相关申请的交叉引用本申请要求2018年3月2日提交的美国临时专利申请号62/638,010的权益，并且将临时申请的公开内容通过引用并入本文。通过引用并入电子提交的材料同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表通过引用将其全部内容并入本文，并标识如下：于2019年3月1日创建的一个名为“序列表(seqlist)”的104,506字节ascii(文本)文件。本公开涉及基于植物的重组蛋白生产系统及其生产方法和用途。
背景技术：
：：基于植物的重组蛋白生产系统已成为传统哺乳动物和微生物细胞培养系统的有前途的替代品，由于其具有成本低、可扩展性高(scalability)和改善的安全性的独特优势(chen和davis2016；kamarova等人，2010)。案例研究表明，与传统方法相比，有可能大幅度降低资本投资成本和植物制治疗剂的商品成本(tusé等人，2014；nandi等人，2016)。这些系统具有快速安全地生产治疗剂的能力，这在两个成功案例中得到了证明：fda批准了针对戈谢氏(gaucher’s)疾病的酶替代疗法，这成为了第一种植物制治疗剂(zimran等人，2011；fox2012)；以及在2014年埃博拉疫情爆发期间给予的单克隆抗体疗法zmapp，已证明其可以抵抗致命的病毒攻击(lyon等人，2014；qui等人，2014)。已经探索了许多改善在植物中生产蛋白的策略，例如病毒表达系统、亚细胞靶向、农杆菌菌株、表达宿主、启动子、内含子和5'非翻译区(utr)。但是，在很多这些系统中的另一关键成分是基因终止子和周围区域，其尚未进行系统优化。技术实现要素：本公开涉及基于植物的重组蛋白生产系统。一方面，基于植物的重组蛋白生产系统是包含至少一个表达盒的植物表达载体。在一些方面，本公开涉及可以在本文公开的表达盒中使用的3'utr。至少一个表达盒包含5'utr和3'utr，其中3'utr包含第一终止子；以及第二终止子，染色质支架/基质附着区域(mar)，或两者兼有。在一些实施方案中，第一终止子和第二终止子形成双终止子。在一些实施方案中，3′utr还包含mar。在某些方面，mar在双终止子的下游，而在其他方面，mar在第一终止子的下游。在某些实施方式中，双终止子增加了来自表达盒的蛋白表达。在一些实施方案中，第一终止子是无内含子烟草延伸蛋白(extension)终止子(eu)，以及第二终止子选自：本氏烟草(nicotianabenthamiana)肌动蛋白3'utr(nbact3)、番茄丛矮(stunt)病毒rna沉默的p19抑制子(p19)、本氏烟草18.8kdaii类热休克蛋白3'utr(nbhsp)、豆黄矮病毒的短基因间隔区域(sir)、农杆菌胭脂碱合酶3'utr(nos)、花椰菜花叶病毒35s3'utr(35s)、烟草花叶病毒3'utr(tmv)、bdb501(豆矮花叶病毒dnab核穿梭蛋白3'utr、基因间隔区域、运动蛋白的3'末端和运动蛋白序列下游附加的200nt)、烟草坏死病毒d3'utr(tnvd)、豌豆耳突(enation)花叶病毒3'utr(pemv)和大麦黄矮病毒3'utr(bydv)。在某些方面，eu位于第二终止子的上游。在一些实施方案中，当第二终止子是35s时，35s在eu的上游。在一些实施方案中，第一终止子是包含内含子的烟草延伸蛋白终止子(ieu)，以及第二终止子选自：sir，35s和豆黄矮病毒的长基因间隔区域(lir)。在某些方面，ieu在第二终止子的上游。在一些实施方案中，至少一个表达盒包含5'utr和3'utr，其中3'utr包含第一终止子和mar。在某些方面，3'utr包含eu以及mar，其中mar选自：rb7和tm6。在其他方面，3'utr包含ieu和选自以下的mar：rb7和tm6。在某些实施方案中，至少一个表达盒的3'utr包含第一终止子、第二终止子和mar。在一个实施方案中，3’utr包含ieu、35s和rb7，其中ieu在35s的上游。在其他实施方案中，3’utr包含eu。在一方面，这种3’utr包含eu、35s和rb7，其中eu在35s的下游或上游。在另一方面，这种3′utr包含eu、nbact3和rb7，其中eu在nbact3的上游。在另一方面，这种3’utr包含eu、bd501和rb7，其中eu在bd501的上游。在另一方面，这种3′utr包含eu、拟南芥(a.thaliana)热休克蛋白3′utr(athsp)和rb7，其中eu在athsp的下游。在另一方面，这种3’utr包含eu、35s和tm6，其中eu在35s的上游。在另一个实施方案中，植物表达载体包含具有3'utr的表达盒，所述表达盒包含至少一个选自以下的终止子：eu、ieu、nbact3、nbact617(nbact3的下游617-nt区域)、nbact567(nbact3的下游567nt)、pin2、bdb501、bdb282(包含豆矮花叶病毒dnab核穿梭蛋白3'utr的282个核苷酸、基因间隔区域、以及运动蛋白的3’末端)、nbhsp、nbhspb(nbhsp在5’末端缺失75nt)、豆矮花叶病毒rep基因3'utr(rep)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶小亚基3'utr(rbcs)、sir、sir5’/3’(在上游和下游具有附加序列的sir)、sir3'(具有附加的下游病毒序列的sir)、athsp、35s、豆矮花叶病毒repa基因3'utr(repa)、nos、tmv、tnvd、pemv和bydv。在某些方面，3'utr包含至少一个选自以下的终止子：nbact3、nbact617、nbact567、pin2、bdb501、bdb282、nbhsp、nbhspb、rep、rbcs、sir、sir5’/3’、sir3'、athsp和repa。在某些实施方式中，3'utr包含双终止子，其中双终止子是选自以下的两个成员的融合：eu、ieu、nbact3、nbact617、nbact567、pin2、bdb501、bdb282、nbhsp、nbhspb、rep、rbcs、sir、sir5’/3’、sir3'、athsp、35s、repa、nos、tmv、tnvd、pemv和bydv。例如，3'utr包含一个双终止子，其中双终止子是选自以下的两个成员的融合：eu、ieu、nbact3、nbact617、nbact567、pin2、bdb501、bdb282、nbhsp、nbhspb、rep、rbcs、sir、sir5’/3’、sir3'、athsp、35s、repa、nos、tmv、tnvd、pemv和bydv。在某些方面、3'utr包含eu和选自以下的第二终止子：nbact、p19、nbhsp、sir、nos、35s、tmv、bdb501、tnvd、pemv和bydv，其中在某些实施方案中eu在第二终止子的上游。在其他方面，3'utr包含35s和选自以下的第二终止子：nbact3、nos、eu、nbhsp、pin2和bdb501，其中在一些实施方案中，35s位于第二终止子的上游。在一些实施方案中，3′utr包含35s和nos，其中nos在35s的上游。在某些方面，3'utr包含nbhsp和选自以下的第二终止子：nbact3、nos和pin2，其中在某些实施方案中，nbhsp在第二终止子的上游。在植物表达载体的一些实施方式中，3'utr还包含终止子下游的染色质支架/基质附着区域(mar)。在某些实施方案中，mar是rb7或tm6。在一些实施方案中，3′utr包含eu、ieu、athsp、35s、bdb501、nbhsp、nos或nbact3下游的rb7。在其他实施方案中，3’utr包含ieu、35s或nbact3下游的tm6。在某些方面，3'utr在选自以下的双终止子下游包含rb7：35s+nbact3、eu+35s、eu+nbact3、nbhsp+nbact3、35s+eu、athsp+nos、35s+nos、eu+bdb501、athsp+nbhsp、nbhsp+nos、athsp+eu、nbhsp+pin2和ieu+35s。在其他方面，3'utr在选自以下的双终止子下游包含tm6：eu+35s、35s+nos、nbhsp+nos和nbhsp+pin2。本公开还涉及使用前述基于植物的重组蛋白生产系统的方法。在一种实施方式中，将上述载体引入植物或植物部分。在某些方面，植物是烟草或生菜或者来自烟草或生菜的植物部分。在一些实施方式中，使用农杆菌，例如根瘤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)，使载体转化植物或植物部分。附图说明根据某些实施方案，图1a和图1b描绘了本文描述的载体和构建体的示意图。图1a显示编码诺沃克(norwalk)病毒衣壳蛋白(nvcp)、绿色荧光蛋白(gfp)或β-葡萄糖醛酸苷酶(gus)的载体的t-dna区的一般示意图代表。将不同的终止子置于目标基因的下游。如图1a所用，p35s/tev5'是指具有烟草蚀刻病毒5'utr的camv35s启动子。nos是指农杆菌胭脂碱合酶基因3'元件。vsp是指大豆vspb基因3'元件。35s是指camv35s终止子。eu是指无内含子烟草延伸蛋白基因终止子。lb和rb分别指t-dna区域的左边界和右边界。nptii是指编码卡那霉素抗性的nptii基因的表达盒。图1b描述含有在实施例中使用的各种长度的延伸蛋白(ext)终止子(genbank登录号d13951，1-731nt)的构建体。在顶部，垂直的黑条表示推定在近端上游元件(nue)。内含子和聚嘌呤序列(pps)的位置用箭头指示。底部部分显示了在缺失构建体中与gfp基因的下游融合的ext终止子的区域，并与顶部的图谱对齐。括号中的数字表示用于每种构建体的ext终止子的部分。如在图1b以及图2a-图9b中所用(除非另有说明)，ieu是指包含内含子的ext终止子的部分，而eu是指缺少内含子的ext终止子的部分。根据某些实施方案，图2a和图2b描绘了具有ext或nos终止子的ext内含子(nt24-249)对基因表达的影响。图2a显示三个独立浸润的样本通过荧光分析来测定的gfp表达，并通过bradford分析测量的总可溶性蛋白进行标准化。图2b显示从六个独立样本中通过elisa测量nvcp表达。白色或实心条分别代表具有或没有内含子的构建体。所示数据为平均值±s.d。p值由学生t检验确定。根据某些实施方案，图3a-图3c显示ext终止子增加了本氏烟草叶片中的瞬时转基因表达。图3a描绘了使用不同终止子对来自构建体的gfp表达的荧光分析。通过分光荧光分析法分析浸润的叶提取物，并通过bradford分析测量的总可溶性蛋白将其标准化。插入的图片是gfp表达的示范性可视化。在b-100ap灯(uvp)产生的uv照射(365nm)下，在浸润后2天(dpi)后检查浸润的叶片。图3b显示了来自具有不同终止子的构建体的nvcp表达。图3c显示使用不同终止子的构建体的gus表达。所示数据为来自六个独立浸润样本的平均值±s.d。根据某些实施方案，图4a和图4b显示ext终止子增加了mrna的积累。图4a和图4b分别描述了gfp和nvcp的相对mrna积累。对于每个目标转录本，一式三份地测量每个样本。延伸因子(ef1a)转录本用作内部对照。使用单独的标准曲线定量gfp、nvcp和ef1a的转录水平，然后将gfp和nvcp的mrna拷贝数针对于ef1a的mrna拷贝数进行标准化。所示数据来自三个独立浸润样本的平均值±s.d。根据某些实施方案，图5a-图5c显示了ext终止子是转录终止的高效介质。图5a描绘了该研究中使用的构建体的t-dna区域的部分。农杆菌胭脂碱合酶基因3’元件(nos)或ext终止子(在图5a-图5c表示为eu)位于gfp或nvcp基因的下游。rb是指t-dna区域的右边界。水平箭头表示用于通过rt-pcr进行转录通读检测的引物区域。使用具有gfp基因(图5b)或nvcp基因(图5c)的构建体，对rt-pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳以检查转录通读。说明模板类型。野生型叶片样本的cdna和h2o用于阴性(-)对照。基因特异性正向引物与结合到终止子下游不同区域的不同反义(reversesense)引物一起使用，如图5a上部左侧所示。为了检查rna的质量，使用gfp(图5b)或nvcp(图5c)和ef1a(图5b和图5c)的引物组对相同rna样本进行了rt-pcr。图6鉴定了ext终止子的poly(a)位点。对来自构建体pps-ogfpeu的rna样本进行脱帽、环化、逆转录、pcr扩增、克隆和测序。显示了无内含子的ext3’utr的cdna序列(seqidno.6除了一对外源(extraneous)序列中的两段核苷酸外，别无它物)。推定的nue用下划线和粗体表示。ext终止子中的聚嘌呤序列(pps)以灰色显示。文本“pa”用于表示聚腺苷酸化ya二核苷酸，其后括号中是测序克隆的编号。根据某些实施方案，图7显示ext终止子中缺失对基因表达的影响。将修饰的终止子放置在gfp基因下游。在3dpi时收获农杆菌浸润的本氏烟草叶片，并通过sds-page分析提取物，随后在uv照射(365nm)以及考马斯染色下观察。使用imagej软件定量gfp条带强度，使用天然植物蛋白作为上样对照。所示数据为三个独立浸润叶片的平均值±标准误差。用构建体peu浸润所有叶片，作为叶片和植物变化的内部对照。根据某些实施方案，图8a和图8b示出pps的缺失或取代对ext终止子功能的影响。图8a描绘了在pps测试构建体中使用的ext终止子区域的图表。将修饰的终止子放置在gfp基因的下游。推定的nue和pps的位置分别用竖线和箭头表示。删除(peud)的区域或取代(peus)区域分别用不连续的线或虚线表示。图8b描述与参考构建体pnos相关的gfp表达。将测试构建体与参考构建体pnos并排浸润，并通过分光荧光法分析叶片提取物。将荧光分析得到的值转换为μggfp/mgtsp，然后针对pnos的gfp表达进行标准化(用虚线表示)。星号表示与peu相比在gfp表达上在统计学上显著降低(学生t检验，p<0.05)。peu的绝对平均值为112.3μggfp/mgtsp。所示数据为来自四到五个独立浸润样本的平均值±s.d。根据某些实施方案，图9a和图9b显示了ext终止子在除本氏烟草之外的植物中具有强活性。将包含含有内含子或不含有内含子的ext终止子的gfp构建体进行农杆菌浸润到生菜(图9a)或烟草(图9b)的叶片中。在4dpi时，收获叶片组织，并通过sds-page分析蛋白提取物，然后在uv照射(365nm)下以及通过考马斯染色观察。使用imagej软件定量gfp条带强度，使用天然植物蛋白作为上样对照。所示数据为三个独立浸润叶片的平均值±标准误差。用构建体peu浸润所有叶片，作为叶片和植物变化的内部对照。根据某些实施方案，图10a和图10b显示了各种3'utr对gfp生产的评估。图10a描绘了本研究中使用的载体的t-dna区域的一般示意图。rb和lb分别是指t-dna区域的右边界和左边界。nptii指卡那霉素抗性盒。p35s是指来自花椰菜花叶病毒的35s启动子。tmv是指来自烟草花叶病毒的5'utr。3'utr是单一终止子、双终止子、基质附着区域或每个实验所述的这些元件的组合。图10b描述了含有插入到gfp基因下游的各种3′utr的非复制载体的相对gfp生产。将非复制载体通过农杆菌浸润到本氏烟草的叶片中。在5dpi时在紫外线照射(365nm)下对叶片进行拍照。插入的照片描绘代表性的浸润叶片。在4-5dpi之间收获农杆菌浸润的叶片，并通过sds-page分析提取物，然后在uv照射(365nm)和考马斯染色下观察。使用imagej软件定量gfp条带强度，使用天然植物蛋白条带作为上样对照。所示数据为3-4个独立浸润叶片的平均值±标准误差。eu指无内含子烟草延伸蛋白3’utr。如图10b-图17b所示，ieu是指含内含子的烟草延伸蛋白3'utr；nbact3是指本氏烟草肌动蛋白3'utr；nbhsp是指本氏烟草18.8kda的ii类热休克蛋白3’utr；pinii是指马铃薯蛋白酶抑制子ii3'utr；rbcs是指豌豆二磷酸核酮糖羧化酶小亚基3'utr；sir是指豆黄矮病毒的短基因间隔区域，其中sir5'/3'包含附加的上游和下游序列，而sir3'仅包含附加下游序列。bdb是指豆矮花叶病毒dnab核穿梭蛋白3’utr；rep是指豆矮花叶病毒rep基因3’utr；repa是指豆矮花叶病毒repa基因3’utr；athsp是指拟南芥热休克蛋白3'utr；35s是指花椰菜花叶病毒35s3'utr；nos是指农杆菌胭脂碱合酶3'utr。根据一些实施方案，图11显示双终止子强烈增强gfp基因表达。将含有gfp基因下游不同双终止子的非复制载体进行农杆菌浸润到本氏烟草叶片中，并在5dpi时分析gfp生产。实心条表示双终止子。所示数据为3-4个独立浸润叶片的平均值±标准误差。缩写所指与图10b中那些相同。bydv是指大麦黄矮病毒3’utr。pemv是指豌豆耳突花叶病毒3’utr。如图11所示，tnvd是指烟草坏死病毒-d3'utr；tmv是指烟草花叶病毒3'utr；以及lir是指豆黄矮病毒的长基因间隔区域。根据一些实施方案，图12显示染色质支架/基质附着区域(mar)强烈增强gfp表达。将含有在基因终止子3’插入烟草rb7或烟草tm6mar序列的非复制gfp载体进行农杆菌浸润到本氏烟草的叶片中，并在5dpi时评估gfp生产。所示数据为3-4个独立浸润叶片的平均值±标准误差。“eu+对照”表示从norwalk病毒衣壳蛋白编码序列的反向区域获得的dna序列已插入eu基因终止子的3'处，取代rb7mar。根据一些实施方案，图13显示组合的3'utr强烈增强gfp表达。创建具有组合终止子的非复制gfp载体，将其农杆菌浸润到本氏烟草叶片中，并在5dpi时评估gfp生产。所示数据为3-4个独立浸润叶片的平均值±标准误差。白色条表示与rb7mar组合的双终止子；灰色条表示与tm6mar组合的双终止子；黑条表示与rb7mar组合的单个终止子。根据一些实施方案，图14a和图14b显示了复制载体中各种组合的3′utr对gfp表达的评估。使用各种组合的3'侧翼区域来构建含有豆黄矮病毒元件的复制载体(diamos等人，2016)，农杆菌浸润到本氏烟草的叶片中，并评估了gfp生产。图14a显示了3-4个独立浸润的叶片的平均相对gfp表达±标准误差。“(r)”表示复制的双子病毒载体。图14b描绘使用所示构建体的gfp表达的sds-page凝胶。rbcl是指二磷酸核酮糖羧化酶的大亚基。根据一些实施方案，图15比较了所识别的3'utr的相对dsr生产。将单一、双个或含mar的终止子构建到dsred基因下游成为非复制载体，并将其农杆菌浸润到本氏烟草的叶片中。在5dpi时，通过sds-page和uv荧光来评估dsred生产。所示数据为3-4个独立浸润叶片的平均值±标准误差。根据一些实施方案，图16a和图16b比较了烟草和生菜中各种3′utr的gfp表达。将单一、双个或含mar的终止子构建到gfp基因下游成为非复制载体，以及将其农杆菌浸润到烟草(图16a)或生菜(图16b)植物的叶片中。在5dpi时，通过uv荧光和sds-page评估gfp生产。所示数据为3-4个独立浸润叶片的平均值±标准误差。图17a和图17b表征rb7和tm6mar。图17a描绘了用含有烟草rb7或烟草tm6mar序列的非复制gfp载体进行农杆菌浸润的叶片的照片。这些照片是在uv照射(365nm)下在5dpi拍摄的。在图17a中，“no3’元件”是指不包含终止子或mar的载体；“仅rb7”是指仅含有无终止子的rb7mar的载体；“5'rb7”是指包含在启动子5'处插入的rb7mar的载体；“3’rb7”、“rb7”、或“tm6”表示在载体中在基因终止子的3’插入了mar。图17b描述了rb7mar的缺失突变体的示意图。通过sds-page使用imagej以定量条带强度来测量gfp表达。与缺少rb7mar的终止子eu相比，给出相对表达。图18a-图18d显示双终止子增强了源自豆黄矮病毒的复制载体中的vlp表达。图18a描述了源自豆黄矮病毒的复制载体的一般示意图。图18a中使用的缩写是指农杆菌的左和右t-dna边界为rb和lb；来自农杆菌的胭脂碱合酶3′utr为nos3′；来自番茄丛矮病毒的rna沉默的p19抑制子为p19；来自花椰菜花叶病毒的35s启动子为p35s；来自豆黄矮病毒的长基因间隔区域为lir；来自本氏烟草psak基因的5'utr为nbpsak5'；每个实验中指示的靶基因为vlp；每个实验中指示的各种单一或双个终止子为t1/t2；来自烟草rb7基因的基质附着区域为rb7mar；来自豆黄矮病毒的短基因间隔区域为sir；以及豆黄矮病毒rep/repa为rep/repa基因。图18b和图18d分别描绘使用源自豆黄矮病毒的复制载体通过农杆菌浸润到本氏烟草叶片中，测量gii.4诺如病毒(b)或gi诺如病毒(d)衣壳生产的elisa结果。以植物生产的gi或gii诺如病毒衣壳为标准。所示数据为源自三个独立浸润样本的平均值±标准偏差。与未经修饰的载体相比，通过学生t检验，两个星号(**)表示p<0.05，以及三个星号(***)表示p<0.01。图18c显示了在添加或不添加0.1％tritonx-100去污剂(triton)的情况下，双终止子构建体的还原sds凝胶western印迹。探针是多克隆兔抗gii。图18b-图18c中使用的缩写是指含内含子的烟草延伸蛋白终止子为ieu；ieu与花椰菜花叶病毒的35s终止子融合为ieu-35s；无内含子烟草延伸蛋白终止子，与本氏烟草中推定的act3样终止子融合为eu-nbact3；35s终止子与nbact3终止子融合为35s-nbact3。图19-图21描绘了三个示例性质粒的示意图，所述质粒在其表达盒中包含含有双终止子和mar的3′utr。图19描绘了14115bp质粒(pbyr2eak2mc-gfp，序列如seqidno.115所示)的示意图，其在表达盒的3'区域中包含融合在nbact3上游的eu双终止子以及在该双终止子下游的rb7mar。图20描述了17111bp的质粒(pby11ha-gfp，序列如seqidno.116所示)的示意图，其包含两个表达盒。上游表达盒在3’区域中包含融合在nbhsp上游的eu双终止子(在图中显示为hsp203’)以及在双终止子下游的rb7mar。下游表达盒在3’区域中包含融合在nbact3上游的eu双终止子以及该双终止子下游的rb7mar。图21描述了19330bp的质粒(pby！11-h6d8m2，序列如seqidno.117所示)的示意图，其包含修饰的mab的表达盒，其中上游盒编码与流感抗原m2e融合的重链，第二盒编码相应的轻链。上游表达盒的3′区域包含在nbact3上游融合的eu双终止子以及在该双终止子下游的rb7mar。下游表达盒的3′区域包含在nbhsp上游融合的eu双终止子(在图中显示为hsp203′)和在双终止子下游的rb7mar。图22a-图22b描绘了图19-图21的质粒的表达结果。图22a显示了从用图21质粒浸润的叶片中产生的总可溶性蛋白的相对百分比，所述质粒是由两个表达盒编码的修饰抗体。虽然典型的提取方案似乎并未在总可溶性蛋白中产生大量抗体，但是组合使用尿素和tritonx-100导致总可溶性蛋白中40％以上是在质粒中编码的修饰抗体。图22b描绘了与图22a的结果相对应的示例性凝胶。图22c将由图19的质粒与含有单一终止子(pbyr2ek2mc-gfp，在图中标记为2ek2mc)的质粒产生的荧光进行比较，这显示双终止子构建体(pbyr2eak2mc-gfp，在图中标记为2eak2mc)比单一终止子构建体产生更亮荧光。具体实施方式在以下附图和该技术的详细描述中描述了本公开的详细方面和应用。除非特别指出，否则旨在将说明书和权利要求书中的词语和短语赋予适用领域的普通技术人员平常的、普通的和惯常的含义。在以下描述中，并且出于解释的目的，阐述了许多具体细节以便提供对本公开的各个方面的透彻理解。然而，相关领域的技术人员将理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践本文公开技术的实施方案。应当注意的是，公开的技术可以应用到许多不同的和可替代的配置、设备和技术。本文公开的技术的全部范围不限于以下描述的实施例。除非上下文另外明确指出，单数形式的“一”，“一个”和“该”包括复数对象。因此，例如，提及“一个步骤”包括提及一个或多个这样的步骤。如本文所用，术语“表达盒”是指载体dna的独特组成部分，其包含要被转染的细胞表达的基因序列和调控序列。表达盒包含三个组成部分：启动子序列(5'非翻译区的一部分，5'utr)、开放阅读框和3'非翻译区(3'utr)。在某些方面，调控序列存在于5'utr和3'utr中。如本文所用，术语“终止子”是指引起rna聚合酶从dna解离并因此终止dna转录成mrna的dna序列。因此，尽管该术语涵盖已知基因的终止子序列，但该术语还涵盖执行相同功能的其他序列，例如，豆黄矮病毒的短基因间隔区域周围的序列。本公开涉及3'非翻译区(utr)，其在编码蛋白的表达盒中增加了该蛋白的表达水平，在植物中用于重组蛋白生产的载体，其利用本文公开的3'utr的其表达盒中至少一个。在某些方面，植物表达载体是复制载体，例如双子病毒(geminivirus)载体。在其他方面，植物表达载体是非复制载体。本文所述的植物表达载体包含至少一个表达盒，其中表达盒的3'utr包含单终止子或双终止子。如本文所用，单终止子是指包含一组终止子序列的终止子元件。如本文所用，双终止子是指包含一组终止子序列与另一组终止子序列融合的终止子元件。在一些方面，表达盒还包含染色质支架/基质附着区域(mar)。mar位于双终止子的单终止子的下游。与在过去30年中采用最广泛使用的终止子的载体相比，本文所述的载体导致蛋白生产的增加(例如，由报告基因gfp确定)；其中所述采用最广泛使用的终止子的载体包含来自根瘤农杆菌的胭脂碱合酶(nos)和章鱼碱合酶(ocs)终止子、来自花椰菜花叶病毒的35s终止子(macfarlane等人，1992；ellis等人，1987；pietrzak等人，1986)、以及大豆营养贮藏蛋白(vsp)的终止子)。在一些实施方案中，重组蛋白生产的增加大于5倍、7倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、100倍或150倍。在一些方面，增加的重组蛋白生产是由于转录本的稳定性增加。在多种植物(包括，例如，烟草和生菜)中以及在多种重组蛋白中，可见本文描述的载体的益处。提供增强的重组蛋白生产的3'utr区域是延伸蛋白3'utr(在本文中也称为延伸蛋白终止子)、本氏烟草肌动蛋白3'utr(nbact3)、马铃薯蛋白酶抑制子ii3'utr(pin2)、豆矮花叶病毒dnab核穿梭蛋白3'utr(bdb)、本氏烟草18.8kdaii类热休克蛋白3'utr(nbhsp)、豆矮花叶病毒rep基因3'utr(rep)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶小亚基3'utr(rbcs)、豆黄矮病毒短基因间隔区域(sir)、拟南芥热休克蛋白3'utr(athsp)、花椰菜花叶病毒35s3'utr(35s)、豆矮花叶病毒repa基因3’utr(repa)和农杆菌胭脂碱合酶3’utr(nos)。这些3’utr的序列是本领域众所周知的。在一些实施方案中，用于合成本文描述的载体的这些3'utr的寡核苷酸序列是通过实施例中描述的方法产生的。在某些方面，延伸蛋白终止子的核酸序列选自以下的延伸蛋白基因的终止子序列：红花烟草(nicotianatabacum)、茸毛烟草(nicotianatomentosiformis)、梅花烟草(nicotianaplumbaginifolia)、薄壁烟草(nicotinanaattenuata)、美花烟草(nicotinanasylvestris)、本氏烟草(nicotianabenthamiana)、马铃薯(solanumtuberosum)、番茄(solanumlycopersicum)、潘娜丽番茄(solanumpennellii)、辣椒(capsicumannuum)和拟南芥，其序列可从genbank或solgenomicsnetwork确定。延伸蛋白终止子的核酸序列包含聚嘌呤序列、非典型的近端上游元件(nue)、替代的polya位点、远端上游元件(fue)样区域，主要的nue和主要的polya区域，以及在某些实施方案中，核酸序列具有与红花烟草(n.tabacum)延伸蛋白终止子的序列至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％的同一性。在一些实施方案中，延伸蛋白终止子的核酸序列是烟草延伸蛋白基因的核酸序列。在某些实施方案中，所公开的载体中的延伸蛋白3’utr的部分缺少内含子。在一个特定的实施方案中，载体的3’utr区包含无内含子烟草延伸蛋白终止子(eu)。因此，在一些方面，eu的核酸序列跨越用于延伸蛋白的完整烟草基因的nt2764-3126(genbankd13951.1)。在某些其他实施方案中，公开的载体包含含有内含子的延伸蛋白终止子。因此，在某些方面，载体的3'utr区域包含含有内含子的烟草延伸蛋白终止子(ieu)。在这样的实施方案中，ieu的核酸序列跨过用于延伸蛋白的完整烟草基因的nt2396-3126(genbankd13951.1)。在一些方面，nbact3的核酸序列包含肌动蛋白基因的nt1460-1853(基因idniben101scf00096g04015.l)。在一些方面，nbact3的核酸序列包含seqidno.8所示序列的nt33-1023。在某些方面，本氏烟草肌动蛋白3'utr并不是3'utr的全部，而只是nbact3(nbact617)的下游617-nt区域。在这样的实施方案中，nbact617的核酸序列包含seqidno.8所示序列的nt606-1023。在其他方面，本氏烟草肌动蛋白3'utr并不是3'utr的全部，而只是nbact3(nbact567)的下游567-nt区域。在一些实施方案中，pin2的核酸序列跨越马铃薯蛋白酶抑制子ii基因的nt1507-1914(genbank：x04118.1)。在一些方面，pinii的序列从phb114(richter等人，2000)通过saci-ecori消化获得。在一些实施方案中，bdb的核酸序列包含核穿梭蛋白的3’末端、基因间隔区域、运动蛋白的3’末端和运动蛋白序列下游附加的200nt(bdb501)，其跨越豆矮花叶病毒片段dna-b的nt1213-1713(genbank：m88180.1)。在一些实施方案中，bdb的核酸序列仅包含282个核苷酸，其包含核穿梭蛋白的3’末端、基因间隔区域和运动蛋白的3’末端(bdb282)。在一些实施方案中，nbhsp的核酸序列包含geneidniben101scf04040的序列的nt988867-989307的互补序列。在一些方面，nbhsp的核酸序列跨越seqidno.7所示序列的nt33-424、nt33-447、nt33-421、nt33-453、nt45-424、nt45-447、nt45-421或nt45-453。在一个实施方案中，跨越seqidno.7所示序列的nt45-421的核酸序列是nbhsp。在实施方案中，nbhspb的核酸序列包含与geneidniben101scf04040的序列的nt988942-989307的互补。在一些方面，跨越seqidno.7所示序列的nt45-372的核酸序列是nbhspb。在一些实施方案中，rep的核酸序列包含与豆黄矮病毒推定基因v1、v2、cl、cl：c2的nt859-1522(genbank：y11023.2)的互补序列具有至少95％、优选99％的序列同一性的序列。在一些方面，rep的序列在seqidno.14所示。在一些实施方案中，rbcs的核酸序列包含与跨越瞬时基因表达载体pucpma-m24的nt6-648序列(genbank：kt388099.1)互补的序列。在一些方面，rbcs的序列是从prtl2-gus(carrington等人，1999)通过saci-ecori消化获得的。在一些实施方案中，3'utr包含sir，具有其附加下游病毒序列的sir(sir3')或在上游和下游具有附加序列的sir(sir5’/3’)。在某些方面，sir5’/3’的核酸序列包含与豆黄矮病毒推定基因v1、v2、c1、c1：c2的nt730-1966(genbank：y11023.2)具有至少95％、优选99％的序列同一性的序列。在一些实施方案中，sir5’/3’的序列如seqidno.11所示。在一些方面，sir3'的核酸序列包含与豆黄矮病毒推定基因v1、v2、c1、c1：c2的nt1155-1966(genbank:y11023.2)具有至少95％，优选99％的序列同一性的序列。在一些实施方案中，sir3’的序列如seqidno.10的nt7-818所示。在一些方面，sir的核酸序列包含豆黄矮病毒推定基因v1、v2、c1、c1：c2的nt1122-1326(genbank：y11023.2)。在一些实施方案中，sir的核酸序列如seqidno.9的nt4-208所示。在一些实施方案中，athsp的核酸序列包含拟南芥热休克蛋白18.3基因的部分序列的nt1-250(genbankkp008108.1)。在一些方面，athsp的核酸序列跨越seqidno.13的nt7-257。在一些实施方案中，35s的核酸序列包含跨越植物转化载体psiteii-8c1(genbank：gu734659.1)nt3511-3722的序列。在一些方面，35s的序列如seqidno.2的nt7-218中所示。在一些方面，35s的序列是使用引物35stm-1(seqidno.26)和35stm-2(seqidno.27)扩增prtl2-gus的序列(carrington等人，1991)。在一些实施方案中，repa的核酸序列包含与豆黄矮病毒推定基因v1、v2、cl、cl：c2的nt859-1311(genbank：y11023.2)的互补序列。在一些方面，repa的核酸序列如seqidno.15的nt6-458所示。在一些实施方案中，nos的核酸序列包含克隆载体pslj83l3的t-dna区域的nt22206-22271(genbank：y18556.1)。在一些方面，nos的序列是从phb103(richter等人，2000)通过saci-ecori消化获得片段的序列。在一些方面，nos的核酸序列如seqidno.1的nt6-261所示。在一些实施方案中，3'utr区包含选自以下的至少一个成员：eu、ieu、nbact3、nbact617、nbact567、pin2、bdb501、bdb282、nbhsp、nbhspb、rep、rbcs、sir、sir5’/3’、sir3’、athsp、35s、repa和nos。在某些实施方案中，载体的3’utr区域由选自以下的终止子组成：eu、nbact3、pin2、bdb501、nbhsp、rep、rbcs、nbact617、sir5’/3’、nbact567、nbhspb和athsp。在某些实施方案中，载体3'utr区域由选自以下的终止子组成：eu、nbact3、pin2、bdb501、nbhsp、rep和rbcs。在某些方面，3'utr包含两个终止子，其产生双终止子。双终止子可以是相同终止子的重复，也可以是不同终止子的组合(例如，两个不同终止子的融合)。在一些实施方案中，双终止子由eu和nbact、p19、nbhsp、sir、nos、35s、烟草花叶病毒3'utr(tmv)、bdb501、烟草坏死病毒-d3'utr(tnvd)、豌豆耳突花叶病毒3'utr(pemv)或大麦黄矮病毒3'utr(bydv)组成。在一些方面，将前述的一对终止子布置为其中eu放置在另一个终止子的上游的位置，其表示为eu+nbact、eu+p19、eu+nbhsp、eu+sir、eu+nos、eu+35s、eu+tmv、eu+bdb501、eu+tnvd、eu+pemv或eu+bydv。在一些实施方案中，双终止子由35s和nbact3、nos、eu、nbhsp、pin2或bdb501组成。在一些方面，将前述的一对终止子布置为其中35s布置在另一个终止子的上游，其表示为35s+nbact3、35s+nos、35s+eu、35s+nbhsp、35s+pin2或35s+bdb501。在一些实施方案中，双终止子由ieu和sir，35s或来自豆黄矮病毒的长基因间隔区域(lir)组成。在一些方面，将上述一对终止子布置成其中ieu放置在另一终止子的上游，其表示为ieu+sir、ieu+35s或ieu+lir。在一些实施方案中，双终止子由nbhsp和nbact3、nos或pin2组成。在一些方面，将前述的一对终止子布置为其中nbhsp放置在另一终止子的上游，其表示为nbhsp+nbact3、nbhsp+nos或nbhsp+pin2。在一些实施方案中，双终止子由具有nos和35s组成，其中nos放置在35s的上游(nos+35s)。如本文所用，术语“p19”是指rnai沉默的p19抑制子。包含p19的示例性载体主链是peaq-ht(参见sainsbury等人，2009)。根据某些实施方案，tmv的核酸序列跨越烟草花叶病毒分离株tmv-jgl衣壳蛋白基因的nt489-693(genbank：kj624633.1)。在一些方面，tmv的核酸序列如seqidno.21的nt7-211所示。根据某些实施方案，tnvd的核酸序列与跨越烟草坏死病毒d基因组rna的完整基因组nt3457-3673的序列(genebank:d00942.1)具有至少85％的同一性、优选87％的同一性。在其他实施方案中，tnvd的核酸序列与烟草坏死病毒-d基因组的nt3460-3673(genbank：u62546.1)具有至少90％、优选93％的序列同一性。在一些实施方案中，tnvd的核酸序列包含seqidno.19的nt29-222所示序列。根据某些实施方案，pemv的核酸序列与豌豆耳突花叶病毒2株ukrna依赖性rna聚合酶、假设(hypothetical)蛋白、韧皮部rna运动蛋白和细胞间rna运动蛋白基因的nt3550-4250(genbank：ay714213.1)具有至少95％，优选98％的序列同一性。在一些方面，pemv的核酸序列如seqidno.20的nt1-703中所示。根据某些实施方案，bydv的核酸序列与大麦黄矮病毒-pav基因组rna的nt4807-5677具有至少95％，优选99％的序列同一性(genbank：x07653.1)。在一些方面，bydv的核酸序列如seqidno.18的nt5-875所示。在另一个实施方案中，在含有至少一个终止子的区域下游，载体进一步包含染色质支架/基质附着区域(mar)。在一个优选的实施方案中，mar是rb7mar(genbank：u67619.1)或tm6增强子区域(genbank：kc5555564.1)。如本文所用，术语“rb7”是指包含genbankidu67619.l的序列或者seqidno.16的nt7-1174所示序列的序列。如本文所用，术语“tm6”是指包含genbankidkc5555564.1的序列或seqidno.17的nt10-1202所示序列的序列。因此，在一些实施方式中，载体包含终止子eu与rb7的组合、终止子ieu与rb7或tm6、终止子athsp与rb7、终止子35s和rb7或tm6、终止子bdb501和rb7、终止子nbhsp和rb7、终止子nos和rb7、或终止子nbact3和rb7或tm6的组合。在某些实施方案中，载体包含双终止子和mar，其中mar在双终止子的下游。在某些实施方式中，mar为rb7并且位于双终止子35s+nbact3、eu+35s、eu+nbact3、nbhsp+nbact3、35s+eu、athsp+nos、35s+nos、eu+bdb501、athsp+nbhsp、nbhsp+nos、athsp+eu、nbhsp+pin2或ieu+35s的下游。在其他实施方式中，mar为tm6，它位于双终止子eu+35s、35s+nos、nbhsp+nos或nbhsp+pin2的下游。本公开还涉及用于产生公开的载体的寡核苷酸。seqidno.l-2l提供了用于将上述3′utr并入载体的核酸序列。用于并入nos的模板的核酸序列如seqidno.1所示。用于并入35s的模板的核酸序列如seqidno.2所示。用于并入pinii的模板的核酸序列如seqidno.3所示。rbcs的模板的核酸序列如seqidno.4所示。用于并入ieu的模板的核酸序列如seqidno.5所示。用于并入eu的模板的核酸序列如seqidno.6所示。用于并入nbhsp的模板的核酸序列如seqidno.7所示。用于并入nbact3的模板的核酸序列如seqidno.8所示。用于并入sir的模板的核酸序列如seqidno.9所示。用于并入sir3’的模板的核酸序列如seqidno.10所示。用于并入sir5’/3’的模板的核酸序列如seqidno.11所示。用于并入bdb501的模板的核酸序列如seqidno.12所示。用于并入athsp的模板的核酸序列如seqidno.13所示。用于并入rep的模板的核酸序列如seqidno.14所示。用于并入repa的模板的核酸序列如seqidno.15所示。用于并入rb7mar的模板的核酸序列如seqidno.16所示。用于并入tm6mar的模板的核酸序列如seqidno.17所示。用于并入大麦黄矮病毒(bydv的)3’utr的模板的核酸序列如seqidno.18所示。用于并入tnvd3′utr的模板的核酸序列如seqidno.19所示。用于并入pemv3’utr的模板的核酸序列如seqidno.20所示。用于并入烟草花叶病毒3’utr的模板的核酸序列如seqidno.21所示。本公开还涉及在植物或植物部分中生产重组蛋白的方法。在一些方面，与现有技术的方法相比，该方法生产至少5倍、7倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍或40倍产量的重组蛋白。该方法包括将上述载体引入植物或植物部分。在一些实施方式中，通过本公开的载体，使用农杆菌，例如根瘤农杆菌，或更具体地说，根瘤农杆菌gv3101，转化植物或植物部分。一方面，通过本公开的载体使用农杆菌浸润来转化植物或植物部分。在一种实施方式中，植物是烟草或西红柿，而植物部分来自烟草植物或西红柿植物。根据某些实施方案的说明性、而非限制性实施例通过以下实施例进一步说明本公开，这些实施例不应理解为限制性的。在整个申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图，出于其全部目的通过引用整体并入本文。1.烟草延伸蛋白(ext)终止子a.ext内含子对基因表达的影响ext终止子由746nt组成，并且在nt24和249之间包含一个内含子。为了表征含有内含子和不含有内含子的ext终止子的活性，将不同形式克隆到农杆菌t-dna载体中。生成了含有内含子的ext终止子构建体(图1b)：从烟草基因组dna使用pcr扩增了nt1-731或nt1-464的ext终止子片段(包含内含子序列(nt24-249))，并与gfp基因融合，并在花椰菜花叶病毒的35s强启动子控制下(分别为pieu或pieu2)。使用nt252-731或252-464，创建了缺失内含子的类似构建体(分别为peu或peu2)。然后通过农杆菌介导的本氏烟草叶片中的瞬时表达比较这些构建体。