、aav43、aavrh8、禽aav、牛aav、犬aav、马aav或绵羊aav或其任意组合的序列。在一些实施方案中，使用单一病毒载体来将编码cas9或cpf1和至少一种grna的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，使用第一病毒载体向细胞提供cas9或cpf1，并使用第二病毒载体向细胞提供至少一种grna。在一些实施方案中，使用单一病毒载体来将编码cas9或cpf1和至少一种grna的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，使用第一病毒载体向细胞提供cas9或cpf1，并使用第二病毒载体向细胞提供至少一种grna。为了实现有义或反义基因构建体的表达，必须将表达构建体递送到细胞中。细胞可以是肌细胞、卫星细胞、成血管细胞(mesoangioblast)、骨髓来源的细胞、基质细胞或间充质干细胞。在一些实施方案中，细胞是心肌细胞、骨骼肌细胞或平滑肌细胞。在一些实施方案中，细胞是胫骨前肌、四头肌、比目鱼肌、膈肌或心脏中的细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干细胞(ipsc)或内细胞团细胞(innercellmasscell，icm)。在另一些实施方案中，细胞是人ipsc或人icm。在一些实施方案中，本公开内容的人ipsc或人icm可来自于培养的干细胞系、成体干细胞、胎盘干细胞，或来自成体干细胞或胚胎干细胞的其他来源，其不需要破坏人胚胎。递送至细胞可在体外实现，如在用于转化细胞系的实验室过程中，或者在体内或离体实现，如在某些疾病状态的治疗中。一种递送机制是通过病毒感染，其中表达构建体被包封在感染性病毒颗粒中。本公开内容也考虑了用于将表达构建体转移到培养的哺乳动物细胞中的数种非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀、deae-葡聚糖、电穿孔、直接显微注射、负载dna的脂质体和lipofectamine-dna复合体、细胞声处理、使用高速微粒的基因轰击和受体介导的转染。这些技术中的一些可成功地适于体内或离体使用。一旦表达构建体已被递送到细胞中，编码目的基因的核酸可在不同位点定位和表达。在某些实施方案中，编码基因的核酸可稳定整合到细胞的基因组中。这种整合可通过同源重组(基因置换)处于同源的位置和方向，或者其可整合到随机的非特异性位置中(基因增强)。在另一些实施方案中，核酸可作为dna的单独的附加体区段稳定地保持在细胞中。这样的核酸区段或“附加体”编码这样的序列，所述序列足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步地维持和复制。如何将表达构建体递送至细胞以及在细胞中核酸保留在何处取决于所使用的表达构建体的类型。在另一个实施方案中，表达构建体可简单地由裸重组体dna或质粒组成。构建体的转移可通过上述的物理或化学渗透细胞膜的任一种方法进行。这特别地适用于体外转移，但也可应用于体内使用。在用于将裸dna表达构建体转移到细胞中的另一个实施方案中，可涉及粒子轰击。这种方法取决于将dna包被的微粒加速至高速以使其穿刺细胞膜并进入细胞而不杀伤它们的能力。已经开发了用于加速小颗粒的数种装置。一种这样的装置依赖于高电压放电以产生电流，其进而提供动力。所用的微粒由生物惰性物质(例如钨或金珠)组成。在一些实施方案中，表达构建体直接递送至对象的肝、皮肤和/或肌组织。这可需要组织或细胞的手术暴露以消除枪和靶器官之间的任何中介组织，即离体处理。同样，编码特定基因的dna可通过该方法递送，并且仍通过本公开内容并入。在另一个实施方案中，表达构建体可包载(entrap)在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊状结构。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自身重排，并且在脂质双层之间包载水和所溶解的溶质。还考虑了lipofectamine-dna复合体。脂质体介导的体外核酸递送和外来dna的表达已经非常成功。称为lipofectamine2000tm的试剂被广泛使用并可商购。在某些实施方案中，脂质体可与血凝病毒(hemagglutinatingvirus，hvj)复合以促进与细胞膜的融合并促进脂质体包封的dna的细胞进入。在另一些实施方案中，脂质体可与核的非组蛋白染色体蛋白(hmg-1)复合或联合使用。在另一些实施方案中，脂质体可与hvj和hmg-1二者复合或联合使用。由于这样的表达构建体已经成功地用于体外和体内核酸的转移和表达，因此它们适用于本公开内容。当在dna构建体中使用细菌启动子时，也期望在脂质体内包含合适的细菌聚合酶。可用于将编码特定基因的核酸递送到细胞中的另一些表达构建体是受体介导的递送载剂。这些利用了在几乎所有真核细胞中通过受体介导的胞吞作用进行的大分子的选择性摄取。由于多种受体的细胞类型特异性分布，因此递送可以是高度特异性的。受体介导的基因靶向载剂通常由两种组分组成：细胞受体特异性配体和dna结合剂。数种配体已经用于受体介导的基因转移。最广泛表征的配体是无唾液酸血清类黏蛋白(asialoorosomucoid，asor)和运铁蛋白(transferrin)。与asor识别相同的受体的合成拟糖蛋白(neoglycoprotein)已经用作基因递送载剂，而表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)也已经用于递送基因至鳞状癌细胞。迪谢内肌营养不良迪谢内肌营养不良(duchennemusculardystrophy，dmd)是隐性x连锁形式的隐性肌营养不良，影响五千分之一的男孩，其导致肌肉退化和早夭。该病症是由位于人x染色体上的肌养蛋白基因(参见genbank登录号nc_000023.11)的突变引起的，所述基因编码肌养蛋白(genbank登录号aaa53189；seqidno：5)。在人中，肌养蛋白mrna含有79个外显子。肌养蛋白mrna已知作为替选地被剪接，导致多种同种型。表1中列出了一些示例性的肌养蛋白同种型。鼠肌养蛋白具有以下氨基酸序列(uniprot登录号p11531，seq.id.no：869)：肌养蛋白是肌组织中的重要组分，其为细胞膜的肌养蛋白聚糖复合物(dystroglycancomplex，dgc)提供结构稳定性。虽然两性都可携带突变，但女性很少受到该疾病的骨骼肌形式的影响。突变的性质和频率各不相同。在约60％至70％的病例中发现了大基因缺失，在约10％的病例中发现了大的重复，并且点突变或其他小的变化占病例的约15％至30％。bladenetal.(2015)对约7000个突变进行了检查，编目了总共5682个大突变(占总突变的80％)，其中4894个(86％)为缺失(1个外显子或更大)，784个(14％)为重复(1个外显子或更大)。有1445个小突变(小于1个外显子，占所有突变的20％)，其中358个(25％)为小缺失，132个(9％)是小插入，而199个(14％)影响了剪接位点。点突变总计756个(小突变的52％)，其中有726个(50％)无义突变和30个(2％)错义突变。最后，观察到22个(0.3％)内含子中(mid-intronic)突变。此外，在数据库中鉴定出可能会受益于dmd的新型遗传治疗，包括终止密码子通读治疗(占总突变的10％)和外显子跳读治疗(占缺失的80％和总突变的55％)的突变。dmd对象特征和临床表现。症状通常出现在2至3岁之间的男孩中，在婴儿早期可能就很明显。即使直到婴儿早期都不会出现症状，实验室测试仍可识别出出生时携带活性突变的儿童。首先观察到与肌肉量损失相关的腿和骨盆的进行性近端肌无力。最终，这种无力蔓延至手臂、颈部和其他区域。早期体征可包括假性肥大(腓肠肌和三角肌增大)、耐力低下、无辅助下站立困难或无法上楼梯。随着病症进展，肌组织会逐渐损耗，最终被脂肪和纤维化组织(纤维化)所替代。到10岁时，可能需要用支架来辅助行走，但是大多数患者在12岁时仍然依赖轮椅。后来的症状可包括骨骼发育异常，这导致骨骼畸形，包括脊柱弯曲。由于肌肉的逐渐恶化，会发生运动丧失，最终导致瘫痪。智力障碍可能存在也可能不存在，但如果存在，则不会随着儿童的年龄增长而加重。患有dmd的男性平均预期寿命为约25岁。迪谢内肌营养不良(一种进行性神经肌肉病症)的主要症状是与肌肉损耗相关的肌无力，其中随意肌首先受影响，尤其是髋部、骨盆区域、大腿、肩部和小腿的随意肌。肌无力也会随后在手臂、颈部和其他区域发生。小腿经常增大。症状通常在6岁之前出现，并可能在婴儿早期出现。其他身体症状有：1.不便的行走、踏步或跑步方式-(由于腓肠肌张力提高，患者倾向于用前脚行走。