培养增殖性肝细胞的方法与流程

本发明涉及细胞培养、优选肝细胞培养、且尤其3d细胞培养、优选3d肝细胞培养的领域。

发明背景

肝细胞是肝脏的主要实质细胞，并且占肝脏质量的至多70-85％。肝细胞是实现大部分肝功能的高度分化的细胞，所述肝功能尤其与代谢、解毒和全身稳态有关。在肝脏中，肝细胞通常是长寿的静止细胞。但是，在功能块的损伤或丧失后，肝细胞能够增殖，因此使肝脏再生。

长期以来一直追求建立肝细胞的体外培养物，目的是开发能够忠实地重现关键肝功能的体外模型。这样的模型可以用于研究中以理解和研究正常的肝功能。它们还可用于理解和研究肝脏病理学，例如病毒性肝炎，并评估候选药物的恢复肝功能的能力。此外，考虑到肝脏在代谢和解毒中的核心作用，肝细胞的体外培养物是预测新药的代谢和毒性的相关模型。具体地，原代人肝细胞(phh)的培养物被认为是用于体外评估药物代谢、药物-药物相互作用和肝毒性的黄金标准模型。最后，原代人肝细胞(phh)的体外培养物在肝疾病或病症的治疗中也代表了一种有前途的方案，例如，通过开发体外装置、肝细胞移植或三维(3d)肝细胞结构的移植作为器官移植的替代。

因此，从原代肝细胞、尤其原代人肝细胞的常规二维(2d)单层培养开始，已经设计了众多肝细胞培养系统。但是，在这样的培养物中，原代肝细胞去分化并迅速丧失肝细胞特异性的功能。此外，常规的2d单层培养不允许原代肝细胞的长期存活。已经开发了更复杂的培养系统，尤其允许更长的存活期和更好地维持肝细胞特异性的功能。例如，已经在两层胶凝的细胞外基质蛋白之间以夹心构型培养了原代肝细胞。还已经共培养肝细胞，例如与非实质肝细胞(baffet等人,1991)、肝细胞癌(hcc)细胞(jang等人,2016)或3t3成纤维细胞(berger等人,2016)一起共培养。更近来，三维(3d)培养已被显示特别适合用于获得具有稳定表型、能够保留形态、生存力和肝细胞特异性功能的肝细胞。具体地，可以获得不含原代人肝细胞的球形聚集体，例如当在超低附着平板中培养肝细胞时(bell等人,2016)，或者当将肝细胞包囊或包埋在基质或支架(诸如多糖支架，例如海藻酸盐)中时(wo2013/087843)。关键是，上述培养系统都不能实现培养的原代人肝细胞的增殖。

可以使用替代细胞系统观察增殖，所述细胞系统诸如是源自肿瘤或通过致癌永生化(即，通过细胞转化)获得的肝细胞样细胞系，或干细胞衍生的肝细胞样细胞。例如，huh-7和hepg2是从人肝细胞癌衍生出的几乎没有分化功能的肝细胞样细胞系。fa2n-4和heparg是人类永生化的细胞系，后者保留了原代人肝细胞的许多特征。但是，即使具有这些替代细胞系统，增殖和分化通常也是相互排斥的。此外，癌细胞系和永生化的细胞系不构成重现生理学人肝生物学的最佳体外模型。

迄今为止，仅用啮齿动物肝细胞观察了培养的原代肝细胞的增殖。已经用小鼠肝细胞观察了自发增殖(frémin等人,2007)，而用生长因子的刺激已经能够诱导大鼠肝细胞的增殖。例如，us2005/0244959描述了一种通过向大鼠肝细胞培养物添加至少一种细胞因子和一种生长因子(优选tnfα和egf)来诱导大鼠肝细胞的活跃体外增殖的方法。但是，与癌细胞系和永生化的细胞系一样，啮齿动物肝细胞培养物不会构成重现生理学人肝生物学的最佳体外模型。

因此，通过使用体外模型研究和利用肝细胞用于药物或治疗应用的增殖能力仍然是一个主要挑战。具体地，仍然需要能够实现人原代肝细胞的体外增殖的3d培养方法。

因此，本发明涉及一种培养动物细胞的方法，该方法允许获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构，所述增殖性动物细胞保持其表型(例如其分化状态)及其功能。本发明的方法包括：第一步，在非附着培养容器、优选低或超低附着培养容器中培养动物细胞；第二步，将动物细胞包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中；和第三步，培养被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中的动物细胞。本发明的方法特别适合用于原代人肝细胞的培养并允许获得包含增殖性原代人肝细胞的增殖性phh球状体，即具有空内腔的腺泡样结构。本发明还涉及包含增殖性原代人肝细胞的球状体及其例如用于工程改造人工肝模型或人工肝器官或用于体外评估药物或化合物的毒性和/或作用的用途。