与含内含子的构建体pieu和pieu2相比，无内含子的构建体peu和peu2显示出明显更高的gfp表达水平(约3倍，图2a)。为了测试去除ext内含子的作用是否是基因特异性的，将gfp基因替换为nvcp基因。nvcp是一种针对诺沃克(norwalk)病毒感染起保护作用的候选疫苗抗原，其中诺沃克病毒感染可引起人类流行性急性胃肠炎。含内含子的构建体(pieu或pieu2)的nvcp表达，也比无内含子的构建体(peu或peu2)的nvcp表达低(保留了约29-75％的活性，图2b)，尽管内含子的抑制作用的大小对于pieu来说效果不佳。对于具有gfp或nvcp基因的含内含子的构建体，通过rt-pcr证实了有效的剪接，因为在溴化乙锭染色琼脂糖凝胶电泳中未发现可检测的未剪接产物。内含子还大大降低了dsred的表达。为了确定内含子的抑制作用是否是物种特异性的，将peu和pieu农杆菌浸润到烟草和生菜叶片中。与我们通过本氏烟草获得的结果一致，内含子的存在大大降低了两个物种的基因表达，在生菜中保留了34％的活性，在烟草中保留了14％的活性(图9)。这些数据表明，与先前报道的插入3'utr的内含子的发现一致(kertész2006)，ext内含子可能会对基因表达产生有害影响。但是，我们不能排除这种影响是由于将23nt(内含子上游1-23nt)并入含内含子的构建体的可能性。据报道，内含子插入的作用以内容(context)依赖的方式改变(kertész2006)。还在nos终止子的情况下测试了ext内含子的作用：将pcr扩增的ext内含子(1-251nt)融合到nos终止子的5'末端，前面是gfp或nvcp基因。出乎意料的是，将ext内含子添加到nos终止子中导致gfp或nvcp表达分别略有增加但统计上不显著的增加，分别为51％和34％(图2a和图2b，pnos与pinos)。综上所述，这些数据表明ext内含子对瞬时转基因表达具有内容依赖的影响。b.ext终止子增加瞬时转基因表达与其他广泛使用的终止子，包括nos、camv35s和大豆营养贮藏蛋白(vsp)相比，我们评估了烟草ext终止子对瞬时转基因表达的影响。为这种比较，我们将无内含子的ext终止子(nt252-731)和其他终止子放置在gfp基因的下游，由camv35s启动子和烟草蚀刻病毒(tev)5'utr驱动(图1a)。通过农杆菌浸润将所得的构建体引入本氏烟草叶中，并分析在2dpi时gfp表达的水平。表达高峰在2-3dpi之间并在此后下降，可能由于基因沉默(数据未显示)。ext构建体(peu)产生最高gfp表达水平，分别比使用nos、vsp和35s构建体(pnos、pvsp和p35s)的gfp表达水平高13.5倍、11.9倍和2.8倍(图3a)。为了测试无内含子的ext终止子的增强效果是否是基因特异性的，我们将gfp基因替换为nvcp基因，以及比较nvcp表达的水平。使用nvcp的结果与使用gfp的结果相似，表明ext终止子增强的转基因表达不是基因特异性的(图3b)。为了确定ext终止子在没有tev5'utr时是否也有功能，我们直接将35s启动子与gus报告基因融合，之后是各种终止子(图1a)。我们发现，在没有tev5'utr时，ext终止子增加了gus的表达(图3c)，表明ext终止子增加表达的能力与特定的5'utr和转基因无关。为了评估这些结果是否可推广到其他植物物种，我们在烟草和生菜中测试延伸蛋白、nos和35s终止子。与我们在本氏烟草中的结果一致，与nos或35s相比，无内含子的延伸蛋白终止子强烈增强转基因表达，但增强作用的尺度在生菜中略有降低(图9)。这些结果表明，与其他常用终止子相比，无内含子的延伸蛋白终止子在多种不同物种和基因内容(context)中作为转基因表达的有效增强子，而发挥作用。c.ext终止子增加了mrna的积累通过多个核和细胞质过程(process)的复杂相互作用，3'utr影响mrna的命运，所述过程包括聚腺苷酸化、转录终止、转录重新初始化、核输出和可翻译性、以及避免了rna沉默带来的有害相互作用和mrna衰变途径。无内含子ext终止子介导的上调的转基因表达可能是由于mrna水平或翻译效率的提高引起的。为了研究ext终止子是否影响mrna的积累，比较了积累的转基因mrna的水平。与构建体pnos相比，构建体peu在gfpmrna积累上产生增加约20倍(图4a)。一致地，使用构建体peu的nvcpmrna积累与构建体pnos相比约高10倍(图4b)。这些结果表明，由ext终止子介导的转基因表达增强至少部分是由于增加的mrna积累。我们还比较了无内含子和含内含子的构建体(peu与pieu)之间的mrna积累水平。使用ext内含子导致mrna积累减少40-50％(图4a和图4b)，这与蛋白表达数据一致(图2a和图2b)。d.ext终止子介导有效的转录终止mrna的稳定性受到转录终止的效率和mrna3'末端加工的极大影响。rna依赖性rna聚合酶6(rdr6)-介导的rna沉默靶向未正确终止和未聚腺苷酸化的mrna(luo和chen2007)，而长3'的utr受制于无义(nonsense)介导的降解(decay)途径(kertész2006)。为了确定ext终止子是否增加转录终止的效率，我们使用随机引发的cdna进行rt-pcr，测试了ext和nos终止子构建体的通读转录本的存在(图5a)。对gfp(图5a)或nvcp基因(图5c)特异的正向引物(gfp-3f或snv-3f)，与对终止子的不同下游区域特异的四种反义(antisense)引物(rt-0，rt-1，rt-2和rt-3)之一相配对。从nos终止子样本中，使用前三个反向引物rt-0、rt-1和rt-2检测到与阳性对照相同尺寸的特异性rt-pcr条带，表明nos终止子产生了易于检测的camv35s强启动子驱动的通读转录本。相反，在使用任何引物组的ext终止子样本中均未扩增到可检测水平的特异性条带。这些数据表明，与nos终止子相比，ext终止子大大减少了通读转录。e.延伸蛋白终止子的聚腺苷酸化位点在图6中指出五个推定的nue的位置和ext终止子的聚嘌呤序列(pps)。为了表征ext终止子poly(a)位点的位置和特征，通过环化的rt-pcr分析了转基因转录本，环化rt-pcr可以检测poly(a)尾巴的天然位置和长度(slomovic和schuster2013)的方法。gfp转录本经过脱帽(decap)、环化、使用对环化模板特异性的引物进行rt-pcr扩增、克隆和测序。数据显示，在第四个推定nue(典型aauaaa基序)下游13个或25nt的ya二核苷酸处，ext终止子含有两个邻近的poly(a)位点区域(14个序列中的12个，占86％)(图6)。在此区域检测到的12个聚腺苷酸转录本中，有9个发生在nt527，而其他三个发生在nt515。由于通常在单一nue下游的同一区域中发现多个剪切位点，这些数据与假说相一致：第四个nue指导ext终止子中的大多数聚腺苷酸化作用(rothnie等人，2001)。为了支持该区域的功能相关性，与可获得序列同源的来自植物物种的延伸蛋白3'utr(从solgenomicsnetwork的genbank获得)使用clustalomegaprogram进行了比对。比较了红花烟草、茸毛烟草、梅花烟草、薄壁烟草、美花烟草、本氏烟草、马铃薯、番茄、潘娜丽番茄、辣椒和拟南芥的延伸蛋白终止子，比对表明第四nue是高度保守的。在所有真核基因中超过50％发现可选择的聚腺苷酸化位点(tian和manley2013)。在第三个和第四个推定的nue之间的位置424处发现了一个不经常使用的可选择的poly(a)位点(14％，14中的2个)。该位点在相关的延伸蛋白终止子中也高度保守。因为已经显明nue通常位于聚腺苷酸化位点上游10-40个核苷酸处(loke等人，2005)，而最接近的典型nue位于可选择的聚腺苷酸化位点上游70nt处，我们的结果表明，与非典型nue的不经常使用相符，非典型nue可能在此位点指导聚腺苷酸化。我们没有发现其他推定的nue在功能上活跃的证据，然而我们不能排除不经常使用它们的可能性。f.ext终止子的缺失分析使用图1b所示意的一系列缺失构建体，我们通过测量gfp的瞬时表达来研究ext终止子的特定区域是否控制其功能(图7)。通过crt-pcr鉴定，将全长构建体peu(nt252-731)与去除了的主要聚腺苷酸化位点的构建体peu2(nt252-464)相比较。与peu相比，缺失构建体peu2表现出显著较低水平的gfp基因表达(保留11-14％活性)。这些数据表明89bp的序列(nt465-553)对于产生最大基因表达至关重要。该结果与第四推定的nue指导ext终止子的大部分聚腺苷酸化的聚腺苷酸化数据一致。该缺失构建体的残留活性可能是由不经常使用的可选择聚腺苷酸化位点引起的，其在该构建体中保持完整。为了进一步确认第四个nue在ext终止子功能中的作用，我们创建了构建体pnue4a，其用“tcgtagctct”取代假定为nue的富含a的区域“aataaactaa”。这种取代将gfp的表达大大降低至与peu2相似的水平(图7)。缺失构建体peu1(nt252-553)保留了所有五个nue，但去除了与推定的主要切割位点紧接的下游区域，包括ce特有的富含u的区域。与全长构建体peu相比，peu1的表达显著降低(保留了约36％的活性)，表明该区域对于延伸蛋白终止子的最佳效率而言是必不可少的。缺失构建体peu3(nt465-731)被设计为包括第四和第五nue，但去除了其上游区域。构建体peu3显示没有可检测的gfp表达水平，说明仅鉴定出的主要polya位点，其推定的nue及其下游序列不足以单独支持基因表达。对该序列的检查揭示了富含ug的区域，是植物fue特有的，在其他植物延伸蛋白终止子序列中非常保守。该区域还包含可选择的聚腺苷酸化位点。因此，这种缺失能破坏两个聚腺苷酸化位点。为了进一步证实这种结果，测试构建体peu4(nt349-731)。peu4包含第四和第五个nue，但此外还包含更大的fue样区域。虽然该构建体恢复了类似于peu2的活性，但仍比全长构建体大幅降低，这表明无内含子延伸蛋白终止子的前97个核苷酸对于高水平的基因表达也是必不可少的。总的来说，这些数据表明ext终止子的多个区域对于其功能是必不可少的，包括典型的fue、nue和ce区域，而且还包括在主要的聚腺苷酸化位点上游约175nt的包含非典型的富含聚嘌呤区域序列的区域。为了确定该区域是否有助于延伸蛋白终止子提供的增强作用，我们删除或替代了多嘌呤序列并测试了其对gfp表达的影响(图8a和图8b)。为了替代，在保持片段长度的同时，将一些a残基替换为t。缺失或替代后，gfp表达水平显著降低(保留36-40％的活性)，但仍比使用nos终止子的构建体高4.7-5.2倍。这些数据表明，聚嘌呤序列也是有助于增强ext终止子作用的重要元件。g.讨论pre-mrna3'末端加工是基因表达中必不可少的步骤，并且受转录终止子的影响很大。因此，仔细选择最佳终止子对于高产量的重组蛋白生产而言重要。延伸蛋白是植物细胞壁的高丰度的成分。此外，拟南芥中mrna稳定性的全基因组分析发现，延伸蛋白mrna通常对降解具有高度抗性(narsai等人，2007)。这些因素以及不经常存在的内含子，使我们评估了烟草ext终止子其增强转基因表达的能力。除去天然内含子后，与其他常用的基因终止子相比，ext终止子从gfp、nvcp和gus三个转基因中产生了更高水平的瞬时转基因表达(多达13.5倍)。有趣的是，三个转基因与测试的终止子协同显示相似的表达水平模式；即，所有转基因均因具有ext终止子而表现最高的表达水平，其次是35s、vsp和nos终止子(图3a-图3c)。然而，不同转基因之间变化的差异尺度不同，表明如果存在基因特异性作用，则与每个终止子的固有效率相比，它们的作用很小。已知nos终止子包含一个隐含的poly(a)位点，该位点仅在上游存在异源fue时才起作用，这可能是由某些转基因提供的，而不能由其他转基因提供的(等人，1994)。与我们在本氏烟草中结果一致，我们发现无内含子的延伸蛋白终止子在其天然烟草和生菜中都强烈优于35s和nos终止子，虽然增强的幅度还有所不同。我们没有直接讨论5'utr对ext终止子效率的影响，但是考虑到gfp和nvcp表达载体包含tev5’utr，而gus构建体没有，5'utr并没有明显影响ext终止子的增强作用。此外，我们发现ext终止子与多种植物、病毒和人5'utr结合使用时，支持很高水平的转基因生产(diamos等人，2016)。这些结果表明，无内含子的延伸蛋白终止子在多种植物物种和转基因环境中是高效终止子。除了终止子外，内含子也可以显著影响基因表达。例如，通过包含增强子元件或通过不明确限定的过程(称为内含子介导的增强(intron-mediatedenhancement，ime))来增强(boost)某些内含子表达(rethmeier等人，1997；rose2008)。相反，组织特异性或发育受限的基因表达需要一些内含子：拟南芥(arabidopsisagamous，ag)基因和种子棒(seedstick)(stk)基因中的内含子将ag和stk的表达限制于花内的特定组织(sieburth和meyerowitz1997；kooiker等人，2005)；为响应春化作用，拟南芥花阻遏开花基因座c(floweringlocusc，flc)基因中的内含子可减少flc的表达(sheldon等人2002)。已经观察到，ext的表达受到组织特异性和发育性的调节，并受到各种胁迫环境的诱导(showalter等人，2010；hirsinger等人，1997)。ext基因3'utr中内含子的存在及其调控的表达可能暗示内含子参与调控的ext表达。此外，已显示含有内含子的植物3'utr可以激活无义介导的降解途径，有时会导致mrna积累减少(kertész2006)。我们表明，ext内含子可能以环境(context)依赖的方式对瞬时转基因表达具有调节功能。具体地说，内含子在存在于ext终止子时产生有害作用(多达70％降低)，但与nos终止子组合使用时显示出轻微的增加(图2a-图2b)。与这些数据一致，menossi等(2003)报道了玉米hrgp基因3′utr的组织依赖性调节功能：它在快速生长的胚芽鞘中增加了gus表达，但在玉米悬浮细胞中降低了gus表达。此外，3'utr中内含子的存在会激活无义介导的降解(decay)的程度，其以内容依赖的方式变化(kertész2006)。对于ext内含子的进一步研究可能为内含子介导的基因表达调控提供有价值的见解。我们证明，与其他终止子相比，ext3'utr显著降低了通读转录本的水平(图5a-图5c)。尽管有限的转录通读(约1％的转录本)是植物基因表达的正常现象(xing等人，2010)，但有大量数据表明通读转录本对基因表达有负面影响。例如，通读转录本可以触发rdr6介导的rna沉默，从而导致一连串的mrna降解(luo和chen2007)。在这方面最好的研究是拟南芥中的gus转基因表达。没有终止子的gus转基因产生通读mrna和一致的rdr6依赖性rna沉默。但是，当在gus转基因的3’末端放置两个3'终止子时解决这种现象：通读转录本和gus特异性小干扰rna的水平降低，导致gus表达更高。还建议使用双终止子增强来自最小盒的瞬时基因表达与异常rna形成的减少有关，以及因此阻止通过rdr6途径的后转录基因沉默(ptgs)的触发(beyeneg等人2011)。baeg等人(2017)进一步表征了该机制，表明缺乏polya尾巴的异常mrna被特异性地选择用于rdr6扩增。mapendano等人(2010)证明了另一种可能的机制，由此通读转录本介导基因表达下调。当poly(a)信号发生突变时，在突变基因的通读区域中发现了rna聚合酶ii(rnapii)复合物。参与突变转录单位的通读rnapii隔离转录起始/延伸因子，并导致其在启动子处耗竭，从而阻止了转录本的重新初始化。基于这些参考资料以及我们的数据显示ext终止子降低了通读转录本的水平并增加了mrna的积累，我们假设ext终止子至少部分地通过阻止rdr6激活基因沉默和/或通过刺激接下来的转录来提高转基因表达。ext3'utr包含五个推定的nue(图6)。对转基因转录本3'末端的序列分析表明，大多数转录本(86％)在第四个nue(其典型由aauaaa基序组成)后不远处的两个ya二核苷酸之一处被聚腺苷酸化。第四个nue位于切割位点上游25nt，这是典型的已报道的植物nue。虽然aauaaanue基序在哺乳动物中非常常见，但仍然是植物中鉴定出的单一最丰富的nue基序，已发现其在仅10％的拟南芥转录本中指导聚腺苷酸化(loke等人，2005)。系统发育分析表明，在许多烟草属物种中都发现了ext终止子的一般结构，但特别是内含子和主要polya位点之间的区域是高度保守的，在马铃薯(79％同一性)、辣椒(76％同一性)、番茄(73％同一性)和潘娜丽番茄(72％同一性)。该区域的比对显示aauaaa基序是高度保守的，支持我们的数据表明它作为主导性polya位点发挥功能。除此位点外，我们发现少数的ext终止子转录本在第三推定的nue(也为aauaaa)下游>60nt处是聚腺苷酸化的。然而，nue的典型位置是在poly(a)位点上游10-40nt，这表明非典型nue可能会替代指导其聚腺苷酸化。植物的nue通常富含a/au，然而其耐受显著的简并性(degeneracy)(mogen等人，1991；loke等人，2005)。因此，一个不常见的基序，例如“aaguua”位于不常使用的poly(a)位点上游的23nt，可在少数ext转录本中无效地指导的3'末端加工。这种可替代的聚腺苷酸化位点在相关基因中也高度保守，表明可替代的聚腺苷酸化可能是植物延伸蛋白的普遍特征。我们进行了缺失分析以鉴定ext终止子的哪些区域是其功能所必需的(图7)。缺失构建体peu2支持了已鉴定的主要聚腺苷酸化位点的重要性，显示出该构建体在去除含有第四个nue的区域后，ext活性急剧但不完全的降低。然而，peu2在nt424处以及其上游序列保留了不常用的聚腺苷酸化位点，这可以解释尽管失去了主要的聚腺苷酸化位点，其仍然残留活性。这些发现表明，尽管在ext终止子中存在可选择的聚腺苷酸化位点，但它不能补偿主要聚腺苷酸化位点的损失。植物聚腺苷酸化需要切割和聚腺苷酸化位点上游和下游多个区域的协同作用。构建体peu1(删除了聚腺苷酸化位点下游区域)表达大大降低(图7)，这与先前的研究一致，先前研究表明切割位点下游的富含u的区域对于合适的终止子功能很重要(dong等人，2007)。peu3包括主要的聚腺苷酸化位点和其各自的nue，然而没有可检测的活性。对在构建体peu3中去除的上游序列的检查显示，位于植物fue典型的切割位点上游约60-80nt处富含ug的区域(loke等人，2005)，其在其他同源ext基因中通常是保守的。尽管在peu4中包含这种推定的fue恢复终止子的一些活性(约16％)，但我们的数据清楚地表明，在已鉴定的polya位点上游约175nt区域对于延伸蛋白终止子的最佳功能也是必不可少的。延伸蛋白终止子在这上游区域包含不常见的45nt聚嘌呤序列(pps)，强烈影响其功能。pps的缺失或取代引起gfp表达约60％的大幅降低(图8b)。尽管pps提供了增强功能，但缺少pps的缺失构建体仍然优于所有其他测试终止子，这表明单独使用pps并不能说明ext终止子提供显著增强。pps包含可能的(potential)nue，然而在pps附近未发现poly(a)位点，表明该nue无活性。此外，pps与其他已知终止子元件没有相似性，表明其增强作用归因于尚未确定的机制。pps在许多烟草属的ext基因中以不同的长度存在，然而在ext基因中其长度比其他已测序植物物种要明显短得多。此外，即使在烟草延伸蛋白终止子中，pps在烟草中特别长。需要进一步的工作来确定pps是否在其他植物物种ext基因中起作用，以及pps的长度是否是增强其活性的重要起作用因素。总之，与去除天然存在的内含子的常用终止子相比，我们发现通过使用ext终止子增强植物中重组蛋白的生产，其将转基因表达提高多达13.5倍。基因表达的增加与通读转录的减少和mrna积累增加有关。无内含子ext终止子的高活性需要一个nue区域，其由以下组成：位于主要poly(a)位点上游25nt的典型aauaaa基序和周围的ce，以及位于切割位点上游60-80nt的fue样富含ug的区域，以及切割位点上游约200nt的不常见富含聚嘌呤的区域。还鉴定了一个不经常使用可选择的聚腺苷酸化位点。这项工作凸显了终止子在控制基因表达中的重要性，并且我们预期ext终止子的增强作用将广泛适用于基于植物的重组蛋白表达系统。2.其他终止子和嵌合3'侧翼区域a.评估各种终止子对gfp生产的影响为了系统地评估各种终止子，我们使用了来自植物和病毒来源的20种不同的终止子构建了表达载体，并放置gfp报告基因于3’末端，该报告基因由35s强启动子和烟草花叶病毒5'utr驱动(图10a)。通过农杆菌浸润将这些构建体递送至本氏烟草叶片并评估gfp生产。为了使叶与叶之间的差异最小化，还使用gfp载体浸润每片叶片，所述gfp载体含有无内含子烟草延伸蛋白终止子(eu)(我们之前发现其是基因表达的有效增强子)作为内部对照(diamos等人，2016；rosenthal等人，2018)。虽然之前许多工作使用nos和35s终止子，但据报道，拟南芥18.2kda热休克蛋白终止子(athsp)与nos终止子相比提高了转基因生产(nagaya等人，2010)。与这些结果一致，我们发现，与nos终止子相比，athsp终止子在gfp生产上提供2.5倍增加(图10b)。还与转基因马铃薯的之前工作相一致(richter等人，2000)，与nos终止子相比，马铃薯pinii3'utr提供非常强的8.5倍增加(图10b)。来自豌豆的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(rbcs)3'utr显示5.4倍增强。这些数据表明，来自不同植物物种的许多终止子在本氏烟草中具有高活性。为了识别新的候选者，拟南芥中全基因组范围研究mrna稳定性水平的(narsai等人，2007)用来定位具有潜在稳定性增强3'utr的基因。我们鉴定了拟南芥17.6kdaii类热休克蛋白(at5gl2020)的本氏烟草的同源物。该同源物的3'侧翼区域(称为nbhsp)具有很高的活性，与nos终止子相比，报告基因的表达增加了6.3倍，是athsp终止子提供的增强作用的两倍以上(图10b)。我们还确定了拟南芥肌动蛋白7(at5g09810)的本氏烟草的同源物，称为nbact3。虽然nbact3的下游617-nt区域与nos相比表达提高了3.9倍，但扩展的3'utr使其包含更多的下游序列(1044nt)导致了8.9倍的大幅增强(nbact3，图10b)。重组蛋白生产系统中许多活性最高的遗传元件来自病毒来源。因此，我们调查了病毒终止子增强基因表达的能力。豆黄矮病毒(beydv)的衣壳蛋白基因的下游短基因间隔区域(sir)本身，或者包含了其他下游病毒序列(sir3')时没有表现出内在的终止子功能(图10b)。但是当还包含豆黄矮病毒衣壳蛋白编码序列的上游区域(sir5’/3’)时，其具有很高的功能，提供的gfp产量比nos终止子高3倍(图10b)。这些数据表明，正确的3'末端加工需要beydv衣壳蛋白基因中存在的上游元件。还发现beydvrep和repa基因的下游序列具有高活性，分别提供5.6倍和2倍的增强。为了测试来自其他双子病毒的序列，还研究了豆矮花叶病毒(bdmv)基因的终止子。一段282nt序列(包含核穿梭蛋白的3’末端、基因间隔区域以及运动蛋白的3’末端)(bdb282)其表现与nos终止子相似。然而，当包含运动蛋白序列下游附加的200nt(bdb501)时，它提供了6.4倍增强。仅含有bdmv衣壳蛋白下游序列的构建体是不起作用的，再次表明必需信号也可存在于终止子上游的基因编码序列中。总而言之，这些结果表明，至少在本氏烟草叶片中的瞬时表达系统中，来自多种来源的许多3'utr超过了常用的nos或35s终止子所提供的增强作用。与我们之前的工作一致，eu终止子优于测试的其他19个3'utr，与nos终止子相比提供13.6倍增加，表明它是基因表达的独特有效增强子。b.组合的基因终止子强烈提高gfp生产双终止子由35s终止子融合至nos终止子组成，其与单独任一终止子相比，在各种植物物种中极大提高蛋白生产(beyene等人，2011)。为了研究串联终止子协同增强重组蛋白生产的能力，我们测试了之前在图1b中测试的组合。我们发现35s-nos双终止子与单独的nos终止子相比18.4倍增强作用(图11)，超过了最佳单终止子的最高产量。有趣的是，颠倒两个终止子的位置(nos-35s)则提供低得多的11.2倍增强作用，但仍大大超过了单独使用任一终止子获得的gfp生产。与单独的任一终止子相比，融合有pinii、nbhsp和bdb5013'区的35s均显著提高蛋白生产。然而，尽管这些终止子相对于nos具有各自的优越性，但与35s配对时，没有一个超过35s-nos的gfp生产(图11，比较35s-pin2、35s-nbhsp、35s-bdb501和35s-nos)。相反，将单一强nbact3终止子融合到35s或nbhsp终止子的3’末端导致gfp生产的有效增强，超过了35s-nos的生产(图11)。由于延伸蛋白eu终止子是鉴定的最佳单个终止子，因此我们评估了其与其他终止子结合的能力。添加nbhsp、nos或35s终止子到eu终止子的3'末端几乎使eu单独提供的gfp生产加倍，超过了35s-nos提供的基因表达。两种最佳的单独终止子，eu和nbact3组合在一起时，超过了所有其他组合，与单独nos相比提供显著的37.7倍增加(图11，eu+nbact3)。有趣的是，尽管35s终止子放置在nos终止子5'时表现最佳，但与eu配对时却发现相反：35s-eu提供的增强作用明显低于eu-35s(图11)。此外，将bdb501加入eu导致表达略有降低(图11)。因此，这些结果表明，串联放置的终止子以内容依赖的方式协同或拮抗相互作用。以前，我们发现，rna病毒大麦黄矮病毒(bydv)和豌豆耳突花叶病毒(pemv)的5'和3'utr使用包含延伸蛋白终止子的复制系统严重抑制本氏烟草叶片中的表达(diamos等人，2016)。据报道，基于豇豆花叶病毒(cmpv)5'和3'utr的非复制表达系统可增强基因表达，这主要是由于在nos终止子之前并入了病毒3'utr(sainsbury和lomonossoff，2008；meshcheriakova等人，2014)。在这项研究中，我们评估了非复制载体中病毒衍生的3'utr。与我们在复制载体的结果相似，我们发现当来自pemv，bydv和烟草坏死病毒d的3'utr插入eu终止子下游时强烈抑制基因表达，而tmv3'utr对基因表达的作用可忽略不计(图11)。与sainsbury等人的结果一致，包含豇豆花叶病毒5'和3'utr的peaq-ht-gfp与单独的nos相比提供17.1倍增加(图12)。但是，该载体还包含rnai沉默的p19抑制子。与nos相比，eu与p19的共浸润提供29.9倍增加(图11，比较eu和eu+p19)。来自dna病毒的3'utr也表现出色。尽管beydvsir本身没有表现出终止子功能，但将sir添加到eu3'末端时，其gfp生产几乎加倍。有趣的是，虽然含内含子的延伸蛋白终止子(ieu)与无内含子版本(eu)相比，本身的表现很差，但是加入beydvsir完全消除内含子的有害作用(图10b，比较ieu+sir和eu+sir)。将35s终止子加入ieu也大大增强表达，但是在这种情况下总产量低于去除内含子的可比较的载体(图11，比较ieu+35s和eu+35s)。这些结果表明，当病毒3'侧翼区域插入到基因终止子的下游时，具有强烈增加基因表达的能力。c.基质附着区域是瞬时表达的有效增强子尽管mar已被广泛用于转基因表达系统中，但很少有其在瞬时表达系统中使用的报道。我们发现，当烟草rb7mar置于基因终止子的下游时，其在复制的双子病毒瞬时表达系统中强烈增强瞬时表达(diamos等人，2016)。为了更充分地表征mar在瞬时表达系统中发挥作用的能力，将烟草rb7和tm6mar与8种不同的基因终止子组合插入非复制gfp表达载体中。在eu终止子的下游插入rb7mar导致gfp生产显著3倍增强(与单独nos相比为40倍)，超过最佳的双终止子构建(图12，比较eu和eu+rb7)。有趣的是，与sir类似，rb7mar还显著提高了原本弱的ieu终止子的生产，增强表达19倍，使其与eu-rb7载体几乎持平(图12，比较ieu、ieu+rb7，以及eu+rb7和图17a)。为了验证观察到的增强作用是rb7mar所特有的，取自合成诺如病毒衣壳蛋白编码序列的类似尺寸的对照dna序列替代的插入了gfp的下游，发现在gfp的生产上没有显著差异(图12，比较eu和eu+对照)。检查富含at的rb7mar序列发现许多终止子样元件，尽管在没有终止子的情况下，使用mar作为唯一的3'区域无法产生可检测到的gfp活性，这表明其不能作为完全功能的终止子(图17a)。与我们在复制系统中的发现一致，启动子的rb7mar5'位置对基因表达没有影响(图17a)。我们进一步发现rb7mar与以下终止子联合使用时提供显著增强：35s(13.8倍)、athsp(13.6倍)、nos(l2倍)、bdb501(3.6倍)或nbhsp(2倍)终止子(图12)。在没有rb7mar的情况下，nbhsp终止子比35s终止子的提供近3倍更多表达。但是，添加mar后，35s/rb7组合提供nbhsp/rb7表达的两倍(图12)。有趣的是，虽然rb7mar显著增强所测试的8种终止子中的7种，但是nbact3终止子却不受添加rb7mar的影响。据报道，烟草tm6mar在转基因烟草中超过了rb7mar的增强作用(ji等人，2013)。为了在我们的瞬时表达系统中测试tm6mar，从烟草植物克隆了完整序列，并插入了rb7mar的位置。当tm6mar与35s、nos或ieu终止子配对，而并不与nbact3配对时，tm6mar增强gfp生产，与我们对rb7mar的发现相似(图12，紫色条)。但是，在所有测试的组合中，tm6mar提供的增强作用的幅度明显小于rb7mar(图12和图17a)。使用缺失研究，我们调查了1193bprb7mar的哪些区域负责观察到的增强作用。缺失核苷酸144-1193或437-1193消除了rb7mar的增强作用，然而缺失核苷酸1-144、144-437、1-437、421-730或1-730不会损害mar活性(图17b)。实际上，在缺失核苷酸1-730时观察到了rb7mar提供的增强作用中少量但可重复的增加(图17b)。这些数据表明，rb7mar的3’末端相对较短的区域负责该系统中所有观察到的增强作用。d.组合3’侧翼区域的协同增强作用我们研究在组合使用双终止子和rb7或tm6mar时进一步增加基因表达的能力。将rb7mar添加至eu-35s双终止子中显著增加单独双终止子提供的表达(2.4倍)以及具有或不具有rb7mar的任一单个终止子提供的表达(图13，比较eu+rb7、35s+rb7，eu+35s+rb7和图3eu+35s)。与nos终止子相比，这代表总计增加56.7倍。但是，通过将rb7mar加入eu-35s中提供的倍数增加小于将rb7单独加入eu或35s中所提供的增加(图17a)。有趣的是，尽管rb7mar本身未能增强nbact3终止子的表达，但添加rb7mar后35s-nbact3双终止子进一步增强了2.4倍，比35s-rb7提供的表达增加了一倍以上(图13)。通过加入rb7mar，表达最高的双终止子eu-nbact3也提高了1.5倍。虽然在任一方向上组合，35s和nos终止子得到显著改善(图12)，并且在35s-nos双终止子中添加rb7mar使表达进一步增加了1.9倍(将图13的35s+nos+rb7与图12的35s+nos进行比较)，35s-nos-rb7的总产量并不优于单一终止子构建体35s-rb7(图12，比较35s+nos+rb7和35s+rb7)。类似地，尽管我们观察到rb7mar与单个终止子athsp、eu、bdb501和35s之间巨大的协同作用，并且尽管通过加入rb7增强双终止子athsp-eu、35s-eu和eu-bdb501提供的表达，然而所有均表现差于eu-rb7。此外，mar的存在根本没有改善一种双终止子组合。将rb7mar添加到nbhsp-pin2中导致小的1.1倍增加，其并非统计上显著的(将图12nbhsp+pin2+rb7与图11nbhsp+pin2进行比较)。e.在复制系统中评估组合的3’侧翼区域先前，我们报道了一种基于双子病毒豆黄矮病毒的植物瞬时表达系统，该系统通过增加目标基因的dna拷贝积累来增强基因表达(huang等人，2009)。我们发现，通过插入延伸蛋白终止子和rb7mar以及其他修饰显著增加表达(diamos等人，2016)。为了评估组合的3'utr在该系统中发挥功能的能力，将几种最佳表现的3'utr组合克隆到表达gfp的双子病毒载体中。含有eu-rb7的双子病毒载体比非复制载体提高表达3.1倍(图14a)。类似地，当包含eu-35s-rb7和35s-nbact3-rb7的两个最佳非复制载体置于双子病毒载体中时，分别进一步增强了2.7倍和2.5倍(图14a)。与其非复制对应物相似，与仅包含eu-rb7的复制载体相比，在双子病毒载体中，35s-eu-rb7和35s-nbact3-rb7组合将gfp生产提高多达20％(图14a)。最佳构建体的总gfp表达估计多达总可溶性蛋白的50％或每千克鲜叶重3-5g(图14b)。f.单一和组合的3'侧翼区域的基因特异性和植物特异性活性为了确定所鉴定的终止子与除gfp以外的报道基因表现是否相似，用dsred基因取代gfp基因构建了包含各种单个或组合的终止子的载体。dsred与gfp没有序列同源性。对于单个终止子，延伸蛋白终止子提供最高水平的基因表达(图15)，这与我们有关gus或诺沃克病毒衣壳蛋白的数据一致(rosenthal等人，2018)。当与gfp相匹配时，其他终止子表现相似，尽管观察到一些小的差异，例如与nos相比，nbhsp和35s在dsred上活性增加(图15)。ieu-35s双终止子显著超过了仅有eu时的dsred生产，但在dsred上35s-nos双终止子的表现显著差于gfp(图15)。使用rb7mar与大多数终止子强烈增强dsred表达，在一种测试的情况下，rb7提供的增强作用超过tm6(图15)。有趣的是，尽管35s-rb7使用gfp的表现很好，而使用dsred却没有。遗传元件的功能通常在物种之间有所不同。为了评估这些结果在其他植物系统中的普遍性，在红花烟草(n.tabacum)和生菜中测试了3'utr的一部分。与我们在本氏烟草中的结果相似，在烟草和生菜植物中，使用eu比使用nos的gfp基因表达高＞10倍，并且eu超过了所有其他测试的单一终止子(图16)。尽管eu在其天然(native)烟草中的表现明显优于所有其他单一终止子，但在生菜中athsp、nbhsp和nbact3与eu表现几乎一样好(图16)。在烟草和生菜中将rb7mar添加至eu强烈增强gfp表达，在本氏烟草中表达非常强烈的35s-nbact3-rb7组合在烟草和生菜中也是如此(图16)。尽管包含延伸蛋白内含子的ieu-35s-rb7在本氏烟草中强烈表达，但在烟草中表达却低得多(图16)。类似地，具有rb7mar或没有rb7mar的nbhsp-nbact3在烟草中的表现要比在本氏烟草中的表现明显更差(图14和图16)。g.讨论为了更广泛地评估3'侧翼区域在植物系统中增强基因表达的能力，我们系统地比较了来自各种植物和病毒来源的终止子的不同组。narsai等(2007)报告拟南芥中mrna稳定性的基因组范围的分析，表明表征性3′utr基序富含长寿或短寿转录本。为了合理获得具有增强基因表达能力的推定终止子候选物，我们鉴定了两个高度稳定的拟南芥转录本的本氏烟草同源物：一个18.8kdaii类热休克蛋白基因和一个肌动蛋白样基因。两种终止子均优于以前经常使用的所有终止子(图10b)。虽然我们仅测试了以此方式确定的两个终止子，但是我们猜想可以发现其他候选物。总体而言，我们发现12个终止子优于35s或nos的表现。来自强启动子高表达的基因是rna沉默的靶标(que等人，1997；schubert等人，2004)，由rdr6介导(béclin等人，2002)。luo和chen(2007)证明，不正确终止的mrna会导致rdr6介导的转基因沉默，而35s-nos双终止子的使用降低了这种作用，同时在转基因拟南芥中增强了gus的表达。beyene等人(2007)还发现35s-nos双终止子在几种植物物种中具有大的增强作用。尽管无内含子eu终止子其自身显著优于测试的所有19个其它单一终止子，但我们确定了显著超过eu单独表现的8个双终止子，其中7个显著优于35s-nos双终止子(图11)。我们发现几乎每种组合都优于任何一个单独的终止子，表明串联的终止子具有增强基因表达的非常好的能力。有趣的是，在两个测试案例中，两个终止子位置的颠倒导致表达上显著差异，表明观察到的增强作用并非完全由于两个终止子的个体作用，而是在两个终止子之间的部分取决于其相对位置的协同相互作用。此外，将35s终止子放置在在nos上游时功能很强；但是，与35s与eu配对则观察到相反：当35s替代地放置在eu下游时，表达提高了50％。这些结果表明，给定终止子的最佳位置取决于与其成对的单个终止子。需要进一步的工作来研究这些差异下的单个机制。rna病毒的3'侧翼区域包含许多增强mrna稳定性或增加翻译的机制(fan等人，2012；simon和miller2013)。但是，当在植物核中表达时，这3'区域可能包含隐蔽剪接(crypticsplice)位点和其他有害的序列。我们测试的大多数rna病毒来源的3'侧翼区域在本氏烟草叶片中瞬时表达时功能较差，除了豇豆花叶病毒来源的那些。据报道，来自豇豆花叶病毒的5'和3'utr是蛋白表达的有效增强子(sainsbury和lomonossoff，2008；meshcheriakova等人，2014)。总的来说，我们发现peaq-ht-gfp，其含有nos终止子和豇豆花叶病毒utr，与单独的nos相比提高gfp表达17.1倍。但是豇豆花叶病毒载体peaq-ht-gfp也包含rna沉默的p19抑制子，这可能会增强rna的稳定性(sainsbury等人，2009)，难以直接与其他3'utr进行比较。虽然peaq-ht-gfp比单一的延伸蛋白终止子提供的gfp多20％，但是在延伸蛋白又补充有p19的情况下，其提供的gfp少40％(图11)。我们还发现，此处鉴定的其他高表达终止子组合通过添加p19也强烈地增强(数据未显示)。由于peaq-ht-gfp包含相对弱的nos终止子，我们怀疑豇豆花叶病毒侧翼区域使用较强的终止子可能表现更好，除非与nos存在某些特定的协同作用。已发现源自核适应性dna病毒(例如双子病毒)的侧翼区域是基因表达的有效增强子，尤其是与功能性终止子组合使用时。来自豆黄矮病毒的短200bpsir其自身没有表现出终止子活性，但是与延伸蛋白终止子结合使用时，发现它可以强烈增强基因表达，与测试的最佳双终止子组合相当。但是，将sir扩展到包含beydv衣壳和rep蛋白的上游和下游编码序列，表明它自身还具有强大的终止子功能。从豆矮花叶病毒获得的3'utr获得了类似的结果。这些结果突出了上游基因编码序列对3′utr功能的影响。需要做进一步的工作，以更好地表征双子病毒3'utr的增强能力，并确定观察到的sir增强效果是否是终止子特异性的。尽管先前mar已用于转基因系统，我们发现烟草rb7mar使用双子病毒瞬时表达系统仍显著改善基因表达(diamos等人，2016)。农杆菌递送(deliver)的t-dna中只有一小部分经历了染色体整合，而大部分则是瞬时转录到细胞核中。研究表明，包被t-dna的农杆菌蛋白vire2和附着于t-dna5'末端并介导核进入的vird2，两者均与细胞组蛋白有关(lacroix等人，2008；vanheusden等人，2015)。由于认为mar影响染色质的结构，因此t-dna与组蛋白的结合说明mar在农杆菌浸润递送的载体中发挥作用的可能机制。在这里，我们发现烟草rb7和tm6元件都大大增强了农杆菌浸润的叶组织中瞬时基因表达(图12)。rb7mar的作用以启动子依赖性方式变化(mankin等人，2003)。类似地，我们发现mar的效果也以终止子依赖性方式变化。eu是最强的单个终止子，而eu-rb7是最强的mar组合，超过最佳双终止子50％以上。然而，虽然nbact3是第二强单个终止子，但nbact3-rb7是表达最低的mar组合。有趣的是，当nbact3与tm6mar配对时我们看到了类似的效果，这表明与nbact3区域配对时，两个mar中存在一些增强活性并未激活。所有其他终止子都极大地受益于加入rb7或tm6mar，尽管增强的幅度以与每个终止子单独介导的单个表达水平不相关的方式变化。ji等(2013)发现，在转基因烟草中tm6mar以远高于rb7mar的水平增强gus表达。但是，我们始终发现rb7mar增加瞬时表达远远高于tm6mar。观察到的差异可能是由于不同的表达系统或不同的报道基因。我们发现rb7mar的整个增强活性位于其3'末端的463bp区域中。尽管尚未报道rb7mar的功能区域的详细表征，但我们发现可有可无的区域包含几个富含at的区域，一个基质附着识别序列基序和一个拓扑异构酶ii结合位点，所有这些以前都是怀疑在mar功能中起作用(allen等人，1996)。ji等(2013)发现删除相似的mar元件会显著降低tm6的增强作用。此外，据报道，当将tm2mar置于目标基因的5’末端时功能最佳(zhang等人，2009)，而我们发现rb7mar在5'插入没有影响，由于认为mar包含多个负责其增强功能的活性区域，因此rb7、tm2和tm6mar的关键功能区可能存在差异，因此难以直接进行比较。另外，虽然rb7和tm6在我们的瞬时表达系统中都明显具有活性，在瞬时系统和转基因系统之间表达增强的机制可能不同。需要进一步的研究来解决这些差异。以前，我们发现组合优化的5'utr和rb7mar产生基因表达的协同增强(diamos等人，2016)。其他研究通过复制或组合高功能的遗传元件，例如通过串联tm2mar(zhang等人，2002)或组合来自酒精氢化酶的5'utr与athsp终止子(limkul，2015)，获得满意的结果。在这里，我们发现在某些情况下，但不是大多数情况下，将双终止子与rb7mar组合增强的基因表达超过其自身的任一组分(图13)。在rb7mar与eu-35s、35s-nbact3以及eu-nbact3双终止子之间观察到特别高的协同作用，达到非常高的表达水平，比单独的nos终止子高多达60倍。当组合双终止子和mar时，我们看到了可变的影响。虽然35s-nos是相对较强的双终止子，但与rb7组合时几乎没有协同作用。类似地，尽管athsp终止子与rb7mar具有高协同作用，但是与单独的athsp-rb7相比，含有athsp的双终止子不能改善表达(图13)。因为在本研究中测试的所有athsp双终止子均将athsp放置作为上游终止子，所以反转终止子位置可能会导致更好的性能。值得注意的是，虽然eu-35s-rb7是测试的最佳组合之一，但反向的35s-eu-rb7的表达降低50％(图13)。我们已经建立了基于双子病毒豆黄矮病毒的复制瞬时表达系统，其在植物细胞核中将目标基因的扩增至高拷贝数(huang等人，2009，huang等人，2010)。通过将经过优化的5'和3'utr并入其他修饰，我们已经使用该系统生产疫苗抗原和药物蛋白，其水平大于或类似于基于植物的系统中报道的最高水平(diamos等人，2016)。