而且，用脚趾行走是对膝伸肌无力的一种补偿性适应。)2.频繁跌倒。3.疲劳。4.运动技能(跑步、跳跃、跳高)困难。5.腰椎过度前凸(lumbarhyperlordosis)，可能导致髋屈肌缩短。这会影响整体姿势以及行走、踏步或跑步的方式。6.跟腱和腘旁腱(hamstring)的肌肉挛缩会损害功能性，因为肌纤维变短和结缔组织中的纤维化(fibrose)。7.进行性行走困难。8.肌纤维畸形。9.舌和腓肠肌肉的假性肥大(增大)。肌组织最终被脂肪和结缔组织代替，因此被称为假性肥大。10.神经行为障碍(例如，adhd)、学习障碍(诵读困难(dyslexia))和特定认知技能(尤其是短期言语记忆)的非进行性虚弱的较高风险，这被认为是由于脑中肌养蛋白的缺乏或功能障碍引起的。11.最终丧失行走能力(通常在12岁时)。12.骨骼畸形(在某些情况下包括脊柱侧凸)。13.无法从躺着或坐着的姿势起身。从患者迈出其第一步之时起，就可从临床上观察到这种情况，而且行走能力通常在男孩9至12岁之间完全丧失。大多数受dmd影响的男性到21岁时都会变得基本上“从颈部向下瘫痪”。肌肉损耗始于腿部和骨盆，然后进展至肩膀和颈部的肌肉，随后是手臂肌肉和呼吸肌的丧失。腓肠肌增大(假性肥大)非常明显。特别是心肌病(扩张型心肌病)是常见的，但充血性心力衰竭或心律不齐(心律不规则)的发生只是偶尔的。高尔氏体征(gowers’sign)呈阳性反映了下肢肌肉的损伤更为严重。儿童可用上肢帮助自己起身：首先是用手臂和膝盖立起来，然后用手沿着他的腿向上“走”以直立。患病的儿童通常比同龄人更容易疲倦，总体力量更弱。血液中的肌酸激酶(cpk-mm)水平非常高。肌电图(electromyography，emg)显示无力是由肌组织的破坏而不是神经损伤引起的。遗传学测试可揭示xp21基因的遗传错误。肌肉活检(免疫组织化学或免疫印迹)或遗传学测试(血液测试)证实肌养蛋白的缺乏，尽管遗传学测试的改进常常使之不必要。dmd患者可能患有：1.心肌异常(心肌病)。2.充血性心力衰竭或心律不齐(心律不齐)。3.胸部和背部畸形(脊柱侧凸)。4.小腿、臀部和肩膀的肌肉增大(约4或5岁)。这些肌肉最终被脂肪和结缔组织代替(假性肥大)。5.肌肉量减少(萎缩)。6.脚跟、腿部的肌肉挛缩。7.肌肉畸形。8.呼吸系统病症，包括肺炎和吞咽食物或流体进入肺部内(在该病症晚期)。迪谢内肌营养不良(dmd)是由位于x染色体短臂上的xp21基因座处的肌养蛋白基因的突变引起的。肌养蛋白负责通过包含许多亚基的蛋白质复合物连接每条肌肉纤维的细胞骨架与下面的基膜(胞外基质)。肌养蛋白的缺乏使过量的钙渗透到肌膜(细胞膜)中。钙和信号传导途径的改变导致水进入到线粒体中，然后线粒体破裂。在骨骼肌营养不良中，线粒体功能障碍会导致应激诱导的胞质钙信号增强，以及应激诱导的活性氧类(ros)产生。在一个涉及多个途径并且尚不清楚的复杂的级联过程中，细胞内提高的氧化应激会损害肌膜，并最终导致细胞死亡。肌纤维经历坏死，最终被脂肪和结缔组织替代。dmd以x连锁隐性模式遗传。女性通常是该疾病的携带者，而男性将受到影响。通常，女性携带者会一直不知道自己携带突变，直到她们生下受影响的儿子。携带者母亲的儿子有50％的可能性从他的母亲那里遗传缺陷基因。携带者母亲的女儿有50％的可能性成为携带者，并有50％的可能性拥有该基因的两个正常拷贝。在所有情况下，未受影响的父亲都会将正常的y传递给他的儿子，或者将正常的x传递给他的女儿。x连锁隐性病症(例如dmd)的女性携带者可能会根据其x失活模式而显示出症状。人dmd基因的外显子51之前的外显子缺失通过并列框外外显子而破坏了开放阅读框(openreadingflame，orf)，代表了人dmd突变的最常见类型。原则上，外显子51的跳读可使13％具有外显子缺失的dmd患者恢复dmdorf。迪谢内肌营养不良的发病率是五千分之一。肌养蛋白基因内的突变可遗传或在种系传递过程中自发发生。序列下表提供了与本文中公开的组合物和方法结合使用的示例性引物、grna和基因组靶序列。表4：dmdipsc的引物序列表5：前12个外显子的基因组靶序列。表6-基因组靶序列*在此表中，大写字母表示与基因的外显子序列对齐的核苷酸。小写字母表示与基因的内含子序列对齐的核苷酸。表7-grna序列*在此表中，大写字母表示与基因的外显子序列对齐的sgrna核苷酸。小写字母表示与基因的内含子序列对齐的sgrna核苷酸。表8：小鼠dmd外显子51中sgrna的基因组靶位点表9：靶向小鼠dmd外显子51的grna序列表10：靶向人dmd外显子51的sgrna的基因组靶序列表11：靶向人dmd外显子51的sgrna序列表12：靶向多种人dmd外显子中的位点的sgrna的基因组靶序列表13：靶向多种人dmd外显子中的位点的grna序列表14：靶向狗dmd外显子51的sgrna的基因组靶向序列表15：靶向狗dmd外显子51的grna序列表16-外显子43和45的grna序列sgrnaid序列(5’-3’)seqidno.ex45-grna#3cgctgcccaatgccatcctg948ex45-grna#4atcttacaggaactccagga949ex45-grna#5aggaactccaggatggcatt950ex45-grna#6cgctgcccaatgccatcc951ex43-grna#1gttttaaaatttttatatta952ex43-grna#2ttttatattacagaatataa953ex43-grna#4tatgtgttacctacccttgt954ex43-grna#6gtacaaggaccgacaagggt955表17-外显子43和45的grna序列sgrnaid序列(5’-3’)seqidno.ex45-grna#3caggauggcauugggcagcg956ex45-grna#4uccuggaguuccuguaagau957ex45-grna#5aaugccauccuggaguuccu958ex45-grna#6ggauggcauugggcagcg959ex43-grna#1uaauauaaaaauuuuaaaac960ex43-grna#2uuauauucuguaauauaaaa961ex43-grna#4acaaggguagguaacacaua962ex43-grna#6acccuugucgguccuuguac963ex45-grna#3’cgcugcccaaugccauccug964ex45-grna#4’aucuuacaggaacuccagga965ex45-grna#5’aggaacuccaggauggcauu966ex45-grna#6’cgcugcccaaugccaucc967ex43-grna#1’guuuuaaaauuuuuauauua968ex43-grna#2’uuuuauauuacagaauauaa969ex43-grna#4’uauguguuaccuacccuugu970ex43-grna#6’guacaaggaccgacaagggu971表18-grna序列表19-其他grna靶向序列vii.实施例包括以下实施例以说明本公开内容的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开内容的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。实施例1用crispr/cas9的基因组编辑是一种用于校正或减轻疾病引起的突变的有前景的新方法。迪谢内肌营养不良(dmd)与由x连锁肌养蛋白基因(dmd)的多于3000种不同突变引起的心肌和骨骼肌致死性退化有关。这些突变大多数都聚集在“热点”中。真核剪接接纳体和剪接供体序列与控制原核crispr/cas9靶基因识别和切割的原间隔序列邻近基序(protospaceradjacentmotif)序列之间存在偶然的对应关系。利用这种对应关系，筛选了能够通过非同源末端连接引入插入/缺失(插失)突变的最佳指导rna，所述rna消除了12个外显子中保守的rna剪接位点，从而有可能跳读突变热点内或附近的最常见的突变或框外dmd外显子。通过外显子跳读对dmd突变的校正在本文中称为“肌编辑(myoediting)”。在概念验证研究中，在来自多个患者的在dmd基因内具有大的缺失、点突变或重复的代表性诱导多能干细胞中进行了肌编辑，并有效地恢复了衍生心肌细胞中肌养蛋白的表达。在三维工程化的心肌(ehm)中，对dmd突变进行肌编辑恢复了肌养蛋白的表达和相应的收缩机械力。仅校正一部分心肌细胞(30％至50％)就足以将突变的ehm表型挽救到接近正常的对照水平。因此，消除保守的rna剪接接纳体/供体位点，并指导剪接机制通过肌编辑来跳读突变或框外的外显子，允许通过消除疾病的潜在遗传基础来校正与dmd有关的心脏异常。