技术实现要素：

本发明涉及一种培养动物细胞以获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构的方法，所述方法包括：

a)首先在非附着培养容器、优选低或超低附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含胶原或截短的胶原(即明胶)的培养基，由此将所述动物细胞包埋在胶原或明胶基质中；和

c)培养被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞；

由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

根据一个实施方案，本发明涉及一种培养动物细胞以获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构的方法，所述方法包括：

a)首先在非附着培养容器、优选低或超低附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含胶原、优选纤丝状胶原的培养基，由此将所述动物细胞包埋在胶原基质、优选纤丝状胶原基质中；和

c)培养被包埋在胶原基质中的动物细胞；

由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

在一个实施方案中，在如上文所述的方法的步骤b)处，将所述动物细胞转移至包含在约0.25mg/ml至约3mg/ml浓度范围内的胶原(优选纤丝状胶原)的培养基。在一个实施方案中，所述纤丝状胶原选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：i型胶原、ii型胶原、iii型胶原、v型胶原、vi型胶原、xi型胶原、xxiv型胶原、xxvii型胶原及其任何混合物。

根据一个实施方案，本发明涉及一种培养动物细胞以获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构的方法，所述方法包括：

a)首先在非附着培养容器、优选低或超低附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基，由此将所述动物细胞包埋在gelma基质中；和

c)培养被包埋在gelma基质中的动物细胞；

由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

在一个实施方案中，在如上文所述的方法的步骤b)处，将所述动物细胞转移至包含在约1％(w/v)至约20％(w/v)浓度范围内的甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基。

在一个实施方案中，在如上文所述的方法的步骤a)处，将所述动物细胞在非附着培养容器、优选低或超低附着培养容器中培养约1h至约96h的时段。

在一个实施方案中，在如上文所述的方法的步骤c)处，将被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞培养至少约2天。

在一个实施方案中，如上文所述的方法进一步包括：

d)将mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂加入被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞的培养物，由此诱导所述动物细胞的一个或多个额外增殖波。

在一个实施方案中，如上文所述的方法进一步包括：

e)将被包埋在胶原或明胶基质中的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构与胶原酶或具有溶胶原活性的酶混合物一起温育，由此将包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构与胶原或明胶基质分离。

在一个实施方案中，如上文所述的动物细胞是原代动物细胞。在一个实施方案中，如上文所述的动物细胞是原代肝细胞、优选原代人肝细胞，且如上文所述的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构是包含增殖性原代肝细胞、优选增殖性原代人肝细胞的球状体，优选地所述球状体具有包含空内腔的腺泡样结构。

本发明也涉及被包埋在胶原或明胶基质中的包含增殖性原代肝细胞的球状体，优选地其中所述球状体具有包含空内腔的腺泡样结构。在一个实施方案中，所述球状体被包埋在甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)基质中。在一个实施方案中，所述增殖性原代肝细胞是增殖性原代人肝细胞。

本发明也涉及包含增殖性原代人肝细胞的球状体用于工程改造人工肝模型或人工肝器官的用途，优选地其中所述球状体具有包含空内腔的腺泡样结构。

本发明也涉及包含增殖性原代人肝细胞的球状体用于体外评估药物或化合物的肝毒性(尤其是肝遗传毒性)和/或作用的用途，优选地其中所述球状体具有包含空内腔的腺泡样结构。在一个实施方案中，所述用途是用于体外评估药物或化合物的肝遗传毒性，优选地其中所述球状体具有包含空内腔的腺泡样结构。

本发明也涉及评估药物或化合物的毒性和/或作用的体外方法，所述方法包括：

a)根据如上文所述的方法，获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构，优选包含增殖性原代人肝细胞的球状体；

b)使包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构、优选包含增殖性原代人肝细胞的球状体与药物或化合物接触；和

c)评估所述药物或所述化合物对包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构、优选包含增殖性原代人肝细胞的球状体的毒性、遗传毒性和/或作用。