在这里，我们发现使用双终止子和mar构建体35s-nbact3-rb7和eu-35s-rb7当放置在复制载体中，其基因表达改善了约2.5倍，与仅含有单一终止子和mar的最佳复制构建体相比有20％增加(图14a)。这表示与单独的原始nos载体相比增加了150倍以上，从而提供了约40-60％的总可溶性蛋白或每公斤叶片组织的4-5mg重组蛋白的估计产量(图14b)，其看上去接近基于植物的系统可达到的理论极限。已经显示上游基因编码序列与3'utr相互作用。nos终止子包含一个隐蔽的聚腺苷酸化位点，该位点需要上游元件存在时才能发挥其功能(等人，1991；和hohn，1990)。我们发现，豆黄矮病毒和豆矮花叶病毒的基因间隔区域都需要具有上游衣壳蛋白编码序列来实现终止子功能(图10b)。这些结果表明3'utr在不同目标基因背景下可表现不同。使用dsred作为与gfp没有同源性的替代报告基因，我们发现大多数单个或组合的3'utr彼此之间表现相似，只有少数例外。35s-nos和35s-rb73'utr与dsred的组合相比其与gfp的组合表现明显更差，但表现仍优于单独的35s。尽管这些组合表现较差，但单独使用35s终止子与dsred组合效果要好于组合gfp，以及将35s终止子放置为第二终止子的组合仍具有很高的功能(图15)。已证明生菜是能够快速生产重组蛋白的有前途的植物系统(lai等人，2012；chen等人，2016)。为进一步调查我们结果的一般性，我们还测试了烟草和生菜中各种3'utr。与本氏烟草一样，eu是生菜中最好的单个终止子。此外，包含rb7mar组合的终止子显著优于测试的任何单个终止子(图16a和图16b)。然而，在本氏烟草中表现出色的一些终止子组合在生菜或烟草中的表现相对较差。由于我们并未使用多个基因或其他植物系统测试每个已鉴定组合，因此可能存在我们未在此处发现的其他基因特异性或植物特异性效应。总体而言，我们的数据表明，给定系统的最佳终止子必须凭实证分析确定。但是，在本氏烟草、生菜和烟草中，使用gfp、dsred、gus和诺沃克病毒衣壳蛋白已经证明了无内含子eu终止子的有效增强作用(图10b、图15、图17a、图17b和rosenthal等人，2018)，表明该终止子在许多基因环境中本质上具有高活性。此外，我们的结果清楚地表明，组合使用终止子是在多种系统中改善基因表达的高效策略。总之，我们已经鉴定出一组多样的基因终止子区域，其大大超过了本氏烟草、烟草和生菜叶片中最常用的终止子所提供的基因表达。无内含子烟草延伸蛋白终止子是基因表达的独特有效增强子。在几乎所有测试的案例中，双终止子的表现都优于任一单个终止子，通常比最佳单个终止子的基因表达高出2倍以上。我们发现mar(尤其是rb7mar的3'末端)是瞬时基因表达的强增强子，以及当与双终止子组合时，可以协同增强表达。将这些组合的终止子并入到复制的双子病毒表达系统中，使我们能够生产与基于植物系统中报道的最高水平相当的重组蛋白。此处确定的3'utr组合具有改善其他基于dna的植物表达系统的广泛能力。3.双终止子增强vlp表达尝试使用基于tmv的magnicon系统表达gii.4诺如病毒衣壳导致细胞死亡迅速发作，并相应地获得每克鲜叶重(lfw)0.3mg的低vlp产量(mathew等人，2014)。从一克本氏烟草叶片组织中可提取的总可溶性蛋白为8-10毫克。以前，我们已经报道了使用豆黄矮病毒载体，以每克鲜叶重(lfw)1.8毫克、或以总可溶性蛋白的约20％表达gi诺沃克衣壳蛋白(nvcp)。为了尝试使用设计用于减少细胞死亡的优化载体来生产gii.4诺如病毒vlp，使用含有rb7基质附着区域的豆黄矮病毒载体(图18a)以及具有或不具有rep/repa表达降低的nbpsak5'utr(diamos等人，2016，以及待在他处发表的数据)，用农杆菌菌株eha105以0.2的od600值浸润到本氏烟草的叶片中，并监测细胞死亡。没有这些优化的未修饰载体用作对照。在表达gii.4诺如病毒衣壳的beydv载体中测试了我们发现是植物瞬时基因表达的有效增强子的组合基因终止子。基因终止子测试ieu、ieu+35s(如图18b和图18c中表示为ieu-35s)，eu+nbact3(在图18b和图18c中表示为eu-nbact3)，35s+nbact3(在图18b和图18c称为35s-nbact3)。通过western印迹和elisa两者，与ieu或ieu+35s相比较，eu+nbact3和35s+nbact3双终止子增强了表达。最好的双终止子eu+nbact3提供64％的表达增加，可产生多达1.1mg/glfw的gii.4诺如病毒衣壳(图18b和图18c)。添加0.1％tritonx-100洗涤剂增强诺如病毒衣壳的回收率(图18c)。还用ieu、ieu+35s和35s+nbact3双终止子测试了ginvcp的生产。像gii.4vlp一样，35s+nbact3的表达与ieu相比增加了30％，从而产生2.3mg/gnvcp或多达总可溶性蛋白的28％的产量。使用beydv植物表达系统，我们生产的诺如病毒vlp是基于植物系统中报道的最高水平的2-3倍。修饰的beydv载体允许高水平生产gii.4诺如病毒vlp，而不会引起植物细胞死亡反应。通过优化提取条件，我们实现了vlp的纯度＞90％，且没有产量损失，从而允许从单个植物叶片中生产毫克量的vlp。4、示例性植物表达载体pbyr2eak2mc-gp(参见图19和seqidno.115)是beydv复制子，其位于两个长的基因间隔区域(在图20中表示为lir)之间，由asci和agei位点界定。复制子包含一个带有camv35s双重增强子启动子的表达盒(在图19中表示为p35sx2e)，接着是本氏烟草psak2基因5'utr。表达盒串联在p35sx2e和psak25'utr后面，接着是gfp编码序列，其侧翼为独特的xbai和saci位点。紧接着下游是嵌合终止子(在本文中也称为双终止子)包含无内含子烟草延伸蛋白终止子(在图19中表示为eu3’)和本氏烟草肌动蛋白3终止子(nbact3)。双终止子后面是烟草rb7基质附着区域(在图19中表示为rb7marcdelta144-437)。rb7marc的下游是beydv短基因间隔区域(sir)，其还包含聚腺苷酸化信号。反向的rep/repa(c1/c2)基因在下游lir中由beydv启动子驱动。sirna结合蛋白p19的表达盒(来自番茄丛矮病毒)位于pvui和asci位点之间(图19上的约0-45°)。p19编码序列由单个增强子35s启动子和烟草花叶病毒(tmvω)5'utr驱动。马铃薯pinii基因3’区域(pin2)充当p19表达盒的终止子。t-dna区域(通过根瘤农杆菌转移到植物细胞中的dna)由左边界和右边界区段划定。如图22c所示，该种在gfp编码序列下游具有双终止子的构建体比具有单一终止子的相应构建体(pbyr2ek2mc-gfp)产生更亮的荧光。pby11ha-gfp(参见图20和seqidno.116)包含beydv复制子，其位于两个长的基因间隔区域之间(在图20中表示为lir)，由asci和agei位点界定。该复制子包含两个具有camv35s双重增强子启动子的表达盒(在图20中表示为p35sx2e)，其后是本氏烟草psak2基因5'utr。第一个盒在5'utr的下游具有2个bsai位点；当被bsai切割时，载体末端具有5'单链突出(粘性末端)5'-ctag(上游)和5'-agct(下游)，其允许插入编码序列。bsai位点之后接着嵌合终止子，其包含无内含子烟草延伸蛋白终止子(在图20中表示为ext3'utr)和本氏烟草hsp20基因终止子(在本文中也称为本氏烟草18.8kdaii类热休克蛋白3'utr或nbhsp)，其后是烟草rb7基质附着区域(在图20中表示为rb7marc)。第一个rb7marc的下游是beydv短基因间隔区域(sir)，其还包含聚腺苷酸化信号。第二个表达盒以串联相接其后(p35sx2e，psak25'utr)，接着是gfp编码序列，其侧翼为独特的xbai和saci位点。位于正下游的是嵌合终止子，其包含无内含子烟草延伸蛋白终止子(在图20中表示为eu3')和本氏烟草肌动蛋白3终止子(nbact3)。终止子之后接着是另一个marc和sir段。反向的rep/repa(c1/c2)基因由下游lir中的beydv启动子驱动。用于sirna结合蛋白p19的表达盒(来自番茄丛矮病毒)位于pvui和asci位点之间(图20上为约0-45°)。p19编码序列由单一增强子35s启动子和烟草花叶病毒(tmvω)5'utr驱动。马铃薯pinii基因3’区域(pin2)充当p19表达盒的终止子。t-dna区域(通过根瘤农杆菌转移到植物细胞中的dna)由左边界和右边界区段划定。pby11ha-gfp载体针对两种蛋白的共表达进行了优化，并具有易于插入两个编码序列的独特限制性酶切位点。pby！11-h6d8m2e(参见图21和seqidno.117)类似于双盒载体pby11ha-gfp，但具有用于修饰的mab的表达盒(在第一盒中与流感抗原m2e融合的重链；在第二盒中的轻链)。图22a和图22b描绘了该载体的表达数据，即重组免疫复合物(ric)的表达。ric由于免疫复合物而固有地不溶性，但通过修改提取方案，ric可以占转化植物提取的总可溶性蛋白的至少40％。因此，在两个盒上均含有双嵌合终止子的双表达盒载体表现非常好。5.实验步骤a.载体构建对于ext终止子的序列位置，ext终止密码子的u的位置被指定为-3。最初的构建体是用于实验的pby027-ieu，实验结果在图1a-图9，其含有跨越来自红花烟草基因组dna的1-731nt的片段(genbank登录号d13951)，使用saci和ecori位点将其克隆在pby027中(mor等人2003)。使用引物ext-1和ext-2通过pcr扩增片段。得到图1a-图9的实验中使用所有引物的序列列在表1中。使用引物ext-3和ext-2通过pcr从pby027-ieu中扩增出ext终止子的无内含子形式(跨越252-731nt)，并克隆到pby027的saci和ecori位点以产生pby027-eu。切除了pby027-eu的xhoi-ecori片段，并替换pps1中的相应片段(huang和mason2004)以产生peu(图1)。使用ext-1和ext-2(pieu)、ext-3和ext-4(peu1)、ext-3和ext-6(peu2)、ext-5和ext-2(peu3)以及ext-1和ext-6(pieu2)的引物对类似地克隆各种形式的ext终止子。对照质粒pnos、p35s和pvsp如下产生。从构建体pibt211.l中切除nos终止子(richter等人，2000)，并使用saci/ecori位点克隆到pby027中以产生pby027-nos。使用引物35stm-1和35stm-2通过pcr从prtl2-gus(carrington等人，1991)扩增35s终止子，并将其克隆到用saci/ecori打开的pby027中，得到pby027-35s。pby027-nos、pby027-35s和pby027(包含vsp终止子)切下xhoi-ecori片段，并替换pps1中的相应片段以产生pnos、p35s和pvsp。通过pcr使用引物ext-1和ext-8从pieu扩增包含ext终止子内含子的片段，并将其克隆到用saci打开的pnos中得到pinos。通过将构建体peu、peu1、peu2、peu3、pieu、pieu2、p35s、pvsp、pnos和pinos上包含绿色荧光蛋白(gfp)基因的xhoi/saci片段，取代为从质粒psnv210(zhang等人，2006)使用xhoi和saci位点切除的nvcp编码区，来获得一组编码具有各种终止子的诺沃克病毒衣壳蛋白(nvcp)的构建体。通过以下获得了另一组含有β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因(带有内含子)的构建体：用引物gus-1和gus-2用从pgptvk-gi(collens等人2007)扩增的pcr片段替换构建体peu、p35s、pvsp和pnos的gfp基因，并用xhoi和saci消化。对于产生图10a-17b的实验，通过3片段连接构建包含35s启动子、烟草花叶病毒5'utr、gfp基因和全长烟草延伸蛋白终止子的农杆菌t-dna二元载体：通过xhoi-ecori消化获得来自pps1的载体主链(huang和mason，2004)；通过xhoi-saci消化从pbyr2e-gfp(diamos等人，2016)中切除tmv5′utr-gfp片段；并从pby-gfp212中切除无内含子的延伸蛋白终止子(diamos等人，2016)。所得的载体pps-ogfp-eu用于构建单一和双终止子构建体。用引物dsr-xba-f和vspht从pbydsred(huang等人，2010)扩增dsred基因，用xbai-saci消化，然后将其插入pps-ogfp-eu中以创建pps-odsr-eu。使用引物(表1)通过pcr扩增终止子(该引物设计为分别在其5'和3'末端插入saci和ecori限制性酶切位点)，经saci-ecori消化并连接到同样经消化的pps-ogfp中。从phb114(richter等人，2000)、phb103(richter等人，2000)和prtl2-gus(carrington等人，1991)分别通过saci-ecori消化得到获得了pinii、nos和rbcs3'区，并克隆到同样消化的pps-ogfp中。具体地，使用索尔基因组网络(solgenomicsnetwork)本氏烟草草案(draft)基因组鉴定了nbhsp(at5g12020的同源物)和nbact3(at5g09810的同源物)终止子(fernandez-pozo等人，2015)。对于nbhsp和nbact3特异的引物(表1)设计用于引入saci和ecori位点用于扩增本氏烟草基因组dna的每个基因的下游片段。pcr产物经saci-ecori消化，并插入同样消化的pps-ogfp-eu中。对于双终止子构建体，使用设计为在5'末端插入saci位点并在3'末端插入bsai位点的引物(表s1)，通过pcr扩增上游区段。在5’末端用bsai位点(经设计用于产生与上游bsai位点兼容的突出部分)，并在3’末端用ecori位点来扩增下游区段。通过3片段连接组装最终构建体：saci-ecori消化的pps-ogfp-eu、saci-bsai消化的上游区段、bsai-ecori消化的下游区段。对于mar构建体，将烟草rb7或tm6mar插入终止子的下游。首先，通过三个片段连接将rb7mar插入pps-ogfp-eu：用pvui-sphi消化pps-ogfp-eu，得到载体片段；用pvui-ecori消化pps-ogfp-eu，获得gfp盒；使用ecori-sphi消化pbyr2e-mrtxgm(diamos等人，2016)以获得rb7mar片段。将得到的载体进行kpni-agei消化，用klenow片段dna聚合酶将末端补平，并将载体片段自连接以产生pps-ogfpm-eu。使用引物tm6-ecori-f和tm6-kpni-r(ji等人，2013)从烟草基因组dnapcr扩增tm6mar(基因库登录号kc555564)，酶切消化ecori-kpni，然后插入puc19。然后切下含有tm6mar的ecori-avrii片段，并插入同样消化的pps-ogfpm-eu中，得到pps-ogfpt-eu。如针对pps-ogfp-eu所述，通过saci-ecori消化将单一或双终止子插入pps-ogfpm-eu或pps-ogfpt-eu。对于rb7缺失突变体，如图14a和14b所示使用天然限制性位点。用每种各自的酶消化后，末端用klenow片段dna聚合酶补平，并自我连接。表1使用的引物b.多嘌呤序列(pps)突变的dna构建体使用标准重叠pcr和分子克隆方法构建pps突变载体。对于peud，使用pby027.ieu作为模板，使用引物组ext-3/ed-2和ed-3/ext-6以单独的pcr反应进行初始扩增。混合所得的pcr片段，并使用与两个初始片段末端互补的引物ext-3和ext-6进行扩增。使用saci/ecori位点将所得pcr产物插入pby027，然后通过xhoi/ecori亚克隆到pps1中。对于peu执行相似的步骤以在单独的pcr中扩增两个重叠的dna片段。通过双轮pcr获得5'片段：在第一轮中，以pby027.ief作模板与引物ext-1和et-2一起使用，所得片段使用引物ext-1和vet-6进行第二轮扩增。也可通过双轮pcr获得3'片段：在第一轮中，pby027.ef作为模板与引物et-3和ext-2一起使用，所得片段使用引物vet-5和ext-2进行第二轮扩增。混合得到的5'和3'片段，并使用引物ext-3和ext-2扩增。使用saci/ecori位点将最终的pcr产物插入pby027，然后通过xhoi/ecori亚克隆到pps1中。c.农杆菌浸润程序通过电穿孔将二元载体分别引入根瘤农杆菌lba4404中(用于图1a-图9)或gv3101(用于图10a-图17b)。所得菌株是经pcr验证，在30℃下生长过夜，并用于浸润叶片。对于图1a-图9中的实验，叶片来自生长容器中生长的6到8周龄的本氏烟草、红花烟草(n.tabacumcv.81v9)或生菜(lactucasativacv.lollarosa)植物。对于图10a-图17b中的实验，叶片来自保持在23-25℃下的5至6周龄的本氏烟草、红花烟草(n.tabacum)、或生菜(生菜(lactucasativa“黑种子辛普森(blackseededsimpson)”))。简而言之，通过在5,000g下离心5分钟使细菌沉淀，然后将其重悬于浸润缓冲液(10mm2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，ph5.5和10mmmgso4)中至od600＝0.2。使用无针注射器将所得的细菌悬浮液过滤，通过小的刺孔浸润至完全展开的叶片中(huang和mason2004)。浸润后5天(dpi)收获植物组织。在b-100ap灯(uvp，upland，ca)产生的uv照射下，对产生gfp的叶片拍照。d.gfp分析使用提取缓冲液(25mm磷酸钠缓冲液，ph6.6、100mmnacl、1mmedta，0.05％tritonx-100、50mm抗坏血酸钠和10μg/ml亮抑酶肽(leupeptin))使用fastprep机器(bio101)在2-3dpi时从收获的叶片样本中提取总蛋白。通过以13,000g离心10分钟获得澄清的上清液。使用bradford试剂以牛血清白蛋白(bsa)为参考标准来测定叶片样本中的蛋白浓度。在酶标仪(moleculardeviceco，spectramaxm2)上检查gfp荧光强度。通过用磷酸盐缓冲盐水(pbs，137mmnacl，2.6mmkcl，10mmna2hpo4和1.8mmkh2po4，ph7.4)连续2倍稀释来制备gfp样本，并将每个样本50μl加入黑壁96中孔板(corning)，一式两份。激发和发射波长分别为485nm和538nm。所有测量均在室温下进行，并在作图前减去阴性对照(未浸润的植物叶片的提取物)的读数。大肠杆菌表达的gfp用于产生标准曲线。组氨酸标签的gfp基因克隆到pet28表达载体(invitrogen)中，并将其引入到大肠杆菌bl21(de3)菌株中，并使用talon组氨酸-标签纯化树脂纯化iptg诱导的gfp。还通过sds-page分析了gfp生产。简而言之，将来自3dpi的澄清的植物蛋白提取物与样本缓冲液(50mmtris-hcl，ph6.8、2％sds，10％甘油，0.02％溴酚蓝)混合，并在4-15％聚丙烯酰胺凝胶上分离gfp条带在uv照射(365nm)下可视，并使用imagej软件定量条带强度。e.nvcpelisa通过nvcp夹心elisa(mason等人1996)，分析如上所述制备和标准化的总叶片蛋白提取物。简而言之，兔多克隆抗-nvcp和豚鼠多克隆抗-nvcp分别用作捕获和检测抗体。昆虫细胞衍生的重组nvcp(jiang等人，1992)用作参考标准。f.gus活性分析如francis和spiker(2005)所述测量gus活性。简而言之，用1mlgus提取缓冲液(150mm磷酸钠ph7.0、10mmedta，10mmβ-巯基乙醇，0.1％tritonx-100、0.1％肌醇，10μg/ml的亮抑酶肽)，在2dpi时，使用fastprep机器(bio101)从100mg叶片组织中提取总叶片蛋白。将澄清的提取物(10μl)与130μl分析缓冲液(gus提取缓冲液含有1.2mm4-甲基-伞型基(umbelliferyl)-β-d-葡萄糖醛酸苷(glucuronide)(mug)(sigma(r))在黑暗的37℃温箱中孵育20分钟。通过将10μl反应物转移到黑壁96孔板中的190μl终止缓冲液(200mm碳酸钠)中来终止反应。在spectramaxm2酶标仪(moleculardevices)上以355nm激发的荧光在460nm测量。在每个板上使用50、25、5、2.5、0.5、0.25和0μm4-甲基伞形酮(mu)生成标准曲线。将荧光值转换为mu/分钟的摩尔，然后使用bsa作为参考标准，通过bio-radrcdc蛋白分析试剂盒根据试剂盒说明对确定的蛋白浓度进行标准化。g.rna提取和定量pcr使用植物rna试剂(invitrogen)在2dpi时从浸润的烟草叶片中纯化总rna，并通过dnafree系统(ambion)去除残留的dna。根据制造商的规程，使用superscriptiii第一链合成系统(first-strandsynthesissystem)(invitrogen)从lμg的总rna和寡dt22引物中合成第一链cdna。使用基因特异性引物(gfp-f和gfp-r用于gfp；snv-f和snv-f用于nvcp)和客户定制的taqmanfam/mgb探针(gfp-p和snv-p，integrateddnatechnologies)，在iq5实时pcr检测系统(iq5real-timepcrdetectionsystem)(bio-rad)上对每个目标转录本进行实时pcr。对于每个目标转录本和内部参考基因以一式三份地测量每个样本。延伸因子(ef1a)转录本用作内部对照(使用引物eff和efr和探针efp，integrateddnatechnologies)。分别用质粒pby027、psnv210和pcr4-topo-ef1a制备的单独的标准曲线对gfp、nvcp和ef1a的转录水平进行定量。如下获得构建体pcr4-topo-ef1a。使用ef1f和ef1r引物从野生型本氏烟草rna的cdna进行rt-pcr，该引物可扩增ef1a基因的119bp片段(nt167-285)(登录号ay206004)。将扩增的产物克隆到pcr克隆载体pcr4-topo(invitrogen)中。gfp和nvcp转录本的相对量针对ef1a转录本进行标准化。h.ext基因的序列比对植物ext基因终止子的核苷酸序列获自genbank。本氏烟草ext核苷酸序列获自索尔基因组网络(bombarely等人，2012)。使用在线程序clustalomega进行比对。i.通读pcr用随机引物从上述1μg总rna合成第一链cdna。进行pcr以评估使用四组引物的gfp和nvcp转录本的转录通读。对于gfp转录本，对gfp基因特异的正向引物(gfp-3f)与四个反向引物rt-0、rt-1、rt-2和rt-3(分别位于表达载体上的ecori位点下游42、156、291和389)之一分别进行配对。对于nvcp转录本，将nvcp特异性正义引物snv-3f与用于gfp转录本测试的相同四个反义引物进行配对。j.通过环化rt-pcr分析转录本3'末端如所描述的进行了环化rt-pcr，并进行了修饰(slomovic和schuster2013)。使用rneasy植物小试剂盒(plantminikit)在浸润后4天从本氏烟草的叶片中纯化总rna。环化之前，在总体积为50μl的缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.8，10mm(nh4)2so4，10mmkc1，2mmmgso4、0.1％tritonx-100)中，用25u的rna5'焦磷酸水解酶(neb)和40urnaseoutrna抑制剂(invitrogen)在37℃下放置1小时，将5μg总rna进行脱帽。通过加入1μl的500mmedta，并加热至65℃持续5分钟来终止反应。使用离心柱纯化脱帽的rna。然后，在总体积为20μl的缓冲液(50mmtris-hcl，ph7.5，10mmmgcl2，1mmdtt，10％peg8000，50μmatp)中，使用10ut4rna连接酶(neb)和40urnaseout以25℃进行1.5小时，使rna得到环化。通过煮沸2分钟来终止反应。使用superscriptiii第一链合成系统根据制造商的规程使用引物gfp-r1从纯化的环化rna中合成第一链cdna，该引物以相反方向结合gfpmrna的5'末端附近。对获得的cdna通过标准程序进行pcr。使用不同的引物扩增gfpmrna的融合的3'和5'末端：正向引物gfp-f1与gfp基因的3'末端结合，反向引物gfp-r2与gfp基因的5'末端结合，其被设计为特异性扩增源自环化转录本的cdna产物。按照建议，还使用引物gfp-r2和gfp-f2进行第二轮pcr以提高特异性(slomovic和schuster2013)。使用mrna中存在的天然saci-xhoi位点来克隆pcr产物，并随机选择14个阳性克隆并测序。k.蛋白提取和荧光分析通过用1：5(w：v)冰冷提取缓冲液(25mm磷酸钠，ph7.4、100mmnacl、1mmedta、0.1％tritonx-100、10mg/ml抗坏血酸钠、0.3mg/mlpmsf)，使用bulletblender机器(nextadvance，averillpark，ny)按照制造商的说明使用，通过均质化农杆菌浸润的叶片样本获得总蛋白提取物。为了提高溶解度，将均质化的样本在室温或4℃下进行端对端(end-over-end)混合30分钟。通过在4℃下以13,000离心10分钟来澄清粗植物提取物。使用bradford蛋白测定试剂盒以牛血清白蛋白为标准，测量澄清的叶片提取物的蛋白浓度。对于sds-page，将澄清的植物蛋白提取物与样本缓冲液混合，该缓冲液的最终浓度为50mmtris-hcl，ph6.8、2％sds、10％甘油、0.02％溴酚蓝、并在4-15％聚丙烯酰胺凝胶上分离对于gfp或dsred荧光，在uv光照(365nm)下观察page凝胶，并使用考马斯染色按照制造商的说明进行染色。使用imagej软件分析对应于gfp或dsred的荧光条带，使用天然植物蛋白条带作为内部上样对照定量条带强度。i.sds-page和蛋白印迹将澄清的植物蛋白提取物与样本缓冲液(50mmtris-hcl、ph6.8、2％sds、10％甘油、0.5mdtt、0.02％溴酚蓝)混合，煮沸10分钟，然后在4-15％聚丙烯酰胺凝胶(bio-rad)上分离。按照制造商的说明，将聚丙烯酰胺凝胶或者转移到pvdf膜上或用考马斯染色(bio-rad)染色。对于gii.4诺如病毒衣壳检测，将蛋白转移膜在pbst(含0.05％tween-20的pbs)中用5％奶粉(drymilk)在37℃下放置1h进行封闭，接着用以1∶5000稀释在1％pbstm中的多克隆兔抗gii.4[44]进行探测，接着以1∶5000稀释在1％pbstm中的山羊抗兔igg抗体-辣根过氧化物酶偶联物(sigma)进行探测。用ecl试剂(amersham)检测结合的抗体。m.elisa进行蛋白定量通过夹心elisa分析诺如病毒衣壳生产。将兔多克隆抗-gi或抗-gii抗体结合至96孔高结合聚苯乙烯板(corning)，并用pbst中的5％脱脂奶粉封闭这些板。用pbst(含0.05％tween20的pbs)洗涤孔后，加入植物提取物并孵育。通过与豚鼠多克隆抗-gi或抗-gii抗体一起孵育，然后与山羊抗-豚鼠igg抗体-辣根过氧化物酶偶联物(sigma)孵育，检测结合的诺如病毒衣壳。用tmb底物(pierce)显影该板，并在450nm读取吸光度。使用植物-生产的gi或gii衣壳作为参考标准(kentuckybioprocessing)。参考文献·alis，taylorwc(2001)the3′non-codingregionofac4photosynthesisgeneincreasestransgeneexpressionwhencombinedwithheterologouspromotersplantmolbiol46：325-333·allen，e.，andhowell，m.d.(2010).mirnasinthebiogenesisoftrans-actingsirnasinhigherplants.semin.celldev.biol.21，798-804.doi：10.1016/j.semcdb.2010.03.008.·allen，g.c.，hall，g.，michalowski，s.，newman，w.，spiker，s.，weissinger，a.k.，etal.(1996).high-leveltransgeneexpressioninplantcells：effectsofastrongscaffoldattachmentregionfromtobacco.plantcell8，899-913.doi：10.1105/tpc.8.5.899.arntzencj(2008)plantscience.usingtobaccototreatcancerscience321：1052-1053doi：10.1126/science.1163420·andersen，p.k.，lykke-andersen，s.，andjensen，t.h.(2012).promoter-proximalpolyadenylationsitesreducetranscriptionactivity.genesdev.26，2169-2179.doi：10.1101/gad.189126.112.·baegk，iwakawah，tomariy(2017)thepoly(a)tailblocksrdr6fromconvertingselfmrnasintosubstratesforgenesilencing.natplants3：17036.doi：10.1038/nplants.2017.36·béclin，c.，boutet，s.，waterhouse，p.，andvaucheret，h.(2002).abranchedpathwayfortransgene-inducedrnasilencinginplants.curt.biol.12，684-688.doi：10.1016/s0960-9822(02)00792-3.·beyeneg，buenrostro-navamt，damajmb，gaos-j，molinaj，mirkovte(2010)unprecedentedenhancementoftransientgeneexpressionfromminimalcassettesusingadoubleterminatorplantcellreports30：13-25doi：10.1007/s00299-010-0936-3·bombarelya，roslihg，vrebalovj，moffettp，muellerla，martingb(2012)adraftgenomesequenceofnicotianabenthamianatoenhancemolecularplant-microbebiologyresearch.molplant-microbeinteract25：1523-1530.doi：10.1094/mpmi-06-12-0148-ta·calikowski，t.t.，meulia，t.，andmeier，i.(2003).aproteomicstudyofthearabidopsisnuclearmatrix.j.cell.biochem.90，361-78.doi：10.1002/jcb.10624.·carringtonjc，freeddd，leinickeaj(1991)bipartitesignalsequencemediatesnucleartranslocationoftheplantpotyviralniaproteintheplantcell3：953doi：10.2307/3869157·chen，q.，anddavis，k.r.(2016).thepotentialofplantsasasystemforthedevelopmentandproductionofhumanbiologics.f1000research5，912.doi：10.12688/f1000research.8010.1.·chen，q.，dent，m.，hurtado，j.，stahnke，j.，mcnulty，a.，leuzinger，k.，etal.(2016).transientproteinexpressionbyagroinfiltrationinlettuce.methodsmol.biol.1385，55-67.doi：10.1007/978-1-4939-3289-4_4.·chungbyw，simonsc，firthae，browncm，hellensrp(2006)bmcgenomics7：120doi：10.1186/1471-2164-7-120·collensji，masonhs，curtiswr(2007)agrobacterium-mediatedviralvector-amplifiedtransientgeneexpressioninnicotianaglutinosaplanttissueculturebiotechnolprog23：570-576doi：10.1021/bp060342u·collensji，masonhs，curtiswr(2008)agrobacterium-mediatedviralvector-amplifiedtransientgeneexpressioninnicotianaglutinosaplanttissueculturebiotechnologyprogress23：570-576doi：10.1021/bp060342u·d'aoust，m.-a.，couture，m.m.-j.，charland，n.，trépanier，s.，landry，n.，ors，f.，etal.(2010).theproductionofhemagglutinin-basedvirus-likeparticlesinplants：arapid，efficientandsaferesponsetopandemicinfluenza.plantbiotechnol.j.8，607-19.doi：10.1111/j.1467-7652.2009.00496.x.·diamosag，rosenthalsh，masonhs(2016)5′and3′untranslatedregionsstronglyenhanceperformanceofgeminiviralrepliconsinnicotianabenthamianaleavesfrontiersinplantscience7doi：10.3389/fpls.2016.00200·donghetal.(2007)anexplorationof3′-endprocessingsignalsandtheirtissuedistributioninoryzasativagene389：107-113doi：10.1016/j.gene.2006.10.015·fan，q.，treder，k.，andmiller，w.a.(2012).untranslatedregionsofdiverseplantviralrnasvarygreatlyintranslationenhancementefficiency.bmcbiotechnol.12，22.doi：10.1186/1472-6750-12-22.·fernandez-pozo，n.，menda，n.，edwards，j.d.，saha，s.，tecle，i.y.，strickler，s.r.，etal.(2015).thesolgenomicsnetwork(sgn)--fromgenotypetophenotypetobreeding.nucleicacidsres.43，d1036-41.doi：10.1093/nar/gku1195.·fox，j.l.(2012).firstplant-madebiologicapproved.nat.biotechnol.30，472-472.doi：10.1038/nbt0612-472.franciske，spikers(2004)identificationofarabidopsisthalianatransformantswithoutselectionrevealsahighoccurrenceofsilencedt-dnaintegrationstheplantjournal41：464-477doi：10.1111/j.1365-313x.2004.02312.x·gilmartingm(2005)eukaryoticmrna3′processing：acommonmeanstodifferentendsgenes&development19：2517-2521doi：10.1101/gad.1378105·glebayy，tuséd，giritcha(2014)plantviralvectorsfordeliverybyagrobacterium.in：currenttopicsinmicrobiologyandimmunology.pp155-192graynk，hentzemw(1994)regulationofproteinsynthesisbymrnastructuremolecularbiologyreports19：195-200doi：10.1007/bf00986961·halweg，c.(2005).therb7matrixattachmentregionincreasesthelikelihoodandmagnitudeoftransgeneexpressionintobaccocells：aflowcytometricstudy.plantcellonline17，418-429.doi：10.1105/tpc.104.028100.·hiatt，a.，bohorova，n.，bohorov，o.，goodman，c.，kim，d.，pauly，m.h.，etal.(2014).glycanvariantsofarespiratorysyncytialvirusantibodywithenhancedeffectorfunctionandinvivoefficacy.proc.natl.acad.sci.111，5992-5997.doi：10.1073/pnas.1402458111.·horik，watanabey(2007)contextanalysisofterminationcodonsinmrnathatarerecognizedbyplantnmd.plantcellphysiol48：1072-8.doi：10.1093/pcp/pcm075·hirsingerc，parmentiery，durra，fleckj，jamete(1997)plantmolecularbiology33：279-289doi：10.1023/a：1005738815383·huangz，masonhs(2004)conformationalanalysisofhepatitisbsurfaceantigenfusionsinanagrobacterium-mediatedtransientexpressionsystemplantbiotechnologyjournal2：241-249doi：10.1111/j.1467-7652.2004.00068.x·huang，z.，chen，q.，hjelm，b.，arntzen，c.，andmason，h.(2009).adnarepliconsystemforrapidhigh-levelproductionofvirus-likeparticlesinplants.biotechnol.bioeng.103，706-714.doi：10.1002/bit.22299.·huang，z.，phoolcharoen，w.，lai，h.，piensook，k.，cardineau，g.，zeitlin，l.，etal.(2010).high-levelrapidproductionoffull-sizemonoclonalantibodiesinplantsbyasingle-vectordnarepliconsystem.biotechnol.bioeng.106，9-17.doi：10.1002/bit.22652.·huntag(2008)messengerrna3'endformationinplants.curr.top.microbiol.immunol.326：151-177doi：10.1007/978-3-540-76776-3_9·ingelbrechtlw，hermanlmf，dekeyserra，montagumcvan，depickerag(1989)different3'endregionsstronglylnfluencethelevelofgeneexpressioninplantcells.plantcell1：671-680doi：10.1105/tpc.1.7.671·jig，zhengj，sheny，wux，jiangr，liny，lokejc，daviskm，reesegj，liqq(2007)predictivemodelingofplantmessengerrnapolyadenylationsites.bmcbioinformatics8：43.doi：10.1186/1471-2105-8-43·ji，l.，xu，r.，lu，l.，zhang，j.，yang，g.，huang，j.，etal.(2013).tm6，anovelnuclearmatrixattachmentregion，enhancesitsflankinggeneexpressionthroughinfluencingtheirchromatinstructure.mol.cells36，127-137.doi：10.1007/s10059-013-0092-z.·jiangx，wangm，grahamdy，estesmk(1992)expression，self-assembly，andantigenicityofthenorwalkviruscapsidproteinjvirol66：6527-6532·katoh，xieg，satoy，imair(2010)isolationofanther-specificgenepromoterssuitablefortransgeneexpressioninrice.plantmolbiolreport28：381-387.doi：10.1007/s11105-009-0162-8·kertészs，kerényiz，méraiz，bartosi，pálfyt，bartae，silhavyd(2006)bothintronsandlong3′-utrsoperateascis-actingelementstotriggernonsense-mediateddecayinplantsnucleicacidsresearch34：6147-6157doi：10.1093/nar/gk1737·komarova，t.v，baschiefi，s.