鉴定最佳指导rna以靶向与dmd突变的热点区域相关的12个不同外显子表5示出了当被跳读时可潜在恢复大多数dmd突变的热点区域中的肌养蛋白开放阅读框的前12个外显子的列表。作为通过外显子跳读来校正大多数的人dmd突变的第一步，筛选了指导rna的合并物，以靶向人dmd基因的前12个外显子(图1a和1b)。选择3至6个pam序列(nag或ngg)以分别靶向每个外显子的3’或5’剪接位点(图1a和表5)。这些指导rna被克隆在质粒spcas9-2a-gfp中。去除必需的剪接供体或接纳体序列的插入缺失允许跳读相应的靶标外显子。根据已知dmd突变的频率，可预测这些指导rna能够挽救多达60％的dmd患者的肌养蛋白功能。为了测试该策略在人基因组中的可行性和效力，人胚胎肾293细胞(239个细胞)被用于靶向外显子51的剪接接纳体位点(图1c)。通过绿色荧光蛋白(gfp)表达对转染的293细胞进行分选，并通过错配特异性t7e1核酸内切酶测定来检测基因编辑效率(图6a)。表5和图2b示出了三种指导rna(ex51-g1、ex51-g2和ex51-g3)靶向外显子51的剪接接纳体位点的能力。在gfp阳性分选的293细胞中，ex51-g3显示出高编辑活性，而ex51-g1和ex51-g2没有可检测的活性。接下来，评价了靶向前12个外显子(包括外显子51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8和55)的指导rna的切割效率。其中每个外显子编辑效率最高的一个或两个指导rna如图1c所示。针对外显子51、45和55选择的指导rna使用nag作为pam(表5)。克隆了来自经肌编辑的前12个外显子的基因组聚合酶链反应(pcr)产物并进行了测序(图5a和表20)。观察到插入缺失去除了必要的剪接位点或移动了开放阅读框(图5a)。在脑和肾组织中，肌养蛋白(dp140)的n端截短形式从内含子44的另一种启动子转录而来。dp140mrna中的六个靶向的外显子(外显子51、53、46、52、50和55)的跳读通过对逆转录pcr(rt-pcr)产物进行测序在293细胞中来证实(图5b)。表20：前12个外显子的引物序列。通过肌编辑校正不同的dmd患者突变为了评价单一指导rna通过外显子跳读校正不同类型的人dmd突变的有效性，获得了三种具有代表性dmd突变类型的dmdipsc系：大的缺失(称为del；缺少外显子48至50)、假外显子突变(称为pex；由内含子点突变引起)和复制突变(称为dup)。简而言之，将从全血中获得的外周血单个核细胞(peripheralbloodmono-nuclearcell，pbmc)培养，然后使用表达重编程因子的重组仙台病毒载体重编程为ipsc。通过核转染将用于校正或绕过来自具有外显子48的大的缺失的dmd患者的ipsc系(也称为del)至多种系上的ipsc肌编辑中的突变的cas9和指导rna引入到细胞内。然后使用标准化条件将经处理的细胞或单个克隆的合并物分化为诱导型心肌细胞(inducedcardiomyocyte，icm)。经纯化的icm用于生成3d-ehm并用于进行功能测定(图2a)。大的缺失突变的校正据估计，约60％至70％的dmd病例是由一个或更多个外显子的大的缺失引起的。在来自在热点中具有外显子48至50的大的缺失的dmd患者的ipsc系上进行了肌编辑。大的缺失产生移码突变并在外显子51中引入过早终止密码子，如图2b所示。原则上，外显子51中的剪接接纳体的破坏将允许对外显子47至52进行剪接，从而重构开放阅读框(图2b和图6b)。从理论上讲，跳读第51外显子可校正约13％的dmd患者。将优化的指导rnaex51-g3和cas9(图2c)核转染到该ipsc系中，导致通过nhej成功破坏了剪接接纳体或重新构建了外显子51，如基因组测序所示，并恢复了开放阅读框(图6b)。将经肌编辑的dmdipsc(del-cor.)的合并物分化为icm，并通过对来自外显子47至52的扩增的rt-pcr产物进行测序，确认了对框内肌养蛋白mrna表达的挽救(图2d和图6c)。假外显子突变的校正为了将这种方法进一步扩展到稀有突变，已尝试校正来自dmd患者的ipsc中的点突变(也称为pex)，该患者在内含子47中具有自发性点突变(c.6913-4037t＞g)。该点突变产生了新的rna剪接接纳体位点(ynnyag)，并产生了外显子47a的假外显子(图2e)，该假外显子编码了过早的终止信号。设计了两个指导rna(ex47a-g1和ex47a-g2)以精确靶向突变(图2f、图7a和7b)。如图2g所示，肌编辑消除了隐性剪接接纳体位点，并永久跳读了假外显子，从而在经校正的细胞中恢复了全长肌养蛋白(pex-cor.)。通过rt-pcr在这些dmdicm中测试了外显子跳读的效力(图2g)。对rt-pcr产物的测序证实了外显子47被剪接至外显子48(图7c)。值得注意的是，ex47a-g2仅靶向突变等位基因，因为野生型内含子缺少spcas9的pam序列(nag)。此外，该患者中的t＞g突变为cas9创建了疾病特异性pam序列(ag)。还值得注意的是，这种类型的校正恢复了正常的肌养蛋白，而没有任何内部缺失(图7b和7c)。大的重复突变的校正外显子重复占鉴定的dmd引起的突变的约10％至15％。肌编辑在来自具有大的重复(外显子55至59)的dmd患者的ipsc系(也称为dup)上进行测试，其破坏了肌养蛋白的开放阅读框(图2h)。进行了全基因组测序并分析了来自该患者的细胞中的拷贝数变异特征，并鉴定了内含子54中的精确插入位点(图2h)。通过pcr证实了该插入位点(in59-in54连接)(图8a和表4)。假设复制的外显子55的5’侧翼序列是相同的，使得靶向该区域的一个指导rna应该能够产生两个dsb并删除整个复制的区域(外显子55至59；约150kb)。为了检验该假设，设计了三个指导rna(in54-g1、in54-g2和in54-g3)以靶向内含子54和外显子55交界处的序列(图2i)。通过t7e1在293细胞中评价了用这些指导rna切割dna的效率(图8b)。选择指导rnain54-g1用于dupipsc的后续实验。克隆了来自经肌编辑的dupipsc混合物的基因组pcr产物并进行了测序(图8c)。为了确认复制突变的校正，将经处理的dmdipsc(也称为dup-cor.)的合并物分化为心肌细胞。使用重复特异性引物(ex59f，外显子59中的正向引物，和ex55r，外显子55中的反向引物)，通过rt-pcr对具有重复外显子的mrna进行半定量，并归一化成b-肌动蛋白基因的表达(图2j和表4)。如所预期的，复制特异性rt-pcr条带在野生型(wt)细胞中不存在，而在dup-cor.细胞中则显著降低。为了证实该结果，在外显子53至ex55和ex59至外显子60的复制边界上进行rt-pcr(图8d)。在经校正的icm中，复制特异性上条带的强度降低。从经处理的细胞混合物中挑选出单个集落。使用复制特异性pcr引物(f2-r1)筛选经校正的集落(图8e)。图8e示出了三个代表性的经校正集落(dup-cor.#4、#6和#26)和未经校正的对照(dup)的pcr结果。在集落4、6和26中没有重复特异性pcr条带，证实了重复dna区域的缺失。通过肌编辑恢复患者来源的icm中的肌养蛋白接下来，通过免疫细胞化学法(图3a至3c、图6d、7d和8f)和western印迹分析(图24，d至f)证实了肌养蛋白在单个克隆和经处理的icm合并物中的恢复和稳定表达。即使没有克隆选择和扩增，del-cor.、pex-cor.和dup-cor.中的大多数icm也是肌养蛋白阳性的(图3a至3c、图6d、7d和8f)。从经肌编辑的delipsc的混合物中，挑选出两个克隆(#16和#27)并将其分化为心肌细胞。选择了具有更高肌养蛋白表达水平的克隆#27用于后续实验(也称为del-cor-sc)。一个选择的用于经校正的pex的克隆(#19)用于进一步研究(也称为pex-cor-sc)。将两个选择的用于经校正的dup的克隆(#26和#6)分化为icm。克隆#6用于功能测定实验(也称为dup-cor-sc)。通过免疫细胞化学法和western印迹分析，经校正的icm的肌养蛋白表达水平估计与野生型心肌细胞相当(50％至100％)(图3)。通过肌编辑恢复患者来源的icm的功能除了通过生物化学方法测量肌养蛋白的mrna和蛋白质表达外，还使用了来源于正常、dmd和经校正的dmdicm的3d-ehm，对宏观尺度进行功能分析。简而言之，通过葡萄糖剥夺来代谢性地纯化ipsc来源的心肌细胞。将经纯化的心肌细胞与人包皮成纤维细胞(humanforeskinfibroblast，hff)以70％：30％的比混合。将细胞混合物重建在牛胶原蛋白和无血清培养基的混合物中。培养4周后，进行收缩实验(图4a)。