定义

在本发明中，下述术语具有下述含义：

-在数字之前的“约”涵盖所述数字的值加或减10％或更少。应当理解，术语“约”所指的值本身也被具体地并且优选地公开。

-“动物细胞”表示源自后生动物的细胞。在一个实施方案中，所述动物细胞是源自脊椎动物的细胞，所述脊椎动物可以是鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类或哺乳动物。在一个特定实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。

-“胶原”表示通常参与超分子网络的形成的细胞外基质糖蛋白的异质超家族。胶原的特征是存在三个可能相同或不相同的α链。所述三个α链形成一个三螺旋结构域，该三螺旋结构对应于由所述三个α链的胶原结构域的纠缠而产生的右手超螺旋，每个胶原结构域都采用多聚脯氨酸ii-样的左手构象。本文中使用的术语“胶原”涵盖胶原的不同亚家族，包括、但不限于纤丝状胶原；非纤丝状胶原诸如纤丝相关胶原和有关的胶原；形成串珠状长丝的胶原；短链胶原和有关的蛋白；基膜胶原和有关的胶原；跨膜胶原和胶原-样蛋白；以及其它胶原和胶原-样蛋白。本文中使用的术语“胶原”也涵盖截短的胶原。截短的胶原特别涵盖水解成较短肽的胶原，并且也可以被称作明胶。

-“胶原基质”表示由交联结构的形成而产生的三维基质，即，水凝胶，所述交联结构由胶原、尤其纤丝状胶原的聚合产生。因此，在一个实施方案中，纤丝状胶原基质是由交联结构的形成而产生的三维基质，所述交联结构由纤丝状胶原的聚合产生。本文中使用的术语“胶原基质”还可以表示由截短的胶原(即，明胶)产生的三维基质。可替换地，由截短的胶原(即，明胶)产生的三维基质可以被称作“明胶基质”。

-如在“分离的球状体”中的“分离的”表示已经从其培养环境分离的球状体。因此，在一个实施方案中，分离的球状体表示未包埋进胶原基质或明胶基质中的球状体。

-“明胶”表示胶原衍生物，即，被水解成与截短的胶原对应的较短肽的胶原。明胶也可以定义为变性胶原。明胶通过胶原(诸如i型胶原)的水解、尤其酸性或碱性水解而获得，所述水解展开胶原的三螺旋结构并导致较短肽的形成。因此，明胶具有与胶原非常相似的化学组成，但更不规则的大分子结构。根据一个特定实施方案，本发明的明胶是甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)。

-“明胶基质”表示由交联结构的形成而产生的三维基质，即，水凝胶，所述交联结构由明胶的聚合(就是说，截短的胶原的聚合)产生。根据一个特定实施方案，本发明的明胶是甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)，并且本发明的明胶基质是gelma基质。

-“gelma”、“gel-ma”或“gel-ma”表示甲基丙烯酸酯化的明胶(也被称作异丁烯酰基明胶)、明胶甲基丙烯酸酯或明胶甲基丙烯酰胺。gelma通过明胶与甲基丙烯酸酸酐的直接反应获得，导致甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯侧基对赖氨酸和羟基残基的修饰(yue等人,biomaterials.2015年12月；73:254-71)。