，donini，m.，marusic，c.，benvenuto，e.，anddorokhov，y.l.(2010).transientexpressionsystemsforplant-derivedbiopharmaceuticals.expertrev.vaccines9，859-876.doi：10.1586/erv.10.85.·kooikerm，airoldica，losaa，manzottips，finzil，katermm，colombol(2005)basicpentacysteine1，agabindingproteinthatinducesconformationalchangesintheregulatoryregionofthehomeoticarabidopsisgeneseedstick.plantcell17：722-729.doi：10.1105/tpc.104.030130·lacroix，b.，loyter，a.，andcitovsky，v.(2008).associationoftheagrobacteriumt-dna-proteincomplexwithplantnucleosomes.proc.natl.acad.sci.105，15429-15434.doi：10.1073/pnas.0805641105.·lai，h.，he，j.，engle，m.，diamond，m.s.，andchen，q.(2012).robustproductionofvirus-likeparticlesandmonoclonalantibodieswithgeminiviralrepliconvectorsinlettuce.plantbiotechnol.j.10，95-104.doi：10.1111/j.1467-7652.2011.00649.x.·librid，dowerk，boulayj，thomsenr，rosbashm，jensenth(2002)interactionsbetweenmrnaexportcommitment，3`-endqualitycontrol，andnucleardegradation.molcellbiol22：8254-8266.doi：10.1128/mcb.22.23.8254-8266.2002·liebich，i.，bode，j.，reuter，i.，andwingender，e.(2002).evaluationofsequencemotifsfoundinscaffold/matrix-attachedregions(s/mars).nucleicacidsres.30，3433-3442.doi：10.1093/nar/gkf446.·limkul，j.，misaki，r.，kato，k.，andfujiyama，k.(2015).thecombinationofplanttranslationalenhancersandterminatorincreasetheexpressionofhumanglucocerebrosidaseinnicotianabenthamianaplants.plantsci.240，41-49.doi：10.1016/j.plantsci.2015.08.018.·lokejc(2005)compilationofmrnapolyadenylationsignalsinarabidopsisrevealedanewsignalelementandpotentialsecondarystructures.plantphysiol138：1457-1468.doi：10.1104/pp.105.060541·lomonossoffgp，d'aoustm-a(2016)plant-producedbiopharmaceuticals：acaseoftechnicaldevelopmentsdrivingclinicaldeployment.science353：1237-40.doi：10.1126/science.aaf6638·luoz，chenz(2007)improperlyterminated，unpolyadenylatedmrnaofsensetransgenesistargetedbyrdr6-mediatedrnasilencinginarabidopsis.plantcell19：943-58.doi：10.1105/tpc.106.045724·lyon，g.m.，mehta，a.k.，varkey，j.b.，brantly，k.，plyler，l.，mcelroy，a.k.，etal.(2014).clinicalcareoftwopatientswithebolavirusdiseaseintheunitedstates.n.engl.j.med.371，2402-2409.doi：10.1056/nejmoa1409838.·macfarlane，s.a.，gilmer，d.，anddavies，j.w.(1992).efficientinoculationwithcamv35spromoter-drivendnaclonesofthetobraviruspebv.virology187，829-831.doi：10.1016/0042-6822(92)90488-b.·mandelcr，baiy，tongl(2007)proteinfactorsinpre-mrna3′-endprocessingcellularandmolecularlifesciences65：1099-1122doi：10.1007/s00018-007-7474-3·mankin，s.l.，allen，g.c.，phelan，t.，spiker，s.，andthompson，w.f.(2003).elevationoftransgeneexpressionlevelbyflankingmatrixattachmentregions(mar)ispromoterdependent：astudyoftheinteractionsofsixpromoterswiththerb73'mar.transgenicres12，3-12.availableat：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12650520.·mapendanock，lykke-andersens，kjemsj，bertrande，jensenth(2010)crosstalkbetweenmrna3′endprocessingandtranscriptioninitiationmolecularcell40：410-422doi：10.1016/j.molcel.2010.10.012·masonhs，balljm，shijj，jiangx，estesmk，amtzencj(1996)expressionofnorwalkviruscapsidproteinintransgenictobaccoandpotatoanditsoralimmunogenicityinmiceproceedingsofthenationalacademyofsciences93：5335-5340doi：10.1073/pnas.93.11.5335·masonhs，richterlj，thanavalay，arntzencj(2000)naturebiotechnology18：1167-1171doi：10.1038/81153·mathewlg，maloneyb，takedan，masonhs(2011)spuriouspolyadenylationofnorovirusnarita104capsidproteinmrnaintransgenicplantsplantmolecularbiology75：263-275doi：10.1007/s11103-010-9725-1·menossim，rabanedaf，puigdomenechp，martinez-izquierdoja(2003)analysisofregulatoryelementsofthepromoterandthe3′untranslatedregionofthemaizehrgpgenecodingforacellwallproteinplantcellrep21：916-923doi：10.1007/s00299-003-0602-0·meshcheriakova，y.a.，saxena，p.，andlomonossoff，g.p.(2014).fine-tuninglevelsofheterologousgeneexpressioninplantsbyorthogonalvariationoftheuntranslatedregionsofanonreplicatingtransientexpressionsystem.plantbiotechnol.j.12，718-727.doi：10.1111/pbi.12175.·millevois，vagners(2009)molecularmechanismsofeukaryoticpre-mrna3′endprocessingregulationnucleicacidsresearch38：2757-2774doi：10.1093/nar/gkp1176·mogenbd，macdonaldmh，grayboschr，huntag(1990)upstreamsequencesotherthanaauaaaarerequiredforefficientmessengerrna3′-endformationinplantstheplantcell2：1261doi：10.2307/3869344·mlynárová，l.，hricová，a.，loonen，a.，andnap，j.-p.(2003).thepresenceofachromatinboundaryappearstoshieldatransgeneintobaccofromrnasilencing.plantcell15，2203-17.doi：10.1105/tpc.012070.·mooremj，proudfootnj(2009)pre-mrnaprocessingreachesbacktotranscriptionandaheadtotranslationcell136：688-700doi：10.1016/j.cell.2009.02.001·motts，moony-s，palmerke，masonhs(2002)geminivirusvectorsforhigh-levelexpressionofforeignproteinsinplantcellsbiotechnologyandbioengineering81：430-437doi：10.1002/bit.10483·nagayas，kawamurak，shinmyoa，katok(2009)thehspterminatorofarabidopsisthalianaincreasesgeneexpressioninplantcellsplantandcellphysiology51：328-332doi：10.1093/pcp/pcp188·nandi，s.，kwong，a.t.，holtz，b.r.，erwin，r.l.，marcel，s.，andmcdonald，k.a.(2016).techno-economicanalysisofatransientplant-basedplatformformonoclonalantibodyproduction.mabs8，1456-1466.doi：10.1080/19420862.2016.1227901.·narsair，howellka，millarah，o'toolen，smalli，whelanj(2007)genome-wideanalysisofmrnadecayratesandtheirdeterminantsinarabidopsisthaliana.plantcellonline19：3418-3436.doi：10.1105/tpc.107.055046·olinger，g.g.，pettitt，j.，kim，d.，working，c.，bohorov，o.，bratcher，b.，etal.(2012).delayedtreatmentofebolavirusinfectionwithplant-derivedmonoclonalantibodiesprovidesprotectioninrhesusmacaques.proc.natl.acad.sci.u.s.a.109，18030-5.doi：10.1073/pnas.1213709109.·pietrzak，m.，shillito，r.d.，hohn，t.，andpotrykus，i.(1986).expressioninplantsoftwobacterialantibioticresistancegenesafterprotoplasttransformationwithanewplantexpressionvector.nucleicacidsres.14，5857-5868.doi：10.1093/nar/14.14.5857.·qin，c.，shi，n.，gu，m.，zhang，h.，li，b.，shen，j.，etal.(2012).involvementofrdr6inshort-rangeintercellularrnasilencinginnicotianabenthamiana.sci.rep.2，467.doi：10.1038/step00467.·qiu，x.，wong，g.，audet，j.，bello，a.，fernando，l.，alimonti，j.b.，etal.(2014).reversionofadvancedebolavirusdiseaseinnonhumanprimateswithzmapp.nature514，47-53.doi：10.1038/nature13777.·qux，lykke-andersens，nassert，saguezc，bertrande，jensenth，moorec(2009)assemblyofanexport-competentmrnpisneededforefficientreleaseofthe3′-endprocessingcomplexafterpolyadenylationmolecularandcellularbiology29：5327-5338doi：10.1128/mcb.00468-09·que，q.，wang，h.y.，english，j.j.，andjorgensen，r.a.(1997).thefrequencyanddegreeofcosuppressionbysensechalconesynthasetransgenesaredependentontransgenepromoterstrengthandarereducedbyprematurenonsensecodonsinthetransgenecodingsequence.plantcell9，1357-1368.doi：10.1105/tpc.9.8.1357.·rethmeiern，seurinckj，vanmontagum，cornelissenm(1997)intron-mediatedenhancementoftransgeneexpressioninmaizeisanuclear，gene-dependentprocesstheplantjournal12：895-899doi：10.1046/j.1365-313x.1997.12040895.x·richter，l.j.，thanavala，y.，arntzen，c.j.，andmason，h.s.(2000).productionofhepatitisbsurfaceantigenintransgenicplantsfororalimmunization.nat.biotechnol.18，1167-71.doi：10.1038/81153.·roseab(2008)intron-mediatedregulationofgeneexpression.springerberlinheidelberg.doi：10.1007/978-3-540-76776-3_15·rosenthal，s.h.，diamos，a.g.，andmason，h.s.(2018).anintronlessformofthetobaccoextensingeneterminatorstronglyenhancestransientgeneexpressioninplantleaves.plantmol.biol.doi：10.1007/s11103-018-0708-y.·rothniehm(1996)plantmrna3？-endformationplantmolecularbiology32：43-61doi：10.1007/bf00039376·rothniehm，cheng，futtererj，hohnt(2001)polyadenylationinricetungrobacilliformvirus：cis-actingsignalsandregulationjournalofvirology75：4184-4194doi：10.1128/jvi.75.9.4184-4194.2001·sainsbury，f.，andlomonossoff，g.p.(2008).extremelyhigh-levelandrapidtransientproteinproductioninplantswithouttheuseofviralreplication.plantphysiol.148，1212-8.doi：10.1104/pp.108.126284.·sainsbury，f.，thuenemann，e.c.，andlomonossoff，g.p.(2009).peaq：versatileexpressionvectorsforeasyandquicktransientexpressionofheterologousproteinsinplants.plantbiotechnol.j.7，682-93.doi：10.1111/j.1467-7652.2009.00434.x.·sanfaconh，brodmannp，hohnt(1991)adissectionofthecauliflowermosaicviruspolyadenylationsignalgenes&development5：141-149doi：10.1101/gad.5.1.141·schubert，d.，lechtenberg，b.，forsbach，a.，gils，m.，bahadur，s.，andschmidt，r.(2004).silencinginarabidopsist-dnatransformants：thepredominantroleofagene-specificrnasensingmechanismversuspositioneffects.plantcell16，2561-72.doi：10.1105/tpc.104.024547.·sharmaak，sharmamk(2009)plantsasbioreactors：recentdevelopmentsandemergingopportunitiesbiotechnologyadvances27：811-832doi：10.1016/j.biotechadv.2009.06.004·sheldoncc，connab，dennises，peacockwj(2002)differentregulatoryregionsarerequiredforthevernalization-inducedrepressionoffloweringlocuscandfortheepigeneticmaintenanceofrepression.plantcellonline14：2527-2537.doi：10.1105/tpc.004564·showalteram，kepplerb，lichtenbergj，gud，welchlr(2010)abioinformaticsapproachtotheidentification，classification，andanalysisofhydroxyproline-richglycoproteinsplantphysiology153：485-513doi：10.1104/pp.110.156554·sieburthle，meyerowitzem(1997)moleculardissectionoftheagamouscontrolregionshowsthatciselementsforspatialregulationarelocatedintragenicallytheplantcell9：355doi：10.2307/3870487·simon，a.e.，andmiller，w.a.(2013).3'cap-independenttranslationenhancersofplantviruses.annu.rev.microbiol.67，21-42.doi：10.1146/annurev-micro-092412-155609.·singh，g.，pratt，g.，yeo，g.w.，andmoore，m.j.(2015).theclothesmakethemrna：pastandpresenttrendsinmrnpfashion.annu.rev.biochem.84，325-354.doi：10.1146/annurev-biochem-080111-092106.·slomovics，schusterg(2013)circularizedrt-pcr(crt-pcr).elsevier.doi：10.1016/b978-0-12-420037-1.00013-0·strasser，r.，altmann，f.，andsteinkellner，h.(2014).controlledglycosylationofplant-producedrecombinantproteins.curr.opin.biotechnol.30，95-100.doi：10.1016/j.copbio.2014.06.008.·streatfieldsj(2007)approachestoachievehigh-levelheterologousproteinproductioninplantsplantbiotechnologyjournal5：2-15doi：10.1111/j.1467-7652.2006.00216.x·tan-wongsm，wijayatilakehd，proudfootnj(2009)geneloopsfunctiontomaintaintranscriptionalmemorythroughinteractionwiththenuclearporecomplexgenes&development23：2610-2624doi：10.1101/gad.1823209·tan-wongsmetal.(2012)geneloopsenhancetranscriptionaldirectionalityscience338：671-675doi：10.1126/science.1224350·thanavalay，huangz，masonhs(2006)plant-derivedvaccines：alookbackatthehighlightsandaviewtothechallengesontheroadaheadexpertreviewofvaccines5：249-260doi：10.1586/14760584.5.2.249·tianb，manleyjl(2013)alternativecleavageandpolyadenylation：thelongandshortofittrendsinbiochemicalsciences38：312-320doi：10.1016/j.tibs.2013.03.005·tokuhisa，j.g.，singh，k.，dennis，e.s.，andpeacock，w.j.(1990).adna-bindingproteinfactorrecognizestwobindingdomainswithintheoctopinesynthaseenhancerelement.plantcell2，215.doi：10.2307/3869136.·toral，dantonelj-c，murthykgk，manleyjl(1997)nature389：399-402doi：10.1038/38763·tusé，d.，tu，t.，andmcdonald，k.a.(2014).manufacturingeconomicsofplant-madebiologics：casestudiesintherapeuticandindustrialenzymes.biomedres.int.2014，1-16.doi：10.1155/2014/256135.·wigington，c.p.，williams，k.r.，meers，m.p.，bassell，g.j.，andcorbett，a.h.(2014).poly(a)rna-bindingproteinsandpolyadenosinerna：newmembersandnovelfunctions.wileyinterdiscip.rev.rna5，601-622.doi：10.1002/wrna.1233.·wolterink-vanloo，s.，escamillaayala，a.a.，hooykaas，p.j.j.，andvanheusden，g.p.h.(2015).interactionoftheagrobacteriumtumefaciensvirulenceproteinvird2withhistones.microbiology161，401-10.doi：10.1099/mic.0.083410-0.·xinga，moonbp，millskm，falcosc，liz(2010)revealingfrequentalternativepolyadenylationandwidespreadlow-leveltranscriptionread-throughofnovelplanttranscriptionterminatorsplantbiotechnologyjournal8：772-782doi：10.1111/j.1467-7652.2010.00504.x·zhangx，masonh(2006)beanyellowdwarfvirusrepliconsforhigh-leveltransgeneexpressionintransgenicplantsandcellculturesbiotechnologyandbioengineering93：271-279doi：10.1002/bit.20695·zhang，j.，lu，l.，ji，l.，yang，g.，andzheng，c.(2009).functionalcharacterizationofatobaccomatrixattachmentregion-mediatedenhancementoftransgeneexpression.transgenicres.18，377-385.doi：10.1007/s11248-008-9230-3.·zhaoh，xingd，liqq(2009)uniquefeaturesofplantcleavageandpolyadenylationspecificityfactorrevealedbyproteomicstudies.plantphysiol151：1546-56.doi：10.1104/pp.109.142729·zhaoj，hymanl，moorec(1999)formationofmrna3′endsineukaryotes：mechanism，regulation，andinterrelationshipswithotherstepsinmrnasynthesismicrobiolmolbiolrev63：405-445·zhao，c.-p.，guo，x.，chen，s.-j.，li，c.-z.，yang，y.，zhang，j.-h.，etal.(2017).matrixattachmentregioncombinationsincreasetransgeneexpressionintransfectedchinesehamsterovarycells.sci.rep.7，42805.doi：10.1038/step42805.·zimran，a.，brill-almon，e.，chertkoff，r.，petakov，m.，blanco-favela，f.，munoz，e.t.，etal.(2011).pivotaltrialwithplantcell-expressedrecombinantglucocerebrosidase，taliglucerasealfa，anovelenzymereplacementtherapyforgaucherdisease.blood118，5767-5773.doi：10.1182/blood-2011-07-366955.序列表<110>亚利桑那州立大学董事会<120>用于在植物中生产重组蛋白的复制和非复制载体及其使用方法<130>11157-026pct<150>62/638,010<151>2018-03-02<160>117<170>patentinversion3.5<210>1<211>283<212>dna<213>人工序列<220><223>nos3'区域<400>1gagctcagatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccgg60tcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacat120gtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacat180ttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggt240gtcatctatgttactagatcggcgatcggggctgcaggaattc283<210>2<211>223<212>dna<213>人工序列<220><223>35s3'区域<400>2gagctcgtccgcaaaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctctatttttctc60cagaataatgtgtgagtagttcccagataagggaattagggttcttatagggtttcgctc120atgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatca180ataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtgacgaattc223<210>3<211>982<212>dna<213>人工序列<220><223>pinii3'区域<400>3gagctcgcccggggatcctctagagtaccctgcaatgtgaccctagacttgtccatcttc60tggattggccaagttaattaatgtatgaaataaaaggatgcacacatagtgacatgctaa120tcactataatgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactaattatctgaataag180agaaagagatcatccatatttcttatcctaaatgaatgtcacgtgtctttataattcttt240gatgaaccagatgcattttattaaccaattccatatacatataaatattaatcatatata300attaatatcaattgggttagcaaaacaaatctagtctaggtgtgttttgctaattattgg360gggatagtgcaaaaagaaatctacgttctcaataattcagatagaaaacttaataaagtg420agataatttacatagattgcttttatcctttgatatatgtgaaaccatgcatgatataag480gaaaatagatagagaaataattttttacatcgttgaatatgtaaacaatttaattcaaga540agctaggaatataaatattgaggagtttatgattattattattattttgatgttcaatga600agttttttttaatttcatatgaagtatacaaaaattcttcatagatttttgtttctatgc660cgtagttatctttaatatatttgtggttgaagaaatttattgctagaaacgaatggattg720tcaatttttttttaaagcaaatatatatgaaattatactgtatattattttagtcatgat780taaaatgtggccttaattgaatcatctttctcattcattttttcaaaagcatatcaggat840gattgatatttatctattttaaaaattaatttaagggttcaaattaaatttaacttaaaa900gtgtcctaaccgtagttaaaggtttactttaaaaaaatactatgaaaaatctaatcttct960atgaatcgacctgcaggaattc982<210>4<211>695<212>dna<213>人工序列<220><223>rbcs3'区域<400>4gagctcccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcggagctttcgttcgtatcatc60ggtttcgacaacgttcgtcaagttcaatgcatcagtttcattgcgcacacaccagaatcc120tactgagtttgagtattatggcattgggaaaactgtttttcttgtaccatttgttgtgct180tgtaatttactgtgttttttattcggttttcgctatcgaactgtgaaatggaaatggatg240gagaagagttaatgaatgatatggtccttttgttcattctcaaattaatattatttgttt300tttctcttatttgttgtgtgttgaatttgaaattataagagatatgcaaacattttgttt360tgagtaaaaatgtgtcaaatcgtggcctctaatgaccgaagttaatatgaggagtaaaac420acttgtagttgtaccattatgcttattcactaggcaacaaatatattttcagacctagaa480aagctgcaaatgttactgaatacaagtatgtcctcttgtgttttagacatttatgaactt540tcctttatgtaattttccagaatccttgtcagattctaatcattgctttataattatagt600tatactcatggatttgtagttgagtatgaaaatattttttaatgcattttatgacttgcc660aattgattgacaacatgcatcaagctatcgaattc695<210>5<211>743<212>dna<213>人工序列<220><223>无内含子的烟草延伸蛋白3'区域<400>5gagctcgaagtgacatcacaaagttgaaggtaataaagccaaattaattaagacattttc60ataatgatgtcaagaatgcaaagcaaattgcataactgcctttatgcaaaacattaatat120aatataaattataaagaactgcgctctctgcttcttattttcttagcttcatttattagt180cactagctgttcagaattttcagtatcttttgatattactaagaacctaatcacacaatg240tatattcttatgcaggaaaagcagaatgctgagctaaaagaaaggctttttccattttcg300agagacaatgagaaaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaaaagagtaaata360ataaagccccacaggaggcgaagttcttgtagctccatgttatctaagttattgatattg420tttgccctatattttatttctgtcattgtgtatgttttgttcagtttcgatctccttgca480aaatgcagagattatgagatgaataaactaagttatattattatacgtgttaatattctc540ctcctctctctagctagccttttgttttctctttttcttatttgattttctttaaatcaa600tccattttaggagagggccagggagtgatccagcaaaacatgaagattagaagaaacttc660cctcttttttttcctgaaaacaatttaacgtcgagatttatctctttttgtaatggaatc720atttctacagttatgacgaattc743<210>6<211>492<212>dna<213>人工序列<220><223>含有内含子的烟草延伸蛋白3'区域<400>6gagctcaaagcagaatgctgagctaaaagaaaggctttttccattttcgagagacaatga60gaaaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaaaagagtaaataataaagcccca120caggaggcgaagttcttgtagctccatgttatctaagttattgatattgtttgccctata180ttttatttctgtcattgtgtatgttttgttcagtttcgatctccttgcaaaatgcagaga240ttatgagatgaataaactaagttatattattatacgtgttaatattctcctcctctctct300agctagccttttgttttctctttttcttatttgattttctttaaatcaatccattttagg360agagggccagggagtgatccagcaaaacatgaagattagaagaaacttccctcttttttt420tcctgaaaacaatttaacgtcgagatttatctctttttgtaatggaatcatttctacagt480tatgacgaattc492<210>7<211>453<212>dna<213>人工序列<220><223>nbhsp3'区域<400>7gagctcactgaggaaatatatagacaaattaagtttggttctatgagttctaatttggac60ttaagagttgtttgaaattctattttatagtgatgcttataatgtatttggactgttttc120tgctgtgtgtaagaccttttggtctgtgaactggaaacatacatgaataaatttctttga180atttactggaatttttgcatcaacaaaagaaaaattgaagttactaacttgtaaatggaa240caattgtaatgttaaaggatataaatatcttaatatagtgcgatacgaatcacacgaatg300caagactttctctctctgctcccgctcatgctctcggtgcatgttagctaaatatacatc360ggtgcatccatggcaggagcatgaggacggggatgaggaagggagtgaggagggccaaaa420gaagtacacatagtttcctttgggagcgaattc453<210>8<211>1050<212>dna<213>人工序列<220><223>nbact3'区域<400>8gagctcatacagcattcccagaaagagaaacagaagaaatatacaaactttcattttgag60agcagcacctcgtctattgattgcagataatatgcttctcatttgtatttccttttgatt120atttttgtttctatccctttgtttgagtcaatctcaaatattcggtcattgttggtatga180aaaatcaagcagttcatgttaagagtcaatttaaaattaatatttttatatagagttgta240tgtgaaatgatgttgtgatttggtatatatggataaagagcttgtcagttcattttggtc300tcatttttttggtatccaaataagaaacacaaaagggatatgtccctctactatcaaata360ttagttataagtattcatgttatactattcgatattttctaccccaatcgttacctattt420aaaagtatttacccctccatctatcaaacccctggacccagctttcctattacatgtggc480ttcatcttaagcccccaaacctttttcttatttttgatttttaaaggctcatcttaaaat540ttattactcaaattaatacctcttaataacccacctcaaggacccagtaattaaatatcc600aattagctccagtaattggggttcatattagctccagtcttaaattttaaaggcgatgat660cgtattcctccacttggttcatttatactcaaagaatactcaatgtctttagtgtttaga720taactttttgtaaatcatatagattgttttaacaaaaaacaattcaatagtagattttca780catgaaagttacataaaaattctttaaaattactttctcaaaaaattgttccaaacatat840tatcccacaattaaactcaatctgtttttcgaaacctaaatcaaaaccaatccaactacc900ttatataatatataatcaatacattgtaaagaactgcatgttcttttaaattttgggggc960aaagttattccgtacgttcacacatgtactaataggaggtaataaatgatatgtgaaaca1020atcgaggtgtaaacaagctagcatgaattc1050<210>9<211>217<212>dna<213>人工序列<220><223>sir<400>9gaattccgagtgtacttcaagtcagttggaaatcaataaaatgattattttatgaatata60tttcattgtgcaagtagatagaaattacatatgttacataacacacgaaataaacaaaaa120aacacaatccaaaacaaacaccccaaacaaaataacactatatatatcctcgtatgagga180gaggcacgttcagtgactcgacgattcctaggccggc217<210>10<211>818<212>dna<213>人工序列<220><223>具有额外3'的sir<400>10gagctctaaaatgattattttatgaatatatttcattgtgcaagtagatagaaattacat60atgttacataacacacgaaataaacaaaaaaacacaatccaaaacaaacaccccaaacaa120aataacactatatatatcctcgtatgaggagaggcacgttcagtgactcgacgattcccg180agcaaaaaaagtctccccgtcacacatatagtgggtgacgcaattatcttcaaagtaatc240cttctgttgacttgtcattgataacatccagtcttcgtcaggattccaaagaattataga300agggatcccaccttttattttcttcttttttccatatttagggttgacagtgaaatcaga360ctggcaacctattaattgcttccacaatgggacgaacttgaaggggatgtcgtcgatgat420attataggtggcgtgttcatcgtagttggtgaagtcgatggtcccgttccagtagttgtg480tcgcccgagacttctagcccaggtggtctttccggtacgagttggtccgcagatgtagag540gctggggtgtctgaccccagtccttccctcatcctggttagatcggccatccactcaagg600tcagattgtgcttgatcgtaggagacaggatgtatgaaagtgtaggcatcgatgcttaca660tgatataggtgcgtctctctccagttgtgcagatcttcgtggcagcggagatctgattct720gtgaagggcgacacgtactgctcaggttgtggaggaaataatttgttggctgaatattcc780agccattgaagctttgttgcccattcatgagggaattc818<210>11<211>1237<212>dna<213>人工序列<220><223>具有5'和3'区域的sir<400>11gagctccatttcatttttggctggtgtacgacaagtctcctggtgctaatgttcccagta60ctggggatatatttgagggaccttcgttgtttcctcataatccttggacgtggactgtgt120ctagggctgcttgccatcgttttgtggtgaagaaaacgtggtcatgcgtggtggagagca180atggtattgacccaaccaaaggtcaaggagctacttattatgggcctgggccttgtaatc240aggttaagtcctgtaataagttctttaagagattgggtgtgtccacagagtggaaaaata300gtgcaacgggtgatgttggtgatataaaggaaggagccctttacattgttggtgctcctt360cccaaaagtccgatgtatatgtaaatggttatttccgagtgtacttcaagtcagttggaa420atcaataaaatgattattttatgaatatatttcattgtgcaagtagatagaaattacata480tgttacataacacacgaaataaacaaaaaaacacaatccaaaacaaacaccccaaacaaa540ataacactatatatatcctcgtatgaggagaggcacgttcagtgactcgacgattcccga600gcaaaaaaagtctccccgtcacacatatagtgggtgacgcaattatcttcaaagtaatcc660ttctgttgacttgtcattgataacatccagtcttcgtcaggattccaaagaattatagaa720gggatcccaccttttattttcttcttttttccatatttagggttgacagtgaaatcagac780tggcaacctattaattgcttccacaatgggacgaacttgaaggggatgtcgtcgatgata840ttataggtggcgtgttcatcgtagttggtgaagtcgatggtcccgttccagtagttgtgt900cgcccgagacttctagcccaggtggtctttccggtacgagttggtccgcagatgtagagg960ctggggtgtctgaccccagtccttccctcatcctggttagatcggccatccactcaaggt1020cagattgtgcttgatcgtaggagacaggatgtatgaaagtgtaggcatcgatgcttacat1080gatataggtgcgtctctctccagttgtgcagatcttcgtggcagcggagatctgattctg1140tgaagggcgacacgtactgctcaggttgtggaggaaataatttgttggctgaatattcca1200gccattgaagctttgttgcccattcatgagggaattc1237<210>12<211>513<212>dna<213>人工序列<220><223>bdb501<400>12gagctctgacaacatcagcaagaacgccctcctagtatattactgttggatgtcagatac60tatgtcaaaggcatctacttttgtatcgtttgaccttgattatatcggttgattaatgat120aattgtaataaaaagctattattgaactttcaattcctcaacaaagaaattattgcaacg180atttgggctgataagccttacagttactatttatacactcctggacagtgtttttcacta240gctcgtttaattgccccatcgacatagtaatgttggattccgctctctgggcccctacaa300ttgaggcagactcccctgggtctaagacgcttgttccaagcctgctgagatgcctatatg360gatgcattgcgttttccacctctgagtcggcatcggagttgctgagcccaattgtactcc420gtgaagcccatgattcacccggcttgatctctattgggcctggtagtccaatccttgaca480tggatgcgcatcttatgggtttcctttgaattc513<210>13<211>261<212>dna<213>人工序列<220><223>athsp3'区域<400>13gagctcatatgaagatgaagatgaaatatttggtgtgtcaaataaaaagcttgtgtgctt60aagtttgtgtttttttcttggcttgttgtgttatgaatttgtggctttttctaatatcaa120atgaatgtaagatctcattataatgaataaacaaatgtttctataatccattgtgaatgt180tttgttggatctcttctgcagcatataactactgtatgtgctatggtatggactatggaa240tatgattaaagataagaattc261<210>14<211>675<212>dna<213>人工序列<220><223>rep3'区域<400>14gagctctaataggttgccagtctgatttcactgtcaaccctaaatatggaaaaaagaaga60aaataaaaggtgggatcccttctataattctttggaatcctgacgaagactggatgttat120caatgacaagtcaacagaaggattactttgaagataattgcgtcacccactatatgtgtg180acggggagactttttttgctcgggaatcgtcgagtcactgaacgtgcctctcctcatacg240aggatatatatagtgttattttgtttggggtgtttgttttggattgtgtttttttgttta300tttcgtgtgttatgtaacatatgtaatttctatctacttgcacaatgaaatatattcata360aaataatcattttattgatttccaactgacttgaagtacactcggaaataaccatttaca420tatacatcggacttttgggaaggagcaccaacaatgtaaagggctccttcctttatatca480ccaacatcacccgttgcactatttttccactctgtggacacacccaatctcttaaagaac540ttattacaggacttaacctgattacaaggcccaggcccataataagtagctccttgacct600ttggttgggtcaataccattgctctccaccacgcatgaccacgttttcttcaccacaaaa660cgatggcaagaattc675<210>15<211>463<212>dna<213>人工序列<220><223>repa3'区域<400>15gagctctgaacgtgcctctcctcatacgaggatatatatagtgttattttgtttggggtg60tttgttttggattgtgtttttttgtttatttcgtgtgttatgtaacatatgtaatttcta120tctacttgcacaatgaaatatattcataaaataatcattttattgatttccaactgactt180gaagtacactcggaaataaccatttacatatacatcggacttttgggaaggagcaccaac240aatgtaaagggctccttcctttatatcaccaacatcacccgttgcactatttttccactc300tgtggacacacccaatctcttaaagaacttattacaggacttaacctgattacaaggccc360aggcccataataagtagctccttgacctttggttgggtcaataccattgctctccaccac420gcatgaccacgttttcttcaccacaaaacgatggcaagaattc463<210>16<211>1175<212>dna<213>人工序列<220><223>rb7mar<400>16gaattctcgattaaaaatcccaattatatttggtctaatttagtttggtattgagtaaaa60caaattcgaaccaaaccaaaatataaatatatagtttttatatatatgcctttaagactt120tttatagaattttctttaaaaaatatctagaaatatttgcgactcttctggcatgtaata180tttcgttaaatatgaagtgctccatttttattaactttaaataattggttgtacgatcac240tttcttatcaagtgttactaaaatgcgtcaatctctttgttcttccatattcatatgtca300aaatctatcaaaattcttatatatctttttcgaatttgaagtgaaatttcgataatttaa360aattaaatagaacatatcattatttaggtatcatattgatttttatacttaattactaaa420tttggttaactttgaaagtgtacatcaacgaaaaattagtcaaacgactaaaataaataa480atatcatgtgttattaagaaaattctcctataagaatattttaatagatcatatgtttgt540aaaaaaaattaatttttactaacacatatatttacttatcaaaaatttgacaaagtaaga600ttaaaataatattcatctaacaaaaaaaaaaccagaaaatgctgaaaacccggcaaaacc660gaaccaatccaaaccgatatagttggtttggtttgattttgatataaaccgaaccaactc720ggtccatttgcacccctaatcataatagctttaatatttcaagatattattaagttaacg780ttgtcaatatcctggaaattttgcaaaatgaatcaagcctatatggctgtaatatgaatt840taaaagcagctcgatgtggtggtaatatgtaatttacttgattctaaaaaaatatcccaa900gtattaataatttctgctaggaagaaggttagctacgatttacagcaaagccagaataca960aagaaccataaagtgattgaagctcgaaatatacgaaggaacaaatatttttaaaaaaat1020acgcaatgacttggaacaaaagaaagtgatatattttttgttcttaaacaagcatcccct1080ctaaagaatggcagttttcctttgcatgtaactattatgctcccttcgttacaaaaattt1140tggactactattgggaacttcttctgaaaatagtg1175<210>17<211>1211<212>dna<213>人工序列<220><223>tm6mar<400>17gaattcaggtaatatttagaaatttaattaacataaccaaggatttttatatcggtaata60actctaatatggtatccaaatcagtctagaactctcttacctctaataagtaaaagtact120tctaataaattcatatactttttctctcttctccgatctctctttgctcttctttttatg180tatcctttcctttctaatagccttttatgagaagtaaacttttagggttggccccccctc240cccccacaattatatagtttcttactcagttgttggaatataattcaaattcttaaataa300ttgacggtgacattgagttttactttgtggaagagaattagattctcgtgttagtaaaat360cggttagtaattgatgatgcattatttttactctataatagagatgcaattttatttttg420cattttgggatcaaattgtaatgcagtcatatattgatttcataaatgtttgggatattg480ttggttatttaactagaaatagacttcttatttcatatttattgttaaaatcctttattg540gagatgaattatttgttcaacgattagaagttgatagtcgcttttgttttagaagaaatt600ttaccgtagaccaagttaaggagttttagaagcactttgcatgggagcattagtgtatgt660tatggctttatcaaatataggttttgaagattcagagagccaagaaaagctagaacccaa720gaactaggaagttagagtaattcacaataccataacgtgatataaaactttttattgtaa780ctcaaatcggtaatattttttgctttagtcttaatcgataaattatttttttatattgat840tagttataggaggctcaaaaagttgggaataattaaaatatcatattttgtatttgaaca900atttatgaaatagtaattggtaaaaaatcactttaaatttttatcctatatccagaagga960ttatggtgtctggcatagttgtttggaagatttgaatcagggtaaaagtatgttgtaatt1020tttattttgttataggcattttttgtgcttgattgttttgttgtcattatattttattat1080ttggaagtgtatatatatgtttgattaaaatatagataatcaattttataagaaatttgc1140aacaattacaaaaggataaagtctacaatatgcgagtaaaatttgattgaacctaggatg1200tccctgaattc1211<210>18<211>881<212>dna<213>人工序列<220><223>bydv3'区域<400>18ggtaccagtgaagacaacaccactagcacaaatcggatcctgggaaacaggcagaacttc60ggttcataagctcgggtaggctgtcaacctaccgccgtatcgtattgtgtttggccgatg120gaggatcttcacgttatcgccgtttgtattcttgccttgactgtgctctctggggtaggc180gctgttttgagttgctgccgttggtgctgcagcaatccttttcctccctccctctcttct240gtttaagcaaaagactctcgatctgtgcgagagacaatcaaaaatatcgagggagcttcg300gctcagtgaggggattaacgacccccagtaatggccggtcctggcggacataaataaccc360gctataggacgaagtggtagccaccactgatcaaatggcaaacatgcttctgtgttgtac420actgccccggagcctaccgggtcaacaaggctatcccaccaacccgatgaaatgagggtg480gagtgagcggagtgggtgacttcgtgatgtacacccgatcgtcaggattgaagacgttaa540aactcgacgacctggtacaagtcgttaaactgactcgggtggatacaccacacccggccc600agcatgttggcatacccacgatacgaaacgtgggtctcttggagccactacctgtgatgc660aaggtagggtatgagtcttagcaagctctgagccaggagatggacataaaccatagcaat720ccaacgtgtaaccgcaatggggcaaacaacaggtgaaccgtgtccacgggcctggttacc780gaaaggaaagccagtatccaacacagcaatgtgttgggggtcacaccctcggggtactct840taacgctgacactcgaaagagcagttcggcaacccgagctc881<210>19<211>246<212>dna<213>人工序列<220><223>tnvd3'区域<400>19ggtaccttgctttcatagatccgtcttcccagagacgttaagaagaagctggagaaaaat60attaggttagaagcttgggcgtgacaaacccaagttgcatctcttacgtggttaatcaca120ctgtatgttgacgtacaagccggatcctgggaaacaggtttaacggctcactgtggtggt180gggccgtcgatacacttgtatgtgccccaatattggttgtcgagatctctctaggaaccc240gagctc246<210>20<211>710<212>dna<213>人工序列<220><223>pemv3'区域<400>20ggcttcgcttcccgccggaagaccgcggcggttctgttcctcccacaggagtacggcaac60aacccaccttgggaaagtggggaccccagcactaactcctttaactaggcgggcgtgttg120gttacagtaggaggggacagtgcgcatcgaaactgagccccaccacaactctcatccacg180gggtggttgggacgcaggtgtcggagggatcgccagccctcaggatagtgagctcccgca240gagggataagctatctccctgcgacgtagtggtagaacacgtgggataggggatgacctt300gtcgaccggttatcggtcccctgctccttcgagctggcaaggcgctcacaggttctacac360tgctactaaagttggtggtggatgtctcgcccaaaaagatcacaaacgcgcgggacaagg420tcccttccaccttcgccgggtaaggctagagtcagcgctgcatgactataacttgcggcc480gatccagttgcacgactggtggtccccctcagtgtctcggttgtctgccgagtgggcggt540ggtcggattccaccacaccctgccacgaggtgcgtggagacttggccagtctaggctcgt600cgtaattagttgcagcgacgttaatcaacccgtccgggcatataataggaccggttgtgc660ttcttcctcccttcttagccaggtggttacctccctggcgcccgggtacc710<210>21<211>215<212>dna<213>人工序列<220><223>tmv3'区域<400>21ggtaccggtagtcaagatgcataataaataacggattgtgtccgtaatcacacgtggtgc60gtacgataacgcatagtgtttttccctccacttaaatcgaagggttgtgtcttggatcgc120gcgggtcaaatgtatatggttcatatacatccgcaggcacgtaataaagcgaggggttcg180aatccccccgttacccccggtaggggcccagagct215<210>22<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>22gttgttgttgttgttgttttgtgatgtttgaacgatcgggg41<210>23<211>47<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>23caacaacaacaacaacaaaacattggcaataaagtttcttaagattg47<210>24<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>24tgttttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttttgtg44<210>25<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>25cacaaaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaaaaca44<210>26<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>26gtgagctcgtccgcaaaaatcaccag26<210>27<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>27cagaattcgtcactggattttggttttagg30<210>28<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>28cgctgtgctgccgtgccttttttttttttttttttt36<210>29<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>29cgctgtgctgccgtgcctt19<210>30<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>30ggctttattatttaattgtctctcgaaaatgg32<210>31<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>31tcgagagacaattaaataataaagccccacag32<210>32<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>32ctggtggttttgaagctggta21<210>33<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>33cacgcattgcttgctttcaccct23<210>34<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>34ggtggtagcatccatcttgtt21<210>35<211>46<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>35atcatcatcatcatcaattcacattgtctctcgaaaatggaaaaag46<210>36<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>36gatgatgatgatgatgaattgtgtaaataataaagccccacagg44<210>37<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>37gtgagctcgaagtgacatcacaaagttgaag31<210>38<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>38cagaattcgtcataactgtagaaatgattcc31<210>39<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>39gtgagctcaaagcagaatgctgagcta27<210>40<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>40cagaattcggctagctagagagaggaggagaat33<210>41<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>41cagaattcgaaactgaacaaaacatacacaatgacag37<210>42<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>42tgcgagctcctgcataagaatatacattgtgtg33<210>43<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>43atggtcctgctggagttcgtgacc24<210>44<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>44gtccaggagcgcaccatcttct22<210>45<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>45cgggtcttgtagttgccgtcgtccttg27<210>46<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>46gatgcccttcagctcgatgcggtt24<210>47<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>47gtcctgctggagttcgtgacc21<210>48<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>48gcatggacgagctgtacaagtaagagc27<210>49<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>49cgtttacgtcgccgtccagc20<210>50<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>50ctcgcccttgctcaccattgttc23<210>51<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>51gtctcgagaacaatgttacgtcctgtagaaacc33<210>52<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>52acgagctctcattgtttgcctccctgc27<210>53<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>53ttcttcttcttcttcttttctcatgtttgaacgatcgggg40<210>54<211>47<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>54gaagaagaagaagaagaaaagattggcaataaagtttcttaagattg47<210>55<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>55ttcttcttcttcttcttttctcaggattcaatcttaagaaac42<210>56<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>56gaagaagaagaagaagaaaagaggttgccggtcttgcgatg41<210>57<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>57atcatcatcatcatcaattcacatgtttgaacgatcgggg40<210>58<211>47<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>58gatgatgatgatgatgaattgtttggcaataaagtttcttaagattg47<210>59<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>59ctcgaattcccgatctagtaac22<210>60<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>60cagccctacaactatatccgatgatgtttgaacgatcgggg41<210>61<211>47<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>61gagtaaatattacgagtcgaggttggcaataaagtttcttaagattg47<210>62<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>62cctcgactcgtaatatttactcagccctacaactatatccgatg44<210>63<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>63catcggatatagttgtagggctgagtaaatattacgagtcgagg44<210>64<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>64aacgattgaaggagccactca21<210>65<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>65actgaaggcgggaaacgac19<210>66<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>66gtggttggcatgcacatacaa21<210>67<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>67atttgcctgcgcacctgt18<210>68<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>68aatggtgctagcagcggtccac22<210>69<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>69caatgtccaaagtgtgcaattcc23<210>70<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>70tgatggaagacttgttggcacc22<210>71<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>71cctcttatcttggcaacatgtgac24<210>72<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>72gagaaaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaaaaga44<210>73<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>73tcttttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttttctc44<210>74<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>74gtgaattgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgaattgt44<210>75<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>75acaattcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcaattcac44<210>76<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>76tccgaattctaatatttagaaatttaattaacataaccaagg42<210>77<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>77ctggtaccgacatcctaggttcaatcaaat30<210>78<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>78gagtctagaacatggtgcgctcctcc26<210>79<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>79tgaatagtgcatatcagcatacctta26<210>80<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>80agggtctcggctcaaagcagaatgctg27<210>81<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>81aaggtctcggagcgtcataactgtagaaatgattcc36<210>82<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>82gggtctcggctctgacaacatcagcaag28<210>83<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>83agggtctcggctcactgaggaaatatatagacaaattaag40<210>84<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>84aaggtctcggagcgtcactggattttggttttagg35<210>85<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>85aaggtctcagagctcccaaaggaaactatgtgtac35<210>86<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>86agggtctcggctcagatcgttcaaacatttg31<210>87<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>87gaggtctcagctcgtaccctgcaatgtgacc31<210>88<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>88agggtctcggctcatacagcattccca27<210>89<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>89ccgagctctgacaacatcagcaagaacg28<210>90<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>90aagaattcaaaggaaacccataagatgcg29<210>91<211>47<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>91tcgagctcactgaggaaatatatagacaaattaagtttggttctatg47<210>92<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>92gtgaattcgctcccaaaggaaactatgtgtacttc35<210>93<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>93gcgagctcatacagcattcccagaaagagaaac33<210>94<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>94tagaattcatgctagcttgtttacacctcg30<210>95<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>95gagagctcggagaacgccttattattgtatatggc35<210>96<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>96aagaattcgctcatcactgcacttcaagc29<210>97<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>97tagagctcatatgaagatgaagatgaaatatttggtgtg39<210>98<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>98atgaattccttatctttaatcatattccatagtccatacc40<210>99<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>99aaggtctcggagccttatctttaatcatattccatagtccatacc45<210>100<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>100agcgagctctaataggttgccagtctgatttc32<210>101<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>101ctagaattcttgccatcgttttgtgg26<210>102<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>102tcggagctctgaacgtgcctctcctc26<210>103<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>103aaggagctctaaaatgattattttatgaatatatttcattgtgc44<210>104<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>104aatgaattcgaaccccaattactggagc28<210>105<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>105gcggtctcggcatggtggagcacga25<210>106<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>106agggtctcggctcagatcgttcaaacatttg31<210>107<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>107attgtacaagtaattgctttcatagatccgtcttcc36<210>108<