测试了来自八个ipsc系的ehm：(i)wt，(ii)未经校正的del，(iii)del-cor-sc，(iv)未经校正的pex，(v)pex-cor.，(vi)pex-cor-sc，(vii)未经校正的dup和(viii)dup-cor-sc。ehm中dmd和经校正的dmd心肌细胞的功能表型显示，与wtehm相比，所有dmdehm(del、pex和dup)均具有收缩功能障碍(图4b至4e)。与pex和dupehm相比，在del中观察到更明显的收缩功能障碍。收缩力(forceofcontraction，foc)在dmdehm中的显著降低，而在经校正的dmdehm(del-cor-sc、pex-cor-sc和dup-cor-sc)中则显著提高(图4b至4e)，在dup-cor-sc中具有完全恢复的心肌细胞最大肌力能力(图4d和4e)。由于当前的基因治疗递送方法仅能影响一部分心肌，因此一个明显的问题是，要挽救dcm表型，需要多少百分比的经校正的心肌细胞。为了解决这个问题，将dmd细胞(del)和经校正的dmd细胞(del-cor-sc)精确混合以模拟ehm中的广泛范围的“治疗效率”(10至100％)(图4f)。这表明为了部分(30％)或最大(50％)地挽救收缩表型需要修复30％至50％的心肌细胞(图4f)。这些发现与先前的体内研究一致，所述研究显示携带者小鼠的50％心肌细胞中的嵌合(mosaic)肌养蛋白表达导致接近正常的心脏表型。我们的发现表明，在经校正的dmdehm中，收缩功能障碍可有效地恢复到与wtehm相当的水平。因此，肌编辑是挽救ehm中dmd临床表型的高度特异性和有效的方法。讨论dmd基因是人基因组中已知的最大基因，涵盖260万个碱基对，编码79个外显子。dmd基因的大尺寸和复杂结构导致其高自发突变率。在人中有约3000种记录的突变，其中包括大的缺失或重复(约77％)、小的插入缺失(约12％)和点突变(约9％)。这些突变主要影响外显子。然而，内含子突变会改变剪接模式并引起疾病，如此处针对pex突变所示。为了潜在地简化通过crispr/cas9基因编辑对不同的dmd突变的校正，确定了能够跳读前12个外显子的指导rna，约占60％的dmd患者。因此，不必为每个dmd突变设计单独的指导，也不必使用成对的指导rna切除较大的基因组区域。相反，可将患者突变分组，以便跳读单个外显子可在大量患者中恢复肌养蛋白的表达。在实施例1中所述的概念验证研究中，仅使用一种指导rna的优化的肌编辑方法有效地恢复了广泛的突变类型(包括大的缺失、点突变和重复)的dmd开放阅读框，涵盖了大多数dmd群体。即使是相对较大和复杂的缺失，也可通过单次切割dna序列来校正，其消除了剪接接纳体或供体位点，而无需使用多个指导rna来指导同时进行的在远距离位点处的切割以及dna末端的连接。尽管外显子跳读主要将dmd转化为较轻的bmd，但对于一部分具有重复或假外显子突变的患者，肌编辑可消除突变并恢复正常的肌养蛋白的产生，正如我们在针对pex和dup突变的本研究中所示出的那样。扩张型心肌病的特征在于收缩功能障碍和心室腔扩大，其是dmd患者死亡的主要原因之一。然而，由于心脏生理学和解剖学中的种间显著差异以及疾病的自然病史、这些动物的缩短的寿命(约2年)以及它们心脏的小尺寸(人心脏尺寸的1/3000)，在年轻的dmd小鼠模型中通常不会观察到心肌病。为了克服2d细胞培养系统和小型动物模型的局限性和缺点，人ipsc来源的3d-ehm被用于显示肌养蛋白突变会损害心脏收缩力和对钙浓度的敏感性。在dmdehm中观察到收缩功能障碍，类似于dmd患者的dcm临床表型。通过肌编辑，在经校正的dmdehm中，收缩功能障碍部分或完全恢复。因此，基因组编辑代表了消除遗传原因并校正与dmd相关的肌肉和心脏异常的有效手段。本文中提供的数据进一步证明ehm可用作合适的临床前工具，以近似肌编辑的治疗效率。人crispr临床试验在中国和美国获得批准。crispr/cas9系统的一个关键问题是特异性，因为脱靶效应可能会导致基因组发生意外突变。已经开发出多种方法来评价可能的脱靶效应，包括(i)对靶位点进行计算机预测，并通过深度测序对其进行测试，以及(ii)无偏的全基因组测序。此外，据报道，有数种新方法可使潜在的脱靶效应最小化和/或提高crispr/cas9系统的特异性，包括滴定cas9和指导rna的剂量、成对的cas9切口酶、截短的指导rna和高-保真度或增强的cas9。尽管大多数研究都使用了体外细胞培养系统，但我们和其他人在我们先前的小鼠种系编辑和产后编辑的研究中并未观察到脱靶效应。根据最近在人植入前胚胎中进行基因编辑的研究，在编辑后的基因组中也未检测到脱靶突变。尽管对脱靶作用的全面而广泛的分析超出了本研究的范围，但我们知晓在潜在的治疗应用之前彻底评价单个指导rna的脱靶作用最终将很重要。材料和方法质粒。包含人密码子优化的spcas9基因和2a-egfp以及指导rna的骨架的pspcas9(bb)-2a-gfp(px458)质粒由f.zhang惠赠(质粒#48138，addgene)。根据fengzhang实验室crispr质粒说明(addgene.org/crispr/zhang/)进行指导rna的克隆。人293细胞的转染和细胞分选。根据制造商的说明，用lipofectamine2000transfectionreagent(thermofisherscientific)转染细胞，并将细胞孵育总计48至72小时。细胞分选是由德克萨斯大学(ut)西南医学中心的流式细胞术核心实验室进行的。使用胰蛋白酶-edta溶液将转染的细胞解离。将混合物在37℃下孵育5分钟，然后添加2ml温热的补充有10％的胎牛血清的dulbecco’s改良的eagle’s培养基。将重悬的细胞转移至15mlfalcon管中并轻轻研磨20次。将细胞在室温下以1300rpm离心5分钟。除去培养基，将细胞重悬于500ml补充有2％牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将细胞通过细胞过滤器管的网盖过滤到细胞过滤器管中。将分选的单一细胞分离到微量离心管中，分为gfp+和gfp-细胞群。人ipsc维持、核转染和分化。dmdipsc系del是从cellbankrikenbioresourcecenter(细胞编号hps0164)购买的。wtipsc系由d.garry(明尼苏达大学)惠赠。其他ipsc系(pex和dup)由ut西南韦尔斯通肌编辑中心(utsouthwesternwellstonemyoeditingcore)生成并维持。简而言之，将从dmd患者全血中获得的pbmc培养，然后使用表达重编程因子的重组仙台病毒载体(cytotune2.0，lifetechnologies)重编程为ipsc。通过免疫细胞化学法、支原体测试和畸胎瘤形成验证了ipsc集落。将人ipsc在mtesrtm1培养基(stemcelltechnologies)中培养，约每4天传代(1∶18的分配比)。核转染之前一小时，ipsc用10mmrock抑制剂(y-27632)处理，并使用accutase(innovativecelltechnologiesinc.)解离为单一细胞。将细胞(1×106个)与5mgspcas9-2a-gfp质粒混合，并根据制造商的方案使用p3primarycell4d-nucleofectorx试剂盒(lonza)进行核转染。核转染后，将ipsc在补充有10mmrock抑制剂、青霉素-链霉素(1∶100)(thermofisherscientific)和primosin(100mg/ml；invivogen)的mtesrtm1培养基中培养。核转染之后三天，如上所述，通过荧光激活的细胞分选对gfp+和gfp-进行分选，并进行pcr和t7e1测定。从分选的细胞中分离基因组dna。将蛋白酶k(20mg/ml)添加到directpcrlysisreagent(viagenbiotechinc.)，终浓度为1mg/ml。将细胞在4℃下以6000rpm离心10分钟，并弃去上清液。将保存在冰上的细胞沉淀重悬于50至100ml的directpcr/蛋白酶k溶液中，并在55℃下孵育2小时以上，或直至观察不到团块。将粗制裂解物在85℃下孵育30分钟，然后离心10秒。添加nacl至终浓度为250mm，随后添加0.7体积的异丙醇以沉淀dna。将dna在4℃下以13000rpm离心5分钟，并弃去上清液。将dna沉淀用1ml70％etoh洗涤并溶于水中。使用nanodrop仪器(thermofisherscientific)测量dna浓度。通过pcr扩增目标基因组区域。pcr测定包含2mlgotaq聚合酶(promega)，20ml5×绿色gotaq反应缓冲液，8ml25mmmgcl2、2ml10mm引物，2ml10mm脱氧核苷酸三磷酸，8ml基因组dna，并用双蒸h2o(ddh2o)补足至100ml。