-“gelma基质”表示由交联结构的形成而产生的三维基质，即，水凝胶，所述交联结构由光引发剂诱导的甲基丙烯酸酯化的明胶的聚合产生。

-“水凝胶”表示交联的亲水性聚合物的水溶胀网络。本文中使用的根据本发明的水凝胶模拟天然细胞外基质(ecm)的显著要素且因此适合用于培养动物细胞的方法中。

-“原代细胞”表示从活的非癌性组织直接获取的细胞，诸如，获得自受试者的组织样品或获得自受试者的活检组织的细胞。

-“增殖标志物”表示在经历细胞分裂的动物细胞中(即在增殖性动物细胞中)特异性地检测到的标志物。增殖标志物的例子包括、但不限于核苷类似物诸如brdu(5-溴-2'-脱氧尿苷)或edu(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)在dna复制过程中在新合成的dna中的掺入，在增殖性动物细胞中特异性地存在的蛋白诸如核蛋白(例如，ki67、pcna)、细胞周期蛋白(例如，细胞周期蛋白d1、cdk2、pcna、p21、p27)的表达。在一个实施方案中，通过检测核苷类似物诸如brdu或edu在dna中的掺入来评估增殖。本文中使用的brdu或edu阳性的动物细胞(brdu⁺或edu⁺动物细胞)表示在其中检测到brdu或edu的掺入的动物细胞。用于检测核苷类似物在动物细胞中的dna掺入的方法是本领域技术人员众所周知的。在一个实施方案中，通过检测特异性地存在于增殖性动物细胞中的蛋白的表达来评估增殖。本文中使用的蛋白阳性的动物细胞是表达所述蛋白的动物细胞。例如，细胞周期蛋白d1阳性的动物细胞(细胞周期蛋白d1+细胞)是在其中分别检测到细胞周期蛋白d1的表达的动物细胞。用于检测动物细胞中的蛋白表达的方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括用于测量mrna水平的方法，例如通过rt-pct或rt-qpcr，以及用于测量蛋白表达和/或水平的方法，例如通过蛋白质印迹法和免疫定位或通过免疫组织化学。

-“增殖性原代肝细胞”表示能够在体外分裂并因此在体外增殖的原代肝细胞。在一个实施方案中，如果培养物中的原代肝细胞的总数的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％、优选至少约20％、更优选至少约30％、甚至更优选至少约40％能够在体外增殖，例如在下文定义的改良的william氏e培养基(wehh)中在约37℃和约5％co2，在80-100％、优选85-95％的湿度在体外增殖，则原代肝细胞是增殖性的。在一个实施方案中，通过测量brdu或edu掺入和/或通过检测ki67阳性的(ki67⁺)原代肝细胞，即，表达ki67的原代肝细胞，可以评估根据本发明方法的培养物中的原代肝细胞的增殖。可替换地，在一个实施方案中，通过测量细胞周期标志物诸如cdk2、细胞周期蛋白d1、p21和/或p27的表达，可以评估根据本发明方法的培养物中的原代肝细胞的增殖。在一个实施方案中，通过检测白蛋白来评估培养物中原代肝细胞的总数，其中表达白蛋白的细胞即白蛋白阳性细胞(alb⁺)被视作原代肝细胞。在一个特定实施方案中，如果培养物中alb⁺原代肝细胞的总数的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多、优选至少约20％、更优选至少约40％是增殖标志物(例如，brdu掺入、edu掺入、ki67表达或细胞周期蛋白d1表达)阳性的，则原代肝细胞是增殖性的。在一个实施方案中，根据本发明的方法在胶原或明胶基质中3d培养至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天、优选至少2天后，获得增殖性原代肝细胞。在一个实施方案中，根据本发明的方法在胶原或明胶基质中3d培养2天和至少15天之间获得增殖性原代肝细胞。在一个实施方案中，根据本发明的方法在胶原基质中的3d培养物中的增殖性原代肝细胞能够经历至少两个增殖波，优选其中第一波是在3d培养的第2天和第7天之间且第二波是在3d培养的第8天和第15天之间。在一个实施方案中，通过将mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂加入被包埋在根据本发明的胶原或明胶基质中的原代肝细胞的培养物，诱导一个或多个额外增殖波。

-“球状体”表示由自组装的动物细胞在培养物中形成的非附着多细胞3d结构。根据本发明，由动物细胞在培养物中形成的3d结构也可以被称作“类器官”。本文中使用的术语“球状体”表示动物细胞的球形聚集体。在一个实施方案中，根据本发明的方法在培养中的肝细胞，尤其原代人肝细胞，形成具有包含空内腔的腺泡样结构的球状体，并且也可以被称作肝球或类器官。因此，在一个实施方案中，根据本发明的球状体显示为由单层组织良好的动物细胞(尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞)界定的球，从而形成包含空内腔的腺泡样结构。在一个实施方案中，根据本发明的球状体具有在约50μm至约150μm范围内的直径。

-“3d培养”表示根据本发明的方法被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中的动物细胞的培养。根据本发明，在如下处理后，在胶原或明胶基质中培养动物细胞：首先在非附着培养容器(诸如低或超低附着培养容器)中温育，且然后转移至包含胶原或截短的胶原(即，明胶)的培养基。因此，本文中使用的“3d培养”对应于本发明的方法的第三步。

-“包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构”表示增殖性动物细胞的3d聚集体，即根据本发明的方法能够在体外增殖的动物细胞。在一个实施方案中，所述3d动物细胞结构是球状体。