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>108tagagctcgggttcctagagagatctctagg31<210>109<211>47<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>109tatgtacaagtaaggtagtcaagatgcataataaataacggattgtg47<210>110<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>110tagagctctgggcccctaccgggggtaa28<210>111<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>111attgtacaagtaaggcttcgcttcccgcc29<210>112<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>112aaggtaccagtgaagacaacacc23<210>113<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>113atgagctcgggttgccgaactgc23<210>114<211>377<212>dna<213>人工序列<220><223>nbhspb<400>114gagctcactgaggaaatatatagacaaattaagtttggttctatgagttctaatttggac60ttaagagttgtttgaaattctattttatagtgatgcttataatgtatttggactgttttc120tgctgtgtgtaagaccttttggtctgtgaactggaaacatacatgaataaatttctttga180atttactggaatttttgcatcaacaaaagaaaaattgaagttactaacttgtaaatggaa240caattgtaatgttaaaggatataaatatcttaatatagtgcgatacgaatcacacgaatg300caagactttctctctctgctcccgctcatgctctcggtgcatgttagctaaatatacatc360ggtgcatccatgaattc377<210>115<211>14115<212>dna<213>人工序列<220><223>pbyr2eak2mc-gfp<400>115cgatcggtcgattcatagaagattagatttttcatagtatttttttaaagtaaaccttta60actacggttaggacacttttaagttaaatttaatttgaacccttaaattaatttttaaaa120tagataaatatcaatcatcctgatatgcttttgaaaaaatgaatgagaaagatgattcaa180ttaaggccacattttaatcatgactaaaataatatacagtataatttcatatatatttgc240tttaaaaaaaaattgacaatccattcgtttctagcaataaatttcttcaaccacaaatat300attaaagataactacggcatagaaacaaaaatctatgaagaatttttgtatacttcatat360gaaattaaaaaaaacttcattgaacatcaaaataataataataatcataaactcctcaat420atttatattcctagcttcttgaattaaattgtttacatattcaacgatgtaaaaaattat480ttctctatctattttccttatatcatgcatggtttcacatatatcaaaggataaaagcaa540tctatgtaaattatctcactttattaagttttctatctgaattattgagaacgtagattt600ctttttgcactatcccccaataattagcaaaacacacctagactagatttgttttgctaa660cccaattgatattaattatatatgattaatatttatatgtatatggaattggttaataaa720atgcatctggttcatcaaagaattataaagacacgtgacattcatttaggataagaaata780tggatgatctctttctcttattcagataattagtaattacacataacacacaactttgat840gcccacattatagtgattagcatgtcactatgtgtgcatccttttatttcatacattaat900taacttggccaatccagaagatggacaagtctagggtcacattgcagggtactctagctt960actcgccttctttttcgaaggtttgagtaccttcagggcatcctcttgatacattacttt1020ccacttcgattggggcaagctgtagcagttcttgcttagaccgaattgccatctcacaga1080gatgctgaagagttcgcgaccctccagaaacggtgatactaactcctcgaaaccgaatac1140tataggtacatccgatctggtcgaaaccgaaaaatcgagatgctgcatagttaaccgaat1200ctcccgtccaagatccaaggactctgtgcagtgaagcttccgtcctgtcgtatctgagat1260atctcttaaatacaactttcccgaaaccccagctttccttgaaaccaaggggattatctt1320gattcgaattcgtctcatcgttatgtagccgccactcagtccaactcggactttcgtcag1380gaagtttgaagggagaagttgtacctcctgatcctccatcccaacgttcactgttagctt1440gttccctagcgtcgtttccttgtatagctcgttccatggattgtaaatagtaattgtaat1500gttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgttgtaaaaatacgctctccaaatgaaatg1560aacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatccctta1620cgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctt1680tttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcat1740cttcaacgatggcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggagccaccttcctttt1800ccactatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttccgg1860atattaccctttgttgaaaagtctcaattgccctttggtcttctgagactgtatctttga1920tatttttggagtagacaagtgtgtcgtgctccaccatgttctggcaattccggttcgctt1980gctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgc2040tttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccgg2100ggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttg2160cgccctgagtgcttgcggcagcgtgaagctggcgcgccgctctagcagaaggcatgttgt2220tgtgactccgaggggttgcctcaaactctatcttataaccggcgtggaggcatggaggca2280agggcattttggtaatttaagtagttagtggaaaatgacgtcatttacttaaagacgaag2340tcttgcgacaaggggggcccacgccgaattttaatattaccggcgtggccccaccttatc2400gcgagtgctttagcacgagcggtccagatttaaagtagaaaagttcccgcccactagggt2460taaaggtgttcacactataaaagcatatacgatgtgatggtatttgatggagcgtatatt2520gtatcaggtatttccgtcggatacgaattattcgtacgaccctcctgcaggtcaacatgg2580tggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaa2640gggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcc2700cagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgcc2760atcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaag2820atggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaa2880agcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaata2940tcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatat3000ccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtgg3060aaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaag3120atgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaa3180aagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacg3240taagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagtt3300catttcatttggagaggacctcgagaaacaaacaaaatcaacaaatatagaaaataacgc3360atttccaattctttgaaatttctgcaacatctagaacaatggtgagcaagggcgaggagc3420tgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagt3480tcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttca3540tctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcagctacg3600gcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccg3660ccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactaca3720agacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagg3780gcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaaca3840gccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaaga3900tccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacaccc3960ccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccc4020tgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccg4080ccgggatcactcacggcatggacgagctgtacaagtaagagctcaaagcagaatgctgag4140ctaaaagaaaggctttttccattttcgagagacaatgagaaaagaagaagaagaagaaga4200agaagaagaagaagaaaagagtaaataataaagccccacaggaggcgaagttcttgtagc4260tccatgttatctaagttattgatattgtttgccctatattttatttctgtcattgtgtat4320gttttgttcagtttcgatctccttgcaaaatgcagagattatgagatgaataaactaagt4380tatattattatacgtgttaatattctcctcctctctctagctagccttttgttttctctt4440tttcttatttgattttctttaaatcaatccattttaggagagggccagggagtgatccag4500caaaacatgaagattagaagaaacttccctcttttttttcctgaaaacaatttaacgtcg4560agatttatctctttttgtaatggaatcatttctacagttatgacgctcatacagcattcc4620cagaaagagaaacagaagaaatatacaaactttcattttgagagcagcacctcgtctatt4680gattgcagataatatgcttctcatttgtatttccttttgattatttttgtttctatccct4740ttgtttgagtcaatctcaaatattcggtcattgttggtatgaaaaatcaagcagttcatg4800ttaagagtcaatttaaaattaatatttttatatagagttgtatgtgaaatgatgttgtga4860tttggtatatatggataaagagcttgtcagttcattttggtctcatttttttggtatcca4920aataagaaacacaaaagggatatgtccctctactatcaaatattagttataagtattcat4980gttatactattcgatattttctaccccaatcgttacctatttaaaagtatttacccctcc5040atctatcaaacccctggacccagctttcctattacatgtggcttcatcttaagcccccaa5100acctttttcttatttttgatttttaaaggctcatcttaaaatttattactcaaattaata5160cctcttaataacccacctcaaggacccagtaattaaatatccaattagctccagtaattg5220gggttcatattagctccagtcttaaattttaaaggcgatgatcgtattcctccacttggt5280tcatttatactcaaagaatactcaatgtctttagtgtttagataactttttgtaaatcat5340atagattgttttaacaaaaaacaattcaatagtagattttcacatgaaagttacataaaa5400attctttaaaattactttctcaaaaaattgttccaaacatattatcccacaattaaactc5460aatctgtttttcgaaacctaaatcaaaaccaatccaactaccttatataatatataatca5520atacattgtaaagaactgcatgttcttttaaattttgggggcaaagttattccgtacgtt5580cacacatgtactaataggaggtaataaatgatatgtgaaacaatcgaggtgtaaacaagc5640tagcatgaattctcgattaaaaatcccaattatatttggtctaatttagtttggtattga5700gtaaaacaaattcgaaccaaaccaaaatataaatatatagtttttatatatatgccttta5760agactttttatagaattttctttaaaaaatatctaggtacatcaacgaaaaattagtcaa5820acgactaaaataaataaatatcatgtgttattaagaaaattctcctataagaatatttta5880atagatcatatgtttgtaaaaaaaattaatttttactaacacatatatttacttatcaaa5940aatttgacaaagtaagattaaaataatattcatctaacaaaaaaaaaaccagaaaatgct6000gaaaacccggcaaaaccgaaccaatccaaaccgatatagttggtttggtttgattttgat6060ataaaccgaaccaactcggtccatttgcacccctaatcataatagctttaatatttcaag6120atattattaagttaacgttgtcaatatcctggaaattttgcaaaatgaatcaagcctata6180tggctgtaatatgaatttaaaagcagctcgatgtggtggtaatatgtaatttacttgatt6240ctaaaaaaatatcccaagtattaataatttctgctaggaagaaggttagctacgatttac6300agcaaagccagaatacaaagaaccataaagtgattgaagctcgaaatatacgaaggaaca6360aatatttttaaaaaaatacgcaatgacttggaacaaaagaaagtgatatattttttgttc6420ttaaacaagcatcccctctaaagaatggcagttttcctttgcatgtaactattatgctcc6480cttcgttacaaaaattttggactactattgggaacttcttctgaaaatagtggtaccgag6540tgtacttcaagtcagttggaaatcaataaaatgattattttatgaatatatttcattgtg6600caagtagatagaaattacatatgttacataacacacgaaataaacaaaaaaacacaatcc6660aaaacaaacaccccaaacaaaataacactatatatatcctcgtatgaggagaggcacgtt6720cagtgactcgacgattcccgagcaaaaaaagtctccccgtcacacatatagtgggtgacg6780caattatcttcaaagtaatccttctgttgacttgtcattgataacatccagtcttcgtca6840ggattgcaaagaattatagaagggatcccaccttttattttcttcttttttccatattta6900gggttgacagtgaaatcagactggcaacctattaattgcttccacaatgggacgaacttg6960aaggggatgtcgtcgatgatattataggtggcgtgttcatcgtagttggtgaagtcgatg7020gtcccgttccagtagttgtgtcgcccgagacttctagcccaggtggtctttccggtacga7080gttggtccgcagatgtagaggctggggtgtctgaccccagtccttccctcatcctggtta7140gatcggccatccactcaaggtcagattgtgcttgatcgtaggagacaggatgtatgaaag7200tgtaggcatcgatgcttacatgatataggtgcgtctctctccagttgtgcagatcttcgt7260ggcagcggagatctgattctgtgaagggcgacacgtactgctcaggttgtggaggaaata7320atttgttggctgaatattccagccattgaagctttgttgcccattcatgagggaactctt7380ctttgatcatgtcaagatactcctccttagacgttgcagtctggataatagttcgccatc7440gtgcgtcagatttgcgaggagacaccttatgatctcggaaatctcctctggttttaatat7500ctccgtcctttgatatgtaatcaaggacttgtttagagtttctagctggctggatattag7560ggtgatttccttcaaaatcgaaaaaagaaggatccctaatacaaggttttttatcaagct7620ggataagagcatgatagtgggtagtgccatcttgatgaagctcagaagcaacaccaagga7680agaaaataagaaaaggtgtgagtttctcccagagaaactggaataaatcatctctttgag7740atgagcacttggggtaggtaaggaaaacatatttagattggagtctgaagttcttgctag7800cagaaggcatgttgttgtgactccgaggggttgcctcaaactctatcttataaccggcgt7860ggaggcatggaggcaagggcattttggtaatttaagtagttagtggaaaatgacgtcatt7920tacttaaagacgaagtcttgcgacaaggggggcccacgccgaattttaatattaccggcg7980tggccccaccttatcgcgagtgctttagcacgagcggtccagatttaaagtagaaaagtt8040cccgcccactagggttaaaggtgttcacactataaaagcatatacgatgtgatggtattt8100gatggagcgtatattgtatcaggtatttccgtcggatacgaattattcgtacggccggac8160cggtcccctaggccggccaattcgagatcggccgcggctgagtggctccttcaatcgttg8220cggttctgtcagttccaaacgtaaaacggcttgtcccgcgtcatcggcgggggtcataac8280gtgactcccttaattctccgctcatgatcagattgtcgtttcccgccttcagtttaaact8340atcagtgtttgacaggatatattggcgggtaaacctaagagaaaagagcgtttattagaa8400taatcggatatttaaaagggcgtgaaaaggtttatccgttcgtccatttgtatgtgcatg8460ccaaccacagggttccccagatctggcgccggccagcgagacgagcaagattggccgccg8520cccgaaacgatccgacagcgcgcccagcacaggtgcgcaggcaaattgcaccaacgcata8580cagcgccagcagaatgccatagtgggcggtgacgtcgttcgagtgaaccagatcgcgcag8640gaggcccggcagcaccggcataatcaggccgatgccgacagcgtcgagcgcgacagtgct8700cagaattacgatcaggggtatgttgggtttcacgtctggcctccggagactgtcatacgc8760gtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcaca8820aaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgt8880ttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacc8940tgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatc9000tcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagc9060ccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgact9120tatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtg9180ctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggta9240tctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggca9300aacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaa9360aaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacg9420aaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcc9480ttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctg9540cagttgccatgttttacggcagtgagagcagagatagcgctgatgtccggcggtgctttt9600gccgttacgcaccaccccgtcagtagctgaacaggagggacagctgatagacacagaagc9660cactggagcacctcaaaaacaccatcatacactaaatcagtaagttggcagcatcaccca9720taattgtggtttcaaaatcggctccgtcgatactatgttatacgccaactttgaaaacaa9780ctttgaaaaagctgttttctggtatttaaggttttagaatgcaaggaacagtgaattgga9840gttcgtcttgttataattagcttcttggggtatctttaaatactgtagaaaagaggaagg9900aaataataaatggctaaaatgagaatatcaccggaattgaaaaaactgatcgaaaaatac9960cgctgcgtaaaagatacggaaggaatgtctcctgctaaggtatataagctggtgggagaa10020aatgaaaacctatatttaaaaatgacggacagccggtataaagggaccacctatgatgtg10080gaacgggaaaaggacatgatgctatggctggaaggaaagctgcctgttccaaaggtcctg10140cactttgaacggcatgatggctggagcaatctgctcatgagtgaggccgatggcgtcctt10200tgctcggaagagtatgaagatgaacaaagccctgaaaagattatcgagctgtatgcggag10260tgcatcaggctctttcactccatcgacatatcggattgtccctatacgaatagcttagac10320agccgcttagccgaattggattacttactgaataacgatctggccgatgtggattgcgaa10380aactgggaagaagacactccatttaaagatccgcgcgagctgtatgattttttaaagacg10440gaaaagcccgaagaggaacttgtcttttcccacggcgacctgggagacagcaacatcttt10500gtgaaagatggcaaagtaagtggctttattgatcttgggagaagcggcagggcggacaag10560tggtatgacattgccttctgcgtccggtcgatcagggaggatatcggggaagaacagtat10620gtcgagctattttttgacttactggggatcaagcctgattgggagaaaataaaatattat10680attttactggatgaattgttttagtacctagatgtggcgcaacgatgccggcgacaagca10740ggagcgcaccgacttcttccgcatcaagtgttttggctctcaggccgaggcccacggcaa10800gtatttgggcaaggggtcgctggtattcgtgcagggcaagattcggaataccaagtacga10860gaaggacggccagacggtctacgggaccgacttcattgccgataaggtggattatctgga10920caccaaggcaccaggcgggtcaaatcaggaataagggcacattgccccggcgtgagtcgg10980ggcaatcccgcaaggagggtgaatgaatcggacgtttgaccggaaggcatacaggcaaga11040actgatcgacgcggggttttccgccgaggatgccgaaaccatcgcaagccgcaccgtcat11100gcgtgcgccccgcgaaaccttccagtccgtcggctcgatggtccagcaagctacggccaa11160gatcgagcgcgacagcgtgcaactggctccccctgccctgcccgcgccatcggccgccgt11220ggagcgttcgcgtcgtctcgaacaggaggcggcaggtttggcgaagtcgatgaccatcga11280cacgcgaggaactatgacgaccaagaagcgaaaaaccgccggcgaggacctggcaaaaca11340ggtcagcgaggccaagcaggccgcgttgctgaaacacacgaagcagcagatcaaggaaat11400gcagctttccttgttcgatattgcgccgtggccggacacgatgcgagcgatgccaaacga11460cacggcccgctctgccctgttcaccacgcgcaacaagaaaatcccgcgcgaggcgctgca11520aaacaaggtcattttccacgtcaacaaggacgtgaagatcacctacaccggcgtcgagct11580gcgggccgacgatgacgaactggtgtggcagcaggtgttggagtacgcgaagcgcacccc11640tatcggcgagccgatcaccttcacgttctacgagctttgccaggacctgggctggtcgat11700caatggccggtattacacgaaggccgaggaatgcctgtcgcgcctacaggcgacggcgat11760gggcttcacgtccgaccgcgttgggcacctggaatcggtgtcgctgctgcaccgcttccg11820cgtcctggaccgtggcaagaaaacgtcccgttgccaggtcctgatcgacgaggaaatcgt11880cgtgctgtttgctggcgaccactacacgaaattcatatgggagaagtaccgcaagctgtc11940gccgacggcccgacggatgttcgactatttcagctcgcaccgggagccgtacccgctcaa12000gctggaaaccttccgcctcatgtgcggatcggattccacccgcgtgaagaagtggcgcga12060gcaggtcggcgaagcctgcgaagagttgcgaggcagcggcctggtggaacacgcctgggt12120caatgatgacctggtgcattgcaaacgctagggccttgtggggtcagttccggctggggg12180ttcagcagccagcgctttactggcatttcaggaacaagcgggcactgctcgacgcacttg12240cttcgctcagtatcgctcgggacgcacggcgcgctctacgaactgccgataaacagagga12300ttaaaattgacaattcaatggcaaggactgccagcgctgccatttttggggtgaggccgt12360tcgcggccgaggggcgcagcccctggggggatgggaggcccgcgttagcgggccgggagg12420gttcgagaagggggggcaccccccttcggcgtgcgcggtcacgcgcacagggcgcagccc12480tggttaaaaacaaggtttataaatattggtttaaaagcaggttaaaagacaggttagcgg12540tggccgaaaaacgggcggaaacccttgcaaatgctggattttctgcctgtggacagcccc12600tcaaatgtcaataggtgcgcccctcatctgtcagcactctgcccctcaagtgtcaaggat12660cgcgcccctcatctgtcagtagtcgcgcccctcaagtgtcaataccgcagggcacttatc12720cccaggcttgtccacatcatctgtgggaaactcgcgtaaaatcaggcgttttcgccgatt12780tgcgaggctggccagctccacgtcgccggccgaaatcgagcctgcccctcatctgtcaac12840gccgcgccgggtgagtcggcccctcaagtgtcaacgtccgcccctcatctgtcagtgagg12900gccaagttttccgcgaggtatccacaacgccggcggccgcggtgtctcgcacacggcttc12960gacggcgtttctggcgcgtttgcagggccatagacggccgccagcccagcggcgagggca13020accagcccggtgagcgtcgcaaaggcgctcggtcttgccttgctcgtcgagatctggggt13080cgatcagccggggatgcatcaggccgacagtcggaacttcgggtccccgacctgtaccat13140tcggtgagcaatggataggggagttgatatcgtcaacgttcacttctaaagaaatagcgc13200cactcagcttcctcagcggctttatccagcgatttcctattatgtcggcatagttctcaa13260gatcgacagcctgtcacggttaagcgagaaatgaataagaaggctgataattcggatctc13320tgcgagggagatgatatttgatcacaggcagcaacgctctgtcatcgttacaatcaacat13380gctaccctccgcgagatcatccgtgtttcaaacccggcagcttagttgccgttcttccga13440atagcatcggtaacatgagcaaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgt13500cccggactgatgggctgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcgggga13560gctgttggctggctggtggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaac13620ttaataacacattgcggacgtttttaatgtactggggtggtttttcttttcaccagtgag13680acgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtcc13740acgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttccgaaatcggcaaaa13800tcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaaca13860agagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagg13920gcgatggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagttttttggggtcgaggtgccgta13980aagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccgg14040cgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgccattcaggctgcgc14100aactgttgggaaggg14115<210>116<211>17111<212>dna<213>人工序列<220><223>pby11ha-gfp<400>116cgatcggtcgattcatagaagattagatttttcatagtatttttttaaagtaaaccttta60actacggttaggacacttttaagttaaatttaatttgaacccttaaattaatttttaaaa120tagataaatatcaatcatcctgatatgcttttgaaaaaatgaatgagaaagatgattcaa180ttaaggccacattttaatcatgactaaaataatatacagtataatttcatatatatttgc240tttaaaaaaaaattgacaatccattcgtttctagcaataaatttcttcaaccacaaatat300attaaagataactacggcatagaaacaaaaatctatgaagaatttttgtatacttcatat360gaaattaaaaaaaacttcattgaacatcaaaataataataataatcataaactcctcaat420atttatattcctagcttcttgaattaaattgtttacatattcaacgatgtaaaaaattat480ttctctatctattttccttatatcatgcatggtttcacatatatcaaaggataaaagcaa540tctatgtaaattatctcactttattaagttttctatctgaattattgagaacgtagattt600ctttttgcactatcccccaataattagcaaaacacacctagactagatttgttttgctaa660cccaattgatattaattatatatgattaatatttatatgtatatggaattggttaataaa720atgcatctggttcatcaaagaattataaagacacgtgacattcatttaggataagaaata780tggatgatctctttctcttattcagataattagtaattacacataacacacaactttgat840gcccacattatagtgattagcatgtcactatgtgtgcatccttttatttcatacattaat900taacttggccaatccagaagatggacaagtctagggtcacattgcagggtactctagctt960actcgccttctttttcgaaggtttgagtaccttcagggcatcctcttgatacattacttt1020ccacttcgattggggcaagctgtagcagttcttgcttagaccgaattgccatctcacaga1080gatgctgaagagttcgcgaccctccagaaacggtgatactaactcctcgaaaccgaatac1140tataggtacatccgatctggtcgaaaccgaaaaatcgagatgctgcatagttaaccgaat1200ctcccgtccaagatccaaggactctgtgcagtgaagcttccgtcctgtcgtatctgagat1260atctcttaaatacaactttcccgaaaccccagctttccttgaaaccaaggggattatctt1320gattcgaattcgtctcatcgttatgtagccgccactcagtccaactcggactttcgtcag1380gaagtttgaagggagaagttgtacctcctgatcctccatcccaacgttcactgttagctt1440gttccctagcgtcgtttccttgtatagctcgttccatggattgtaaatagtaattgtaat1500gttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgttgtaaaaatacgctctccaaatgaaatg1560aacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatccctta1620cgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctt1680tttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcat1740cttcaacgatggcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggagccaccttcctttt1800ccactatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttccgg1860atattaccctttgttgaaaagtctcaattgccctttggtcttctgagactgtatctttga1920tatttttggagtagacaagtgtgtcgtgctccaccatgttctggcaattccggttcgctt1980gctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgc2040tttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccgg2100ggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttg2160cgccctgagtgcttgcggcagcgtgaagctggcgcgccgctctagcagaaggcatgttgt2220tgtgactccgaggggttgcctcaaactctatcttataaccggcgtggaggcatggaggca2280agggcattttggtaatttaagtagttagtggaaaatgacgtcatttacttaaagacgaag2340tcttgcgacaaggggggcccacgccgaattttaatattaccggcgtggccccaccttatc2400gcgagtgctttagcacgagcggtccagatttaaagtagaaaagttcccgcccactagggt2460taaaggtgttcacactataaaagcatatacgatgtgatggtatttgatggagcgtatatt2520gtatcaggtatttccgtcggatacgaattattcgtacgaccctcctgcaggtcaacatgg2580tggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaa2640gggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcc2700cagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgcc2760atcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaag2820atggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaa2880agcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaata2940tcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatat3000ccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtgg3060aaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaag3120atgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaa3180aagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacg3240taagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagtt3300catttcatttggagaggacctcgagaaacaaacaaaatcaacaaatatagaaaataacgc3360atttccaattctttgaaatttctgcaacatctagcgagaccaacaacggtctctagctaa3420agcagaatgctgagctaaaagaaaggctttttccattttcgagagacaatgagaaaagaa3480gaagaagaagaagaagaagaagaagaagaaaagagtaaataataaagccccacaggaggc3540gaagttcttgtagctccatgttatctaagttattgatattgtttgccctatattttattt3600ctgtcattgtgtatgttttgttcagtttcgatctccttgcaaaatgcagagattatgaga3660tgaataaactaagttatattattatacgtgttaatattctcctcctctctctagctagcc3720ttttgttttctctttttcttatttgattttctttaaatcaatccattttaggagagggcc3780agggagtgatccagcaaaacatgaagattagaagaaacttccctcttttttttcctgaaa3840acaatttaacgtcgagatttatctctttttgtaatggaatcatttctacagttatgacgg3900ctcactgaggaaatatatagacaaattaagtttggttctatgagttctaatttggactta3960agagttgtttgaaattctattttatagtgatgcttataatgtatttggactgttttctgc4020tgtgtgtaagaccttttggtctgtgaactggaaacatacatgaataaatttctttgaatt4080tactggaatttttgcatcaacaaaagaaaaattgaagttactaacttgtaaatggaacaa4140ttgtaatgttaaaggatataaatatcttaatatagtgcgatacgaatcacacgaatgcaa4200gactttctctctctgctcccgctcatgctctcggtgcatgttagctaaatatacatcggt4260gcatccatggcaggagcatgaggacggggatgaggaagggagtgaggagggccaaaagaa4320gtacacatagtttcctttgggagcgaattctcgattaaaaatcccaattatatttggtct4380aatttagtttggtattgagtaaaacaaattcgaaccaaaccaaaatataaatatatagtt4440tttatatatatgcctttaagactttttatagaattttctttaaaaaatatctaggtacat4500caacgaaaaattagtcaaacgactaaaataaataaatatcatgtgttattaagaaaattc4560tcctataagaatattttaatagatcatatgtttgtaaaaaaaattaatttttactaacac4620atatatttacttatcaaaaatttgacaaagtaagattaaaataatattcatctaacaaaa4680aaaaaaccagaaaatgctgaaaacccggcaaaaccgaaccaatccaaaccgatatagttg4740gtttggtttgattttgatataaaccgaaccaactcggtccatttgcacccctaatcataa4800tagctttaatatttcaagatattattaagttaacgttgtcaatatcctggaaattttgca4860aaatgaatcaagcctatatggctgtaatatgaatttaaaagcagctcgatgtggtggtaa4920tatgtaatttacttgattctaaaaaaatatcccaagtattaataatttctgctaggaaga4980aggttagctacgatttacagcaaagccagaatacaaagaaccataaagtgattgaagctc5040gaaatatacgaaggaacaaatatttttaaaaaaatacgcaatgacttggaacaaaagaaa5100gtgatatattttttgttcttaaacaagcatcccctctaaagaatggcagttttcctttgc5160atgtaactattatgctcccttcgttacaaaaattttggactactattgggaacttcttct5220gaaaatagtggtaccgagtgtacttcaagtcagttggaaatcaataaaatgattatttta5280tgaatatatttcattgtgcaagtagatagaaattacatatgttacataacacacgaaata5340aacaaaaaaacacaatccaaaacaaacaccccaaacaaaataacactatatatatcctcg5400tatgaggagaggcacgttcagtgactcgacgattcccgagcaaaaaaagtctccccgtca5460cacatatagtgggtgacgcaattatcttcaaagtaatccttctgttgacttgtcattgat5520aacatccagtcttcgtcaggattccaaagaattatagaagggatcggtcaacatggtgga5580gcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggc5640aattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagc5700tatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatca5760ttgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatgg5820acccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagca5880agtggattgatgtgataacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaa5940agatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccgg6000aaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaa6060ggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgc6120ctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaaga6180agacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaag6240ggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatt6300tcatttggagaggacctcgagaaacaaacaaaatcaacaaatatagaaaataacgcattt6360ccaattctttgaaatttctgcaacatctagaacaatggtgagcaagggcgaggagctgtt6420caccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcag6480cgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctg6540caccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcagctacggcgt6600gcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccat6660gcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagac6720ccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcat6780cgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagcca6840caacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccg6900ccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccat6960cggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgag7020caaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgg7080gatcactcacggcatggacgagctgtacaagtaagagctcaaagcagaatgctgagctaa7140aagaaaggctttttccattttcgagagacaatgagaaaagaagaagaagaagaagaagaa7200gaagaagaagaaaagagtaaataataaagccccacaggaggcgaagttcttgtagctcca7260tgttatctaagttattgatattgtttgccctatattttatttctgtcattgtgtatgttt7320tgttcagtttcgatctccttgcaaaatgcagagattatgagatgaataaactaagttata7380ttattatacgtgttaatattctcctcctctctctagctagccttttgttttctctttttc7440ttatttgattttctttaaatcaatccattttaggagagggccagggagtgatccagcaaa7500acatgaagattagaagaaacttccctcttttttttcctgaaaacaatttaacgtcgagat7560ttatctctttttgtaatggaatcatttctacagttatgacgctcatacagcattcccaga7620aagagaaacagaagaaatatacaaactttcattttgagagcagcacctcgtctattgatt7680gcagataatatgcttctcatttgtatttccttttgattatttttgtttctatccctttgt7740ttgagtcaatctcaaatattcggtcattgttggtatgaaaaatcaagcagttcatgttaa7800gagtcaatttaaaattaatatttttatatagagttgtatgtgaaatgatgttgtgatttg7860gtatatatggataaagagcttgtcagttcattttggtctgatttttttggtatccaaata7920agaaacacaaaagggatatgtccctctactatcaaatattagttataagtattcatgtta7980tactattcgatattttctaccccaatcgttacctatttaaaagtatttacccctccatct8040atcaaacccctggacccagctttcctattacatgtggcttcatcttaagcccccaaacct8100ttttcttatttttgatttttaaaggctcatcttaaaatttattactcaaattaatacctc8160ttaataacccacctcaaggacccagtaattaaatatccaattagctccagtaattggggt8220tcatattagctccagtcttaaattttaaaggcgatgatcgtattcctccacttggttcat8280ttatactcaaagaatactcaatgtctttagtgtttagataactttttgtaaatcatatag8340attgttttaacaaaaaacaattcaatagtagattttcacatgaaagttacataaaaattc8400tttaaaattactttctcaaaaaattgttccaaacatattatcccacaattaaactcaatc8460tgtttttcgaaacctaaatcaaaaccaatccaactaccttatataatatataatcaatac8520attgtaaagaactgcatgttcttttaaattttgggggcaaagttattccgtacgttcaca8580catgtactaataggaggtaataaatgatatgtgaaacaatcgaggtgtaaacaagctagc8640atgaattctcgattaaaaatcccaattatatttggtctaatttagtttggtattgagtaa8700aacaaattcgaaccaaaccaaaatataaatatatagtttttatatatatgcctttaagac8760tttttatagaattttctttaaaaaatatctaggtacatcaacgaaaaattagtcaaacga8820ctaaaataaataaatatcatgtgttattaagaaaattctcctataagaatattttaatag8880atcatatgtttgtaaaaaaaattaatttttactaacacatatatttacttatcaaaaatt8940tgacaaagtaagattaaaataatattcatctaacaaaaaaaaaaccagaaaatgctgaaa9000acccggcaaaaccgaaccaatccaaaccgatatagttggtttggtttgattttgatataa9060accgaaccaactcggtccatttgcacccctaatcataatagctttaatatttcaagatat9120tattaagttaacgttgtcaatatcctggaaattttgcaaaatgaatcaagcctatatggc9180tgtaatatgaatttaaaagcagctcgatgtggtggtaatatgtaatttacttgattctaa9240aaaaatatcccaagtattaataatttctgctaggaagaaggttagctacgatttacagca9300aagccagaatacaaagaaccataaagtgattgaagctcgaaatatacgaaggaacaaata9360tttttaaaaaaatacgcaatgacttggaacaaaagaaagtgatatattttttgttcttaa9420acaagcatcccctctaaagaatggcagttttcctttgcatgtaactattatgctcccttc9480gttacaaaaattttggactactattgggaacttcttctgaaaatagtggtaccgagtgta9540cttcaagtcagttggaaatcaataaaatgattattttatgaatatatttcattgtgcaag9600tagatagaaattacatatgttacataacacacgaaataaacaaaaaaacacaatccaaaa9660caaacaccccaaacaaaataacactatatatatcctcgtatgaggagaggcacgttcagt9720gactcgacgattcccgagcaaaaaaagtctccccgtcacacatatagtgggtgacgcaat9780tatcttcaaagtaatccttctgttgacttgtcattgataacatccagtcttcgtcaggat9840tgcaaagaattatagaagggattccaccttttattttcttcttttttccatatttagggt9900tgacagtgaaatcagactggcaacctattaattgcttccacaatgggacgaacttgaagg9960ggatgtcgtcgatgatattataggtggcgtgttcatcgtagttggtgaagtcgatggtcc10020cgttccagtagttgtgtcgcccgagacttctagcccaggtggtctttccggtacgagttg10080gtccgcagatgtagaggctggggtgtctgaccccagtccttccctcatcctggttagatc10140ggccatccactcaaggtcagattgtgcttgatcgtaggagacaggatgtatgaaagtgta10200ggcatcgatgcttacatgatataggtgcgtctctctccagttgtgcagatcttcgtggca10260gcggagatctgattctgtgaagggcgacacgtactgctcaggttgtggaggaaataattt10320gttggctgaatattccagccattgaagctttgttgcccattcatgagggaactcttcttt10380gatcatgtcaagatactcctccttagacgttgcagtctggataatagttcgccatcgtgc10440gtcagatttgcgaggagacaccttatgatctcggaaatctcctctggttttaatatctcc10500gtcctttgatatgtaatcaaggacttgtttagagtttctagctggctggatattagggtg10560atttccttcaaaatcgaaaaaagaaggatctctaatacaaggttttttatcaagctggat10620aagagcatgatagtgggtagtgccatcttgatgaagctcagaagcaacaccaaggaagaa10680aataagaaaaggtgtgagtttctcccagagaaactggaataaatcatctctttgagatga10740gcacttggggtaggtaaggaaaacatatttagattggagtctgaagttcttgctagcaga10800aggcatgttgttgtgactccgaggggttgcctcaaactctatcttataaccggcgtggag10860gcatggaggcaagggcattttggtaatttaagtagttagtggaaaatgacgtcatttact10920taaagacgaagtcttgcgacaaggggggcccacgccgaattttaatattaccggcgtggc10980cccaccttatcgcgagtgctttagcacgagcggtccagatttaaagtagaaaagttcccg11040cccactagggttaaaggtgttcacactataaaagcatatacgatgtgatggtatttgatg11100gagcgtatattgtatcaggtatttccgtcggatacgaattattcgtacggccggaccggt11160cccctaggccggccaattcgagatcggccgcggctgagtggctccttcaatcgttgcggt11220tctgtcagttccaaacgtaaaacggcttgtcccgcgtcatcggcgggggtcataacgtga11280ctcccttaattctccgctcatgatcagattgtcgtttcccgccttcagtttaaactatca11340gtgtttgacaggatatattggcgggtaaacctaagagaaaagagcgtttattagaataat11400cggatatttaaaagggcgtgaaaaggtttatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaa11460ccacagggttccccagatctggcgccggccagcgagacgagcaagattggccgccgcccg11520aaacgatccgacagcgcgcccagcacaggtgcgcaggcaaattgcaccaacgcatacagc11580gccagcagaatgccatagtgggcggtgacgtcgttcgagtgaaccagatcgcgcaggagg11640cccggcagcaccggcataatcaggccgatgccgacagcgtcgagcgcgacagtgctcaga11700attacgatcaggggtatgttgggtttcacgtctggcctccggagactgtcatacgcgtaa11760aaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaa11820tcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttcc11880ccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtc11940cgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcag12000ttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccga12060ccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatc12120gccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctac12180agagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctg12240cgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaaca12300aaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaa12360aggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaa12420ctcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcctttt12480aaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgcagt12540tgccatgttttacggcagtgagagcagagatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccg12600ttacgcaccaccccgtcagtagctgaacaggagggacagctgatagacacagaagccact12660ggagcacctcaaaaacaccatcatacactaaatcagtaagttggcagcatcacccataat12720tgtggtttcaaaatcggctccgtcgatactatgttatacgccaactttgaaaacaacttt12780gaaaaagctgttttctggtatttaaggttttagaatgcaaggaacagtgaattggagttc12840gtcttgttataattagcttcttggggtatctttaaatactgtagaaaagaggaaggaaat12900aataaatggctaaaatgagaatatcaccggaattgaaaaaactgatcgaaaaataccgct12960gcgtaaaagatacggaaggaatgtctcctgctaaggtatataagctggtgggagaaaatg13020aaaacctatatttaaaaatgacggacagccggtataaagggaccacctatgatgtggaac13080gggaaaaggacatgatgctatggctggaaggaaagctgcctgttccaaaggtcctgcact13140ttgaacggcatgatggctggagcaatctgctcatgagtgaggccgatggcgtcctttgct13200cggaagagtatgaagatgaacaaagccctgaaaagattatcgagctgtatgcggagtgca13260tcaggctctttcactccatcgacatatcggattgtccctatacgaatagcttagacagcc13320gcttagccgaattggattacttactgaataacgatctggccgatgtggattgcgaaaact13380gggaagaagacactccatttaaagatccgcgcgagctgtatgattttttaaagacggaaa13440agcccgaagaggaacttgtcttttcccacggcgacctgggagacagcaacatctttgtga13500aagatggcaaagtaagtggctttattgatcttgggagaagcggcagggcggacaagtggt13560atgacattgccttctgcgtccggtcgatcagggaggatatcggggaagaacagtatgtcg13620agctattttttgacttactggggatcaagcctgattgggagaaaataaaatattatattt13680tactggatgaattgttttagtacctagatgtggcgcaacgatgccggcgacaagcaggag13740cgcaccgacttcttccgcatcaagtgttttggctctcaggccgaggcccacggcaagtat13800ttgggcaaggggtcgctggtattcgtgcagggcaagattcggaataccaagtacgagaag13860gacggccagacggtctacgggaccgacttcattgccgataaggtggattatctggacacc13920aaggcaccaggcgggtcaaatcaggaataagggcacattgccccggcgtgagtcggggca13980atcccgcaaggagggtgaatgaatcggacgtttgaccggaaggcatacaggcaagaactg14040atcgacgcggggttttccgccgaggatgccgaaaccatcgcaagccgcaccgtcatgcgt14100gcgccccgcgaaaccttccagtccgtcggctcgatggtccagcaagctacggccaagatc14160gagcgcgacagcgtgcaactggctccccctgccctgcccgcgccatcggccgccgtggag14220cgttcgcgtcgtctcgaacaggaggcggcaggtttggcgaagtcgatgaccatcgacacg14280cgaggaactatgacgaccaagaagcgaaaaaccgccggcgaggacctggcaaaacaggtc14340agcgaggccaagcaggccgcgttgctgaaacacacgaagcagcagatcaaggaaatgcag14400ctttccttgttcgatattgcgccgtggccggacacgatgcgagcgatgccaaacgacacg14460gcccgctctgccctgttcaccacgcgcaacaagaaaatcccgcgcgaggcgctgcaaaac14520aaggtcattttccacgtcaacaaggacgtgaagatcacctacaccggcgtcgagctgcgg14580gccgacgatgacgaactggtgtggcagcaggtgttggagtacgcgaagcgcacccctatc14640ggcgagccgatcaccttcacgttctacgagctttgccaggacctgggctggtcgatcaat14700ggccggtattacacgaaggccgaggaatgcctgtcgcgcctacaggcgacggcgatgggc14760ttcacgtccgaccgcgttgggcacctggaatcggtgtcgctgctgcaccgcttccgcgtc14820ctggaccgtggcaagaaaacgtcccgttgccaggtcctgatcgacgaggaaatcgtcgtg14880ctgtttgctggcgaccactacacgaaattcatatgggagaagtaccgcaagctgtcgccg14940acggcccgacggatgttcgactatttcagctcgcaccgggagccgtacccgctcaagctg15000gaaaccttccgcctcatgtgcggatcggattccacccgcgtgaagaagtggcgcgagcag15060gtcggcgaagcctgcgaagagttgcgaggcagcggcctggtggaacacgcctgggtcaat15120gatgacctggtgcattgcaaacgctagggccttgtggggtcagttccggctgggggttca15180gcagccagcgctttactggcatttcaggaacaagcgggcactgctcgacgcacttgcttc15240gctcagtatcgctcgggacgcacggcgcgctctacgaactgccgataaacagaggattaa15300aattgacaattcaatggcaaggactgccagcgctgccatttttggggtgaggccgttcgc15360ggccgaggggcgcagcccctggggggatgggaggcccgcgttagcgggccgggagggttc15420gagaagggggggcaccccccttcggcgtgcgcggtcacgcgcacagggcgcagccctggt15480taaaaacaaggtttataaatattggtttaaaagcaggttaaaagacaggttagcggtggc15540cgaaaaacgggcggaaacccttgcaaatgctggattttctgcctgtggacagcccctcaa15600atgtcaataggtgcgcccctcatctgtcagcactctgcccctcaagtgtcaaggatcgcg15660cccctcatctgtcagtagtcgcgcccctcaagtgtcaataccgcagggcacttatcccca15720ggcttgtccacatcatctgtgggaaactcgcgtaaaatcaggcgttttcgccgatttgcg15780aggctggccagctccacgtcgccggccgaaatcgagcctgcccctcatctgtcaacgccg15840cgccgggtgagtcggcccctcaagtgtcaacgtccgcccctcatctgtcagtgagggcca15900agttttccgcgaggtatccacaacgccggcggccgcggtgtctcgcacacggcttcgacg15960gcgtttctggcgcgtttgcagggccatagacggccgccagcccagcggcgagggcaacca16020gcccggtgagcgtcgcaaaggcgctcggtcttgccttgctcgtcgagatctggggtcgat16080cagccggggatgcatcaggccgacagtcggaacttcgggtccccgacctgtaccattcgg16140tgagcaatggataggggagttgatatcgtcaacgttcacttctaaagaaatagcgccact16200cagcttcctcagcggctttatccagcgatttcctattatgtcggcatagttctcaagatc16260gacagcctgtcacggttaagcgagaaatgaataagaaggctgataattcggatctctgcg16320agggagatgatatttgatcacaggcagcaacgctctgtcatcgttacaatcaacatgcta16380ccctccgcgagatcatccgtgtttcaaacccggcagcttagttgccgttcttccgaatag16440catcggtaacatgagcaaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtcccg16500gactgatgggctgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcggggagctg16560ttggctggctggtggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaa16620taacacattgcggacgtttttaatgtactggggtggtttttcttttcaccagtgagacgg16680gcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgc16740tggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttccgaaatcggcaaaatccc16800ttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagag16860tccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcga16920tggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagc16980actaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaa17040cgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgccattcaggctgcgcaact17100gttgggaaggg17111<210>117<211>19330<212>dna<213>人工序列<220><223>pby!11-h6d8m2<400>117cgatcggtcgattcatagaagattagatttttcatagtatttttttaaagtaaaccttta60actacggttaggacacttttaagttaaatttaatttgaacccttaaattaatttttaaaa120tagataaatatcaatcatcctgatatgcttttgaaaaaatgaatgagaaagatgattcaa180ttaaggccacattttaatcatgactaaaataatatacagtataatttcatatatatttgc240tttaaaaaaaaattgacaatccattcgtttctagcaataaatttcttcaaccacaaatat300attaaagataactacggcatagaaacaaaaatctatgaagaatttttgtatacttcatat360gaaattaaaaaaaacttcattgaacatcaaaataataataataatcataaactcctcaat420atttatattcctagcttcttgaattaaattgtttacatattcaacgatgtaaaaaattat480ttctctatctattttccttatatcatgcatggtttcacatatatcaaaggataaaagcaa540tctatgtaaattatctcactttattaagttttctatctgaattattgagaacgtagattt600ctttttgcactatcccccaataattagcaaaacacacctagactagatttgttttgctaa660cccaattgatattaattatatatgattaatatttatatgtatatggaattggttaataaa720atgcatctggttcatcaaagaattataaagacacgtgacattcatttaggataagaaata780tggatgatctctttctcttattcagataattagtaattacacataacacacaactttgat840gcccacattatagtgattagcatgtcactatgtgtgcatccttttatttcatacattaat900taacttggccaatccagaagatggacaagtctagggtcacattgcagggtactctagctt960actcgccttctttttcgaaggtttgagtaccttcagggcatcctcttgatacattacttt1020ccacttcgattggggcaagctgtagcagttcttgcttagaccgaattgccatctcacaga1080gatgctgaagagttcgcgaccctccagaaacggtgatactaactcctcgaaaccgaatac1140tataggtacatccgatctggtcgaaaccgaaaaatcgagatgctgcatagttaaccgaat1200ctcccgtccaagatccaaggactctgtgcagtgaagcttccgtcctgtcgtatctgagat1260atctcttaaatacaactttcccgaaaccccagctttccttgaaaccaaggggattatctt1320gattcgaattcgtctcatcgttatgtagccgccactcagtccaactcggactttcgtcag1380gaagtttgaagggagaagttgtacctcctgatcctccatcccaacgttcactgttagctt1440gttccctagcgtcgtttccttgtatagctcgttccatggattgtaaatagtaattgtaat1500gttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgttgtaaaaatacgctctccaaatgaaatg1560aacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatccctta1620cgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctt1680tttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcat1740cttcaacgatggcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggagccaccttcctttt1800ccactatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttccgg1860atattaccctttgttgaaaagtctcaattgccctttggtcttctgagactgtatctttga1920tatttttggagtagacaagtgtgtcgtgctccaccatgttctggcaattccggttcgctt1980gctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgc2040tttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccgg2100ggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttg2160