pcr条件如下：94℃2分钟，(94℃15秒，59℃30秒和72℃1分钟)×32个循环，72℃7分钟，然后保持在4℃下。pcr产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，并使用qiaquickpcrpurification试剂盒(qiagen)从凝胶上纯化，用于直接测序。根据制造商的说明，将这些pcr产物亚克隆到pcrii-topo载体(invitrogen)中。挑选单个克隆，并对dna进行测序。pcr产物的t7e1分析。使用以下条件，通过对25ml基因组pcr样品进行变性/复性获得不匹配的双链dna：95℃10分钟，95℃至85℃(-2.0℃/秒)，85℃1分钟，85℃至75℃(-0.3℃/秒)，75℃1分钟，75℃至65℃(-0.3℃/秒)，65℃1分钟，65℃至55℃(-0.3℃/秒)，55℃1分钟，55℃至45℃(-0.3℃/秒)，45℃1分钟，45℃至35℃(-0.3℃/秒)，35℃1分钟，35℃至25℃(-0.3℃/秒)，25℃1分钟，然后保持在4℃下。变性/复性后，将以下添加至样品：3ml的10xnebuffer2、0.3ml的t7e1(newenglandbiolabs)，用ddh2o补足至30ml。消化的反应液在37℃下孵育1小时。未经消化的pcr样品和经t7e1消化的pcr产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。全基因组测序。通过将血液样品提交给novogenecorporation进行全基因组测序。经纯化的基因组dna(1.0mg)用作dna样品制备的输入材料。遵循制造商的说明，使用truseqnanodnahtsamplepreparation试剂盒(illumina)生成测序文库。简而言之，通过超声处理将dna样品片段化为350bp的大小。将dna片段末端抛光，加a尾并与全长衔接物连接，以进行illumina测序以及进一步的pcr扩增。在illumina测序平台上对文库进行测序，并产生配对末端的读取。rna的分离。根据制造商的说明，使用trizolrna分离试剂(thermofisherscientific)从细胞中分离rna。心肌细胞的分化和纯化。使ipsc适应并维持在pbs包被的板中的1∶120matrigel上的tesr-e8(stemcelltechnologies)中，并每周两次使用edta溶液(versene，thermofisherscientific)传代。对于心脏分化，将ipsc以5×104至1×105个细胞/cm2接种，并用rpmi、2％b27、200mml-抗坏血酸-2-磷酸盐倍半镁盐水合物(asc；sigma-aldrich)、激活素a(9ng/ml；r&dsystems)、bmp4(5ng/ml；r&dsystems)、1mmchir99021(stemgent)和fgf-2(5ng/ml；miltenyibiotec)诱导3天；在用rpmi培养基再次洗涤后，在第4至13天将细胞用补充有2％b27和200mmasc的rpmi中的5mmiwp4(stemgent)进行培养。在第13天至第17天，在含有2.2mm乳酸钠(sigma-aldrich)、100mmb-巯基乙醇(sigma-aldrich)、青霉素(100u/ml)和链霉素(100mg/ml)的无葡萄糖rpmi(thermofisherscientific)中通过葡萄糖剥夺来代谢性地纯化心肌细胞。来自15个独立的分化运行(每种细胞系1至3个)的心肌细胞纯度为92±2％。ehm产生。为了产生确定的、无血清的ehm，将经纯化的心肌细胞与hff(美国典型培养物保藏中心)以70％：30％的比混合。将细胞混合物在ph中和的医用牛胶原蛋白(0.4mg/ehm；llccollagensolutions)与浓缩的无血清培养基[2×rpmi，8％b27，无胰岛素，青霉素(200u/ml)和链霉素(200mg/ml)]的混合物中重建，并在含有以下的iscove培养基中培养3天：4％b27，不含胰岛素，1％非必需氨基酸，2mm谷氨酰胺，300mm抗坏血酸，igf1(100ng/ml；af-100-11)，fgf-2(10ng/ml；af-100-18b)，vegf165(5ng/ml；af-100-20)，tgf-b1(5ng/ml；af-100-21c；所有生长因子均来自peprotech)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100mg/ml)。经过3天的凝结期后，将ehm转移至柔性支持物以支持增张力性收缩(auxotoniccontraction)。在总共4周的ehm培养期之后进行分析。收缩功能分析。在等量条件下于37℃下的器官浴中于充气(5％co2/95％o2)tyrode’s溶液(含120mmnacl，1mmmgcl2，0.2mmcacl2，5.4mmkcl，22.6mmnahco3，4.2mmnah2po4，5.6mm葡萄糖和0.56mm抗坏血酸盐)中进行收缩实验。用200ma的5ms矩形脉冲以1.5hz电刺激ehm。以125mm的间隔机械拉伸ehm，直到根据frank-starling定律观察到最大收缩力幅(foc)。研究了对提高的胞外钙(0.2至4mm)的响应，以确定最大的肌力能力。如有指示，则将力归一化为肌肉含量(如通过流式细胞术所测定的肌节a-辅肌动蛋白阳性细胞含量)。ehm来源细胞的流式细胞术。如先前所述制备ehm的单一细胞悬液，并将其固定在冰冷的70％乙醇中。将固定的细胞用hoechst3342(10mg/ml；lifetechnologies)染色以排除细胞双峰。通过肌节a-辅肌动蛋白染色(克隆ea-53，sigma-aldrich)鉴定心肌细胞。将细胞在lsriisorp细胞计数器(bdbiosciences)上运行，并使用diva软件进行分析。每个样品至少分析了10,000个事件。免疫染色。将ipsc来源的心肌细胞用丙酮固定并进行免疫染色。用血清混合物(2％正常马血清/2％正常驴血清/0.2％bsa/pbs)封闭固定的心肌细胞，并用0.2％bsa/pbs中的肌养蛋白抗体(1∶800；mandys8，sigma-aldrich)和肌钙蛋白-i抗体(1∶200；h170，santacruzbiotechnology)孵育。在4℃下孵育过夜后，将其用二抗[生物素化的马抗小鼠免疫球蛋白g(igg)(1∶200；vectorlaboratories)和荧光素偶联的驴抗兔igg(1∶50；jacksonimmunoresearch)孵育1小时。细胞核用hoechst33342(molecularprobes)复染。将待免疫染色的ehm冷冻切片解冻，进一步风干，并固定在冷的丙酮中(在-20℃下10分钟)。将切片在pbs(ph7.3)中短暂平衡，然后用血清混合物(2％正常马血清/2％正常驴血清/0.2％bsa/pbs)封闭1小时。将封闭混合物倾析出，并施加0.2％bsa/pbs中的肌养蛋白/肌钙蛋白一抗混合物[小鼠抗肌养蛋白，mandys8(1∶800；sigma-aldrich)和兔抗肌钙蛋白-i(1∶200；h170，santacruzbio-technology)]而无需进行中间洗涤。在4℃下孵育过夜后，用pbs洗涤去除未结合的一抗，并用在0.2％bsa/pbs中稀释的二抗[生物素化的马抗小鼠igg(1∶200；vectorlaboratories)和若丹明驴抗兔igg(1∶50；jacksonimmunoresearch)]探测切片。未结合的二抗用pbs洗涤去除，并将切片用在pbs中稀释的荧光素-亲和素-dcs(1∶60；vectorlaboratories)孵育10分钟进行最后的肌养蛋白标记。用pbs洗涤除去未结合的若丹明，用hoechst33342(2mg/ml；molecularprobes)对细胞核进行复染，并用vectashield(vectorlaboratories)对载玻片进行盖玻片。western印迹分析。使用肌养蛋白(ab15277，abcam；d8168，sigma-aldrich)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(mab374，millipore)和心肌肌球蛋白重链(ab50967，abcam)的抗体对人ipsc来源的心肌细胞进行western印迹分析。山羊抗小鼠和山羊抗兔辣根过氧化物酶偶联的二抗(bio-rad)用于描述的实验。**************根据本公开内容，无需过度实验即可制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开内容的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行变化。更具体地，明显的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时可以获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的是的所有这些类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本公开内容的精神、范围和概念内。vii.参考文献以下参考文献在其为本文给出的内容提供示例性程序或其他细节补充的程度上，特别地通过引用并入本文。angeletal.，mol.cell.biol.，7：2256，1987a，angeletal.，cell，49：729，1987b.aartsma-rusetal.，hum.mutat.30，293-299，2009.baichwalandsugden，in：cenetransfer，kucherlapati(ed)，ny，plenumpress，117-148，1986.banerjietal.，cell，27(2pt1)：299-308，1981.banerjietal.，cell，33(3)：729-740，1983.barnesetal.，j.biol.chem.，272(17)：11510-7，1997.baskinetal.，embomolmed6，1610-1621，2014.benvenistyandneshif，proc.natl.acad.sci.usa，83：9551-9555，1986.berkhoutetal.，cell，59：273-282，1989.bhavsaretal.，genomics，35(1)：11-23，1996.bikardetal.，nucleicacidsres.41(15)：7429-7437，2013.blanarelal.，emboj.，8：1139，1989.bodineandley，emboj.，6：2997，1987.boshartetal.，cell，41：521，1985.bosticketal.，molther19，1826-1832，2011.boszeetal.，emboj.，5(7)：1615-1623，1986.braddocketal.，cell，58：269，1989.brinsteretal.，proc，natl.acad，sci.csa，82(13)：4438-4442，1985.bullaandsiddigui，j.virol.，62：1437，1986.burridgeetal.，nat.methods11，855-860，2014.bushbyetal.，lancetneurol.，9(1)：77-93(2010).bushbyetal.，lancetneurol.，9(2)：177-198(2010).campbell&kahl，nature338，259-262，1989.campbellandvillarreal，mol.cellbiol.，8：1993，1988.campereandtilghman，genesanddev.，3：537.1989.campoetal.，nature，303：77，1983.celanderandhaseltine，j.virology，61：269，1987.celanderetal.，j.virology，62：1314，1988.chandleretal.，cell，33：489.1983.changetal.，mol.cell，biol.，9：2153，1989.changetal.，stemcells.，27：1042-1049，2009.chatterjeeetal.，proc.natl.acad.sci，usa，86：9114，1989.chenandokayama，mol.cellbiol.，7：2745-2752，1987，choetal.，nat.biotechnol.31(3)：230-232，2013.choietal.，cell，53：519，1988.ciraketal.，thelancet378，595-605，2011.coffin，in：virology，fieldsetal.(eds)，ravenpress，ny，1437-1500，1990.cohenetal.，j.cell.physiol.，5：75，1987.costaetal.，mol.cell.biol.，8：81，1988.couchetal.，am.rev，resp，dis.，88：394-403，1963.couparetal.，gene，68：1-10，1988.cripeetal.，emboj.，6：3745，1987.culottaandhamer，mol.cell.biol.，9：1376，1989.dandoloetal.，j.virology，47：55-64，1983.devilliersetal.，nature，312(5991)：242-246，1984.deschampsetal.，science，230：1174-1177，1985.dewittetal.，scitranslmed8，360ra134-360ra134，2016.donnellyetal.，j.gen.virol.82，1027-1041，2001.dubenskyetal.，proc，natl，acad.sci.usa，81：7529-7533，1984.edbrookeetal.，mol.cell.biol.，9：1908，1989.edlundetal.，science，230：912-916，1985.ep0273085fechheimeretal.，procnatl.acad.sci.usa，84：8463-8467，1987.fengandholland，nature，334：6178，1988.ferkoletal.，fasebj.，7：1081-1091，1993.firaketal.，mol.cell.biol.，6：3667，1986.foeckingetal.，gene，45(1)：101-105，1986.fonfaraetal.，nature532，517-521，2016.fraleyetal.，procnatl.acad，sci.usa，76：3348-3352，1979franzetal.，cardoscience，5(4)：235-43，1994.friedmann，science，244：1275-1281，1989.fujitaetal.，cell，49：357，1987.ghoshandbachhawat，in：liverdiseases，targeteddiagnosisandtherapyusingspecificreceptorsandligands，wuetal.(eds.)，marceldekker，ny，87-104，1991.ghosh-choudhuryetal.，emboj.，6：1733-1739，1987.gillesetal，cell，33：717，1983.glossetal.，emboj.，6：3735，1987，godboutetal.，mol.cell.biol.，8：1169，1988.gomez-foixetal.，j.biol.chem.，267：25129-25134，1992.goncalvesetal.，molther，19(7)：1331-1341(2011).goodbournandmaniatis，proc.natl.acad.sci.usa.85：1447，1988.goodbournetal.，cell，45：601，1986.gopal，mol.cellbiol.，5：1188-1190，1985.gopal-srivastavaetal.，j.mol.cell.biol.，15(12)：7081-90，1995.grahamandprevec，in：methodsinmolecularbiology：genetransferandexpressionprotocol，murray(ed.)，humanapress，clifton，nj，7：109-128，1991.grahamandvandereb，virology，52：456-467，1973.grahametal.，j.gen.virol.，36：59-72，1977.greeneetal.，immunologytoday.10：272，1989grosschedlandbaltimore，cell.41：885，1985.grunhausandhorwitz，seminarinvirology，3：237-252，1992.harlandandweintraub，j.cellbiol.