cgccctgagtgcttgcggcagcgtgaagctggcgcgccgctctagcagaaggcatgttgt2220tgtgactccgaggggttgcctcaaactctatcttataaccggcgtggaggcatggaggca2280agggcattttggtaatttaagtagttagtggaaaatgacgtcatttacttaaagacgaag2340tcttgcgacaaggggggcccacgccgaattttaatattaccggcgtggccccaccttatc2400gcgagtgctttagcacgagcggtccagatttaaagtagaaaagttcccgcccactagggt2460taaaggtgttcacactataaaagcatatacgatgtgatggtatttgatggagcgtatatt2520gtatcaggtatttccgtcggatacgaattattcgtacgaccctcctgcaggtcaacatgg2580tggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaa2640gggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcc2700cagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgcc2760atcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaag2820atggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaa2880agcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaata2940tcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatat3000ccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtgg3060aaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaag3120atgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaa3180aagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacg3240taagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagtt3300catttcatttggagaggacctcgagaaacaaacaaaatcaacaaatatagaaaataacgc3360atttccaattctttgaaatttctgcaacatctagaacaatgggatggtcttgcatcatac3420tctttcttgttgcaactgctacaggtgtccactctgatgttcagcttctcgagtctggag3480gtggtcttgtgcaacctggaggttccttgagactctcctgtgcagcttcagggtttgact3540tcagtaggtactggatgagttgggttcgtcaagctcctgggaaaggactagaatggattg3600gagagatcaatccagattcaagtaccatcaactatactccatctctgaaggatcgcttca3660ccatttccagagacaatgccaagaacacgttgtatcttcagatgaacagcttgaggactg3720aagacacagccttgtactactgcacaagacagggctatggctacaactactggggtcaag3780gcaccactgtcacagtgtcttcagctagcaccaaaggtccatcggtctttccactggcac3840cttcttccaagagtacttctggaggcacagctgcactgggttgtcttgtcaaggactact3900ttccagaacctgttacggtttcgtggaactcaggtgctctgaccagtggagtgcacacct3960ttccagctgttcttcagtcctcaggattgtattctcttagcagtgttgtgactgttccat4020cctcaagcttgggcactcagacctacatctgcaatgtgaatcacaaacccagcaacacca4080aggttgacaagaaagttgagcccaagtcttgtgacaagactcatacgtgtccaccgtgcc4140cagcacctgaacttcttggaggaccgtcagtcttcttgtttcctccaaagcctaaggata4200ccttgatgatctccaggactcctgaagtcacatgtgtagttgtggatgtgagccatgaag4260atcctgaggtgaagttcaactggtatgtggatggtgtggaagtgcacaatgccaagacaa4320agccgagagaggaacagtacaacagcacgtacagggttgtctcagttctcactgttctcc4380atcaagattggttgaatggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccag4440cccccattgagaagaccatttccaaagcgaaagggcaaccccgtgaaccacaagtgtaca4500cacttcctccatctcgcgatgaactgaccaagaaccaggtcagcttgacttgcctggtga4560aaggcttctatccctctgacatagctgtagagtgggagagcaatgggcaaccggagaaca4620actacaagactacacctcccgttctcgattctgacggctccttcttcctctacagcaagc4680tcacagtggacaagagcaggtggcaacaagggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatg4740aggctcttcacaatcactacacacagaagagtctctccttgtctccgggtaaaggaggtg4800gcggatcaggtggaggcggttcaggcggaggtggatcctctttgcttaccgaggttgaga4860cccctattagaaacgagtggggttgcagatgtaacgattcttccgacggaggttctggag4920gttcccttttgactgaagtggagactccaatcaggaacgaatggggatgcagatgcaacg4980actcctctgacggaggtggaactagtcataacactcctgtttacaagctggacatatctg5040aggcaactcaataagagctcaaagcagaatgctgagctaaaagaaaggctttttccattt5100tcgagagacaatgagaaaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaaaagagtaa5160ataataaagccccacaggaggcgaagttcttgtagctccatgttatctaagttattgata5220ttgtttgccctatattttatttctgtcattgtgtatgttttgttcagtttcgatctcctt5280gcaaaatgcagagattatgagatgaataaactaagttatattattatacgtgttaatatt5340ctcctcctctctctagctagccttttgttttctctttttcttatttgattttctttaaat5400caatccattttaggagagggccagggagtgatccagcaaaacatgaagattagaagaaac5460ttccctcttttttttcctgaaaacaatttaacgtcgagatttatctctttttgtaatgga5520atcatttctacagttatgacgctcatacagcattcccagaaagagaaacagaagaaatat5580acaaactttcattttgagagcagcacctcgtctattgattgcagataatatgcttctcat5640ttgtatttccttttgattatttttgtttctatccctttgtttgagtcaatctcaaatatt5700cggtcattgttggtatgaaaaatcaagcagttcatgttaagagtcaatttaaaattaata5760tttttatatagagttgtatgtgaaatgatgttgtgatttggtatatatggataaagagct5820tgtcagttcattttggtctgatttttttggtatccaaataagaaacacaaaagggatatg5880tccctctactatcaaatattagttataagtattcatgttatactattcgatattttctac5940cccaatcgttacctatttaaaagtatttacccctccatctatcaaacccctggacccagc6000tttcctattacatgtggcttcatcttaagcccccaaacctttttcttatttttgattttt6060aaaggctcatcttaaaatttattactcaaattaatacctcttaataacccacctcaagga6120cccagtaattaaatatccaattagctccagtaattggggttcatattagctccagtctta6180aattttaaaggcgatgatcgtattcctccacttggttcatttatactcaaagaatactca6240atgtctttagtgtttagataactttttgtaaatcatatagattgttttaacaaaaaacaa6300ttcaatagtagattttcacatgaaagttacataaaaattctttaaaattactttctcaaa6360aaattgttccaaacatattatcccacaattaaactcaatctgtttttcgaaacctaaatc6420aaaaccaatccaactaccttatataatatataatcaatacattgtaaagaactgcatgtt6480cttttaaattttgggggcaaagttattccgtacgttcacacatgtactaataggaggtaa6540taaatgatatgtgaaacaatcgaggtgtaaacaagctagcatgaattctcgattaaaaat6600cccaattatatttggtctaatttagtttggtattgagtaaaacaaattcgaaccaaacca6660aaatataaatatatagtttttatatatatgcctttaagactttttatagaattttcttta6720aaaaatatctagaaatatttgcgactcttctggcatgtaatatttcgttaaatatgaagt6780gctccatttttattaactttaaataattggttgtacgatcactttcttatcaagtgttac6840taaaatgcgtcaatctctttgttcttccatattcatatgtcaaaatctatcaaaattctt6900atatatctttttcgaatttgaagtgaaatttcgataatttaaaattaaatagaacatatc6960attatttaggtatcatattgatttttatacttaattactaaatttggttaactttgaaag7020tgtacatcaacgaaaaattagtcaaacgactaaaataaataaatatcatgtgttattaag7080aaaattctcctataagaatattttaatagatcatatgtttgtaaaaaaaattaattttta7140ctaacacatatatttacttatcaaaaatttgacaaagtaagattaaaataatattcatct7200aacaaaaaaaaaaccagaaaatgctgaaaacccggcaaaaccgaaccaatccaaaccgat7260atagttggtttggtttgattttgatataaaccgaaccaactcggtccatttgcaccccta7320atcataatagctttaatatttcaagatattattaagttaacgttgtcaatatcctggaaa7380ttttgcaaaatgaatcaagcctatatggctgtaatatgaatttaaaagcagctcgatgtg7440gtggtaatatgtaatttacttgattctaaaaaaatatcccaagtattaataatttctgct7500aggaagaaggttagctacgatttacagcaaagccagaatacaaagaaccataaagtgatt7560gaagctcgaaatatacgaaggaacaaatatttttaaaaaaatacgcaatgacttggaaca7620aaagaaagtgatatattttttgttcttaaacaagcatcccctctaaagaatggcagtttt7680cctttgcatgtaactattatgctcccttcgttacaaaaattttggactactattgggaac7740ttcttctgaaaatagtggtaccgagtgtacttcaagtcagttggaaatcaataaaatgat7800tattttatgaatatatttcattgtgcaagtagatagaaattacatatgttacataacaca7860cgaaataaacaaaaaaacacaatccaaaacaaacaccccaaacaaaataacactatatat7920atcctcgtatgaggagaggcacgttcagtgactcgacgattcccgagcaaaaaaagtctc7980cccgtcacacatatagtgggtgacgcaattatcttcaaagtaatccttctgttgacttgt8040cattgataacatccagtcttcgtcaggattccaaagaattatagaagggatcggtcaaca8100tggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagacc8160aaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccatt8220gcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaat8280gccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtccca8340aagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtctt8400caaagcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaa8460atatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaa8520tatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatag8580tggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttg8640aagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtgg8700aaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactg8760acgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaa8820gttcatttcatttggagaggacctcgagaaacaaacaaaatcaacaaatatagaaaataa8880cgcatttccaattctttgaaatttctgcaacatctagaacaatgggatggtcttgcatca8940ttctcttcttggtagccacagctacaggtgtccactccgatgttttgatgactcaaagcc9000ctctctcacttcctgtgactcttggacagcccgcatccatatcttgcagatctagtcaga9060gtattgttcatagtaacggcaacacctacttggaatggtatctgcagaaaccaggccagt9120ctccaaagcttctgatctacaaggcttccaatcgtttctctggtgtcccagacaggttta9180gtggcagtggatcagggactgacttcacattgaagatcagcagagttgaggctgaagatg9240cgggagtgtactattgtcttcaaggttcacatgttccgtcaacgtttggaggtgggacca9300aagtggagatcaagactgttgcggcgccatctgtcttcatctttcctccatctgatgaac9360aactcaagtctggaactgcttctgttgtgtgccttctgaacaacttctatcctagagaag9420ccaaagtacagtggaaggttgacaatgctcttcaatcaggtaactcccaggagagtgtca9480cagagcaagattccaaggattccacctacagcctctcaagtaccttgacgttgagcaagg9540cagactatgagaaacacaaagtgtacgcatgcgaagtcactcatcagggcctgtcatcac9600ccgtgacaaagagcttcaacaggggagagtgttaggtaccgagctcaaagcagaatgctg9660agctaaaagaaaggctttttccattttcgagagacaatgagaaaagaagaagaagaagaa9720gaagaagaagaagaagaaaagagtaaataataaagccccacaggaggcgaagttcttgta9780gctccatgttatctaagttattgatattgtttgccctatattttatttctgtcattgtgt9840atgttttgttcagtttcgatctccttgcaaaatgcagagattatgagatgaataaactaa9900gttatattattatacgtgttaatattctcctcctctctctagctagccttttgttttctc9960tttttcttatttgattttctttaaatcaatccattttaggagagggccagggagtgatcc10020agcaaaacatgaagattagaagaaacttccctcttttttttcctgaaaacaatttaacgt10080cgagatttatctctttttgtaatggaatcatttctacagttatgacggctcactgaggaa10140atatatagacaaattaagtttggttctatgagttctaatttggacttaagagttgtttga10200aattctattttatagtgatgcttataatgtatttggactgttttctgctgtgtgtaagac10260cttttggtctgtgaactggaaacatacatgaataaatttctttgaatttactggaatttt10320tgcatcaacaaaagaaaaattgaagttactaacttgtaaatggaacaattgtaatgttaa10380aggatataaatatcttaatatagtgcgatacgaatcacacgaatgcaagactttctctct10440ctgctcccgctcatgctctcggtgcatgttagctaaatatacatcggtgcatccatggca10500ggagcatgaggacggggatgaggaagggagtgaggagggccaaaagaagtacacatagtt10560tcctttgggagcgaattctcgattaaaaatcccaattatatttggtctaatttagtttgg10620tattgagtaaaacaaattcgaaccaaaccaaaatataaatatatagtttttatatatatg10680cctttaagactttttatagaattttctttaaaaaatatctagaaatatttgcgactcttc10740tggcatgtaatatttcgttaaatatgaagtgctccatttttattaactttaaataattgg10800ttgtacgatcactttcttatcaagtgttactaaaatgcgtcaatctctttgttcttccat10860attcatatgtcaaaatctatcaaaattcttatatatctttttcgaatttgaagtgaaatt10920tcgataatttaaaattaaatagaacatatcattatttaggtatcatattgatttttatac10980ttaattactaaatttggttaactttgaaagtgtacatcaacgaaaaattagtcaaacgac11040taaaataaataaatatcatgtgttattaagaaaattctcctataagaatattttaataga11100tcatatgtttgtaaaaaaaattaatttttactaacacatatatttacttatcaaaaattt11160gacaaagtaagattaaaataatattcatctaacaaaaaaaaaaccagaaaatgctgaaaa11220cccggcaaaaccgaaccaatccaaaccgatatagttggtttggtttgattttgatataaa11280ccgaaccaactcggtccatttgcacccctaatcataatagctttaatatttcaagatatt11340attaagttaacgttgtcaatatcctggaaattttgcaaaatgaatcaagcctatatggct11400gtaatatgaatttaaaagcagctcgatgtggtggtaatatgtaatttacttgattctaaa11460aaaatatcccaagtattaataatttctgctaggaagaaggttagctacgatttacagcaa11520agccagaatacaaagaaccataaagtgattgaagctcgaaatatacgaaggaacaaatat11580ttttaaaaaaatacgcaatgacttggaacaaaagaaagtgatatattttttgttcttaaa11640caagcatcccctctaaagaatggcagttttcctttgcatgtaactattatgctcccttcg11700ttacaaaaattttggactactattgggaacttcttctgaaaatagtggtaccgagtgtac11760ttcaagtcagttggaaatcaataaaatgattattttatgaatatatttcattgtgcaagt11820agatagaaattacatatgttacataacacacgaaataaacaaaaaaacacaatccaaaac11880aaacaccccaaacaaaataacactatatatatcctcgtatgaggagaggcacgttcagtg11940actcgacgattcccgagcaaaaaaagtctccccgtcacacatatagtgggtgacgcaatt12000atcttcaaagtaatccttctgttgacttgtcattgataacatccagtcttcgtcaggatt12060gcaaagaattatagaagggattccaccttttattttcttcttttttccatatttagggtt12120gacagtgaaatcagactggcaacctattaattgcttccacaatgggacgaacttgaaggg12180gatgtcgtcgatgatattataggtggcgtgttcatcgtagttggtgaagtcgatggtccc12240gttccagtagttgtgtcgcccgagacttctagcccaggtggtctttccggtacgagttgg12300tccgcagatgtagaggctggggtgtctgaccccagtccttccctcatcctggttagatcg12360gccatccactcaaggtcagattgtgcttgatcgtaggagacaggatgtatgaaagtgtag12420gcatcgatgcttacatgatataggtgcgtctctctccagttgtgcagatcttcgtggcag12480cggagatctgattctgtgaagggcgacacgtactgctcaggttgtggaggaaataatttg12540ttggctgaatattccagccattgaagctttgttgcccattcatgagggaactcttctttg12600atcatgtcaagatactcctccttagacgttgcagtctggataatagttcgccatcgtgcg12660tcagatttgcgaggagacaccttatgatctcggaaatctcctctggttttaatatctccg12720tcctttgatatgtaatcaaggacttgtttagagtttctagctggctggatattagggtga12780tttccttcaaaatcgaaaaaagaaggatctctaatacaaggttttttatcaagctggata12840agagcatgatagtgggtagtgccatcttgatgaagctcagaagcaacaccaaggaagaaa12900ataagaaaaggtgtgagtttctcccagagaaactggaataaatcatctctttgagatgag12960cacttggggtaggtaaggaaaacatatttagattggagtctgaagttcttgctagcagaa13020ggcatgttgttgtgactccgaggggttgcctcaaactctatcttataaccggcgtggagg13080catggaggcaagggcattttggtaatttaagtagttagtggaaaatgacgtcatttactt13140aaagacgaagtcttgcgacaaggggggcccacgccgaattttaatattaccggcgtggcc13200ccaccttatcgcgagtgctttagcacgagcggtccagatttaaagtagaaaagttcccgc13260ccactagggttaaaggtgttcacactataaaagcatatacgatgtgatggtatttgatgg13320agcgtatattgtatcaggtatttccgtcggatacgaattattcgtacggccggaccggtc13380ccctaggccggccaattcgagatcggccgcggctgagtggctccttcaatcgttgcggtt13440ctgtcagttccaaacgtaaaacggcttgtcccgcgtcatcggcgggggtcataacgtgac13500tcccttaattctccgctcatgatcagattgtcgtttcccgccttcagtttaaactatcag13560tgtttgacaggatatattggcgggtaaacctaagagaaaagagcgtttattagaataatc13620ggatatttaaaagggcgtgaaaaggtttatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaac13680cacagggttccccagatctggcgccggccagcgagacgagcaagattggccgccgcccga13740aacgatccgacagcgcgcccagcacaggtgcgcaggcaaattgcaccaacgcatacagcg13800ccagcagaatgccatagtgggcggtgacgtcgttcgagtgaaccagatcgcgcaggaggc13860ccggcagcaccggcataatcaggccgatgccgacagcgtcgagcgcgacagtgctcagaa13920ttacgatcaggggtatgttgggtttcacgtctggcctccggagactgtcatacgcgtaaa13980aaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaat14040cgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccc14100cctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtcc14160gcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagt14220tcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgac14280cgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcg14340ccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctaca14400gagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgc14460gctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaa14520accaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaa14580ggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaac14640tcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcctttta14700aattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgcagtt14760gccatgttttacggcagtgagagcagagatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgt14820tacgcaccaccccgtcagtagctgaacaggagggacagctgatagacacagaagccactg14880gagcacctcaaaaacaccatcatacactaaatcagtaagttggcagcatcacccataatt14940gtggtttcaaaatcggctccgtcgatactatgttatacgccaactttgaaaacaactttg15000aaaaagctgttttctggtatttaaggttttagaatgcaaggaacagtgaattggagttcg15060tcttgttataattagcttcttggggtatctttaaatactgtagaaaagaggaaggaaata15120ataaatggctaaaatgagaatatcaccggaattgaaaaaactgatcgaaaaataccgctg15180cgtaaaagatacggaaggaatgtctcctgctaaggtatataagctggtgggagaaaatga15240aaacctatatttaaaaatgacggacagccggtataaagggaccacctatgatgtggaacg15300ggaaaaggacatgatgctatggctggaaggaaagctgcctgttccaaaggtcctgcactt15360tgaacggcatgatggctggagcaatctgctcatgagtgaggccgatggcgtcctttgctc15420ggaagagtatgaagatgaacaaagccctgaaaagattatcgagctgtatgcggagtgcat15480caggctctttcactccatcgacatatcggattgtccctatacgaatagcttagacagccg15540cttagccgaattggattacttactgaataacgatctggccgatgtggattgcgaaaactg15600ggaagaagacactccatttaaagatccgcgcgagctgtatgattttttaaagacggaaaa15660gcccgaagaggaacttgtcttttcccacggcgacctgggagacagcaacatctttgtgaa15720agatggcaaagtaagtggctttattgatcttgggagaagcggcagggcggacaagtggta15780tgacattgccttctgcgtccggtcgatcagggaggatatcggggaagaacagtatgtcga15840gctattttttgacttactggggatcaagcctgattgggagaaaataaaatattatatttt15900actggatgaattgttttagtacctagatgtggcgcaacgatgccggcgacaagcaggagc15960gcaccgacttcttccgcatcaagtgttttggctctcaggccgaggcccacggcaagtatt16020tgggcaaggggtcgctggtattcgtgcagggcaagattcggaataccaagtacgagaagg16080acggccagacggtctacgggaccgacttcattgccgataaggtggattatctggacacca16140aggcaccaggcgggtcaaatcaggaataagggcacattgccccggcgtgagtcggggcaa16200tcccgcaaggagggtgaatgaatcggacgtttgaccggaaggcatacaggcaagaactga16260tcgacgcggggttttccgccgaggatgccgaaaccatcgcaagccgcaccgtcatgcgtg16320cgccccgcgaaaccttccagtccgtcggctcgatggtccagcaagctacggccaagatcg16380agcgcgacagcgtgcaactggctccccctgccctgcccgcgccatcggccgccgtggagc16440gttcgcgtcgtctcgaacaggaggcggcaggtttggcgaagtcgatgaccatcgacacgc16500gaggaactatgacgaccaagaagcgaaaaaccgccggcgaggacctggcaaaacaggtca16560gcgaggccaagcaggccgcgttgctgaaacacacgaagcagcagatcaaggaaatgcagc16620tttccttgttcgatattgcgccgtggccggacacgatgcgagcgatgccaaacgacacgg16680cccgctctgccctgttcaccacgcgcaacaagaaaatcccgcgcgaggcgctgcaaaaca16740aggtcattttccacgtcaacaaggacgtgaagatcacctacaccggcgtcgagctgcggg16800ccgacgatgacgaactggtgtggcagcaggtgttggagtacgcgaagcgcacccctatcg16860gcgagccgatcaccttcacgttctacgagctttgccaggacctgggctggtcgatcaatg16920gccggtattacacgaaggccgaggaatgcctgtcgcgcctacaggcgacggcgatgggct16980tcacgtccgaccgcgttgggcacctggaatcggtgtcgctgctgcaccgcttccgcgtcc17040tggaccgtggcaagaaaacgtcccgttgccaggtcctgatcgacgaggaaatcgtcgtgc17100tgtttgctggcgaccactacacgaaattcatatgggagaagtaccgcaagctgtcgccga17160cggcccgacggatgttcgactatttcagctcgcaccgggagccgtacccgctcaagctgg17220aaaccttccgcctcatgtgcggatcggattccacccgcgtgaagaagtggcgcgagcagg17280tcggcgaagcctgcgaagagttgcgaggcagcggcctggtggaacacgcctgggtcaatg17340atgacctggtgcattgcaaacgctagggccttgtggggtcagttccggctgggggttcag17400cagccagcgctttactggcatttcaggaacaagcgggcactgctcgacgcacttgcttcg17460ctcagtatcgctcgggacgcacggcgcgctctacgaactgccgataaacagaggattaaa17520attgacaattcaatggcaaggactgccagcgctgccatttttggggtgaggccgttcgcg17580gccgaggggcgcagcccctggggggatgggaggcccgcgttagcgggccgggagggttcg17640agaagggggggcaccccccttcggcgtgcgcggtcacgcgcacagggcgcagccctggtt17700aaaaacaaggtttataaatattggtttaaaagcaggttaaaagacaggttagcggtggcc17760gaaaaacgggcggaaacccttgcaaatgctggattttctgcctgtggacagcccctcaaa17820tgtcaataggtgcgcccctcatctgtcagcactctgcccctcaagtgtcaaggatcgcgc17880ccctcatctgtcagtagtcgcgcccctcaagtgtcaataccgcagggcacttatccccag17940gcttgtccacatcatctgtgggaaactcgcgtaaaatcaggcgttttcgccgatttgcga18000ggctggccagctccacgtcgccggccgaaatcgagcctgcccctcatctgtcaacgccgc18060gccgggtgagtcggcccctcaagtgtcaacgtccgcccctcatctgtcagtgagggccaa18120gttttccgcgaggtatccacaacgccggcggccgcggtgtctcgcacacggcttcgacgg18180cgtttctggcgcgtttgcagggccatagacggccgccagcccagcggcgagggcaaccag18240cccggtgagcgtcgcaaaggcgctcggtcttgccttgctcgtcgagatctggggtcgatc18300agccggggatgcatcaggccgacagtcggaacttcgggtccccgacctgtaccattcggt18360gagcaatggataggggagttgatatcgtcaacgttcacttctaaagaaatagcgccactc18420agcttcctcagcggctttatccagcgatttcctattatgtcggcatagttctcaagatcg18480acagcctgtcacggttaagcgagaaatgaataagaaggctgataattcggatctctgcga18540gggagatgatatttgatcacaggcagcaacgctctgtcatcgttacaatcaacatgctac18600cctccgcgagatcatccgtgtttcaaacccggcagcttagttgccgttcttccgaatagc18660atcggtaacatgagcaaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtcccgg18720actgatgggctgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcggggagctgt18780tggctggctggtggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaat18840aacacattgcggacgtttttaatgtactggggtggtttttcttttcaccagtgagacggg18900caacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgct18960ggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttccgaaatcggcaaaatccct19020tataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagt19080ccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgat19140ggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagca19200ctaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaac19260gtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgccattcaggctgcgcaactg19320ttgggaaggg19330当前第1页12当前第1页12