，101：1094-1099，1985.haslingerandkarin，proc.natl.acad.sci.usa，82：8572，1985.hauberandcullen，j.virology，62：673，1988.henetal，nature，321：249，1986.henseletal.，lymphokineres.，8：347，1989.hermonatandmuzycska，proc，nat′lacad.sci，usa，81：6466-6470，1984.herrandclarke，cell，45：461，1986.hersdorfferetal.，dnacellbiol.，9：713-723，1990.herzandgerard，proc.nat′l.acad.sci.usa90：2812-2816，1993.hirochikaetal.，j.virol.，61：2599，1987.holbrooketal，virology，157：211，1987.hollinger&chamberlain，currentopinioninneurology28，522-527，2015.horlickandbenfield，mol.cell.biol.，9：2396，1989.horwichetal.，j.virol.，64：642-650，1990.hsuetal.，natlbiolechnol.31：827-832，2013huangetal.，cell，27：245，1981.hugetal，mol.cell.biol.，8：3065，1988.hwangetal.，mol.cell.biol.，10：585，1990.imagawaetal.，cell，51：251，1987.imbraandkarin，nature，323：555，1986.imleretal.，mol.cell.biol.，7：2558，1987.imperialeandnevins，mol.cell.biol.，4：875，1984.jakobovitsetal.，mol.cell.biol.，8：2555，1988.jameelandsiddiqui，mol.cell.biol.，6：710，1986.jaynesetal.，mol.cell.biol.，8：62，1988.jineketal.，science337，816-821，2012.johnsonetal.，mol.cell.biol.，9：3393，1989.jonesandshenk，cell，13：181-188，1978.kadeschandberg，mol.cell.biol.，6：2593，1986.kanedaetal.，science，243：375-378，1989.karinetal.，mol.cell，biol.，7：606，1987.karlssonetal.，emboj.，5：2377-2385，1986.katinkaetal.，cell，20：393，1980.katoetal.，jbiolchem.，266(6)：3361-3364，1991.kawamotoetal，mol.cell.biol.，8：267，1988.kellyetal.，j.cellbiol.，129(2)：383-96，1995.kiledjianetal.，mol，cell.biol.，8：145，1988.kimetal.，naturebiotechnology，1-2，2016.kimetal.，naturebiotechnology34，876-881，2016.kimuraetal.，dev.growthdiffer.，39(3)：257-65，1997.klamutetal.，mol.cell.biol.，10：193，1990.kleinetal.，nature，327：70-73，1987.kochetal.，mol，cell.biol.，9：303，1989.krieglerandbotchan，in：eukaryoticviralvectors，gluzman(ed.)，coldspringharbor：coldspringharborlaboratory，ny，1982.krieglerandbotchan，mol.cell.biol.，3：325，1983.kriegleretal.，cell，38：483，1984.kriegleretal.，cell，53：45，1988.kuhletal.，cell，50：1057，1987.kunzetal.，nucl.acidsres.，17：1121，1989.lapointeetal.，hypertension，27(3)：715-22，1996lapointeetal.，j.biol.chem.，263(19)：9075-8，1988.larsenetal.，proc.natl.acad.sci.usa.，83：8283，1986.laspiaetal.，cell，59：283，1989.latimeretal.，mol.cell.biol.，10：760，1990.legallasalleetal.，science，259：988-990，1993.leeetal.，nature，294：228，1981.levinsonetal.，nature，295：79，1982.levreroetal.，gene，101：195-202，1991.linetal.，mol.cell.biol.，10：850，1990.longetal.，science345：1184-1188，2014.longetal.，science351，400-403，2016.pinelloetal.，naturebiotechnol.34，695-697，2016.longetal.，jamaneurol.，3388，2016.longetal.，science351，400-403，2016.luriaetal.，emboj.，6：3307，1987.luskyandbotchan，proc.natl.acad.sci.usa，83：3609，1986.luskyetal.，mol.cell.biol.，3：1108，1983.majorsandvarmus，proc.natl.acad.sci.usa，80：5866，1983.malietal.，science339，823-826，2013a.malietal.，natmethods10，957-963，2013b.malietal.nat.biotechnol.31：833-838，2013c.mannetal.，cell，33：153-159，1983.marescaetal.，genomeresearch23，539-546，2013.markowitzetal.，j.virol.，62：1120-1124，1988.mcnealletal.，gene.76：81，1989.miksiceketal.，cell，46：203，1986，millayetal.，nat.med.14，442-447，2008.mojicaetal，j.mol.evol.60，174-182，2005.mordacqandlinzer，genesanddev.，3：760，1989.moreauetal.，nucl.acidsres.，9：6047，1981.mossetal.，j.genphysiol.，108(6)：473-84，1996.muesingetal.，cell，48：691，1987.nelsonetal.，science351，403-407，2016，nicolasandrubinstein，in：vectors：asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses，rodriguezanddenhardt(eds.)，stoneham：butterworth，494-513，1988.nicolauandsene，biochim.biophys.acta，721：185-190，1982.nicolauetal.，methodsenzymol，149：157-176，1987，ondeketal.，emboj.，6：1017，1987.ornitzetal.，mol，cell.biol.，7：3466，1987.padgett，r.a.，trendsgenet.28，147-154，2012.palmiteretal.，cell，29：701，1982a.palmiteretal.，nature，300：611，1982b.paskindetal.，virology，67：242-248，1975.pechetal.，mol.cell.biol.，9：396，1989.peralesetal.，proc.natl.acad.sci.usa，91(9)：4086-4090，1994.perez-stableandconstantini，mol.cell.biol.，10：1116，1990.picardetal.，nature，307：83，1984.pinkertetal.，genesanddey.，1：268，1987.pontaetal.proc.natl.acad.sci.usa，82：1020，1985.portonetal.，mol.cell.biol，10：1076，1990.potteretal.，procnatl.acad.sci.usa，81：7161-7165，1984.queenandbaltimore，cell，35：741，1983.quinnetal.，mol.cell，biol.，9：4713，1989.racheretal.，biotech，techniques，9：169-174，1995.ragotetal.，nature，361：647-650，1993.ranetal.，nature520，186-191，2015.redondoetal，science，247：1225，1990，reismanandrotter，mol.cell.biol，9：3571，1989.renan，radiother.oncol.，19：197-218，1990，resendezjr，etal.，mol.cell.biol.，8：4579，1988.richetal.，hum.genether.，4：461-476，1993.ridgeway，in：vectors：asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses，stoneham：butterworth，467-492，1988.ripeetal.，mol.cell.biol.，9：2224，1989.rippeetal.，mol.cellbiol.，10：689-695，1990.rittlingetal.，nuc.acidsres.，17：1619，1989.rosenetal.，cell，41：813，1988.rosenfeldetal.，cell，68：143-155，1992.rosenfeldetal.，science，252：431-434，1991.rouxetal.，proc，natl.acad.sci.usa，86：9079-9083，1989.sambrookandrussell，molecularcloning：alaboratorymanual3rded.，coldspringharborlaboratorypress，2001.sakaietal.，genesanddev.，2：1144，1988.satakeetal.，j.virology，62：970，1988.schaffneretal.，j.mol.biol.，201：81，1988.searleetal.，mol，cell.biol.，5：1480，1985.sharpetal.，cell，59：229，1989，shaulandben-levy，emboj.，6：1913，1987.shermanetal.，mol.cell.biol.，9：50，1989.sleighetal.，j.embo，4：3831，1985.shimizu-motohashietal.，amjtranslres8，2471-89，2016.spalholzetal.，cell，42：183，1985.spandauandlee，j.virology，62：427，1988.spandidosandwilkie，emboj.，2：1193，1983.stephensandhentschel，biochem.j.，248：1，1987.stratford-perricaudetandperricaudet，in：humangenetransfer，cohen-haguenauerandboiron(eds.)，johnlibbeyeurotext，france，51-61，1991.stratford-perricaudetetal.，hum.gene.ther.，1：241-256，1990.stuartetal.，nature，317：828，1985.sullivanandpeterlin，mol.cell.biol.，7：3315，1987.swartzendruberandlenman，j.cell.physiology，85：179，1975，tabebordbaretal.，science351，407-411，2016.takebeetal.，mol.cell.biol，8：466，1988.tavernieretal.，nature，301：634，1983.taylorandkingston，mol.cell.biol.，10：165，1990a.taylorandkingston，mol.cell.biol.，10：176，1990b.tayloretal.，jbiol.chem.，264：15160，1989.temin，in：genetransfer，kucherlapati(ed.)，ny，plenumpress，149-188，1986.thiesenetal.，j.virology，62：614，1988.topetal，j.infect.dis，124：155-160，1971.tóthetal.，biologydirect，1-14，2016.troncheetal.，molbiol.med，7：173，1990.trudelandconstantini，genesanddev.6：954，1987.tsaietal.，naturebiotechnology34，882-887，2016.tur-kaspaetal.，mol.cellbiol.，6：716-718，1986.tyndelletal.，nuc.acids.res.，9：6231，1981.vanniceandlevinson，j.virology，62：1305，1988.varmusetal.，cell，25：23-36，1981，vasseuretal.，procnatl.acad.sci.u.s.a.，77：1068，1980.wagneretal.，proc.natl.acad.sci.usa，87(9)：3410-3414，1990.wangandcalame，cell，47：241，1986.wangetal.，cell，153：910-910，2013.weberetal.，cell，36：983，1984.weinbergeretal.mol.cell.biol.，8：988，1984.winotoetal.，cell，59：649，1989.wongetal.，gene，10：87-94，1980，wuandwu，adv.drugdeliveryrev.，12：159-167，1993.wuandwu，biochemistry，27：887-892，1988.wuandwu，j.biol，chem.，262：4429-4432，1987.wuetal.，cellstemcell13，659-662，2013.wuetal.，natbiotechnol32，670-676，2014.xuetal.，molther24，564-569，2016.yamauchi-takiharaetal.，proc.natl.acad.sci.usa，86(10)：3504-3508，1989.yangetal.，proc.natl.acad.sci.usa，87：9568-9572，1990.yinetal.，natbiotechnol32，551-553，2014.yinetal.，physiolrev93，23-67，2013.youngetal.，cellstemcell18，533-540，2016.yutzeyetal.mol.cell.biol.，9：1397，1989.zechneretal.，cellmetabolism12，633-642，2010.zeleninetal.，febslett.，280：94-96，1991.zetscheetal.，cell163，759-771，2015.zioberandkramer，j.bio.chem.，271(37)：22915-22922，1996.当前第1页12当前第1页12