具体实施方式

本发明涉及一种培养动物细胞的方法，其包括：

a)首先在非附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含胶原或截短的胶原(即明胶)的培养基；由此将所述动物细胞包埋在胶原或明胶基质中；和

c)培养被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞；

由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

根据一个实施方案，本发明涉及一种培养动物细胞的方法，其包括：

a)首先在非附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含胶原的培养基；由此将所述动物细胞包埋在胶原基质中；和

c)培养被包埋在胶原基质中的动物细胞；

由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

根据一个实施方案，本发明涉及一种培养动物细胞的方法，其包括：

a)首先在非附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含截短的胶原(即明胶)的培养基；由此将所述动物细胞包埋在明胶基质中；和

c)培养被包埋在明胶基质中的动物细胞；

由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

在一个实施方案中，本发明涉及一种培养动物细胞的方法，其包括：

a)首先在非附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基；由此将所述动物细胞包埋在gelma基质中；和

c)培养被包埋在gelma基质中的动物细胞；

由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

根据一个实施方案，如果动物细胞的总数的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％，优选至少约20％、更优选至少约40％是增殖标志物阳性的，例如，brdu掺入阳性的(brdu⁺)、edu掺入阳性的(edu⁺)、ki67表达阳性的(ki67⁺)或细胞周期蛋白d1表达阳性的(细胞周期蛋白d1⁺)，则动物细胞是增殖性的。

本发明的方法适合用于培养需要细胞-细胞相互作用才能存活和分化的几乎任何类型的动物细胞。

在一个实施方案中，根据本发明的方法培养的动物细胞是原代动物细胞。

在一个实施方案中，如上文所述的动物细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，如上文所述的动物细胞是灵长类动物细胞。在另一个实施方案中，如上文所述的动物细胞是人细胞。

在一个实施方案中，如上文所述的动物细胞是体细胞或分化的动物细胞。在另一个实施方案中，如上文所述的动物细胞是干细胞，尤其成体干细胞。

在一个实施方案中，如上文所述的动物细胞不是人胚胎干细胞。

根据本发明的方法可以培养的动物细胞的例子包括、但不限于：实质肝细胞诸如肝细胞；非实质肝细胞诸如库普弗细胞，胆管细胞，成纤维细胞，窦状内皮细胞和星形细胞；肺细胞；心脏细胞；肾细胞；结肠细胞；皮肤细胞；睾丸细胞；眼细胞；脑细胞；及其任何混合物。

在一个实施方案中，如上文所述的动物细胞选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：肝细胞诸如实质肝细胞(例如，肝细胞)和非实质肝细胞(例如，库普弗细胞、胆管细胞、成纤维细胞、窦状内皮细胞和星形细胞)；肺细胞诸如肺泡壁细胞；心脏细胞诸如心肌细胞、节细胞和心肌内分泌细胞；结肠细胞诸如肠上皮细胞、杯状细胞(也被称作杯形细胞)、帕内特细胞和肠内分泌细胞；皮肤细胞诸如角质形成细胞、黑素细胞、多核体细胞(corneocytes)；肾细胞诸如肾上皮细胞；睾丸细胞诸如莱迪希细胞和塞尔托利细胞；眼细胞(eyecells)诸如感光细胞、眼睛细胞(ocularcells)和角膜细胞；脑细胞诸如神经元细胞和神经胶质细胞；及其任何混合物。

在一个实施方案中，如上文所述的动物细胞选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：肝细胞、库普弗细胞、胆管细胞、成纤维细胞、窦状内皮细胞、星形细胞、肺泡壁细胞、心肌细胞、节细胞、心肌内分泌细胞、肠上皮细胞、杯状细胞(也被称作杯形细胞)、帕内特细胞、肠内分泌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、多核体细胞(corneocytes)、肾上皮细胞、莱迪希细胞、塞尔托利细胞、感光细胞、角膜细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、及其任何混合物。

在一个实施方案中，待用本发明的方法培养的动物细胞选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：肝细胞、库普弗细胞、胆管细胞、成纤维细胞、窦状内皮细胞、星形细胞及其任何混合物；优选地所述动物细胞是原代动物细胞，更优选人原代细胞。

在一个实施方案中，待用本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞，优选原代肝细胞，更优选原代人肝细胞(phh)。

在一个实施方案中，待用本发明的方法培养的动物细胞是分离的动物细胞。在一个实施方案中，待用本发明的方法培养的动物细胞获得自以前取自受试者的组织样品，例如，获得自以前采取的活检组织。在一个实施方案中，在已经从以前取自受试者的肝组织样品获得以后，将待用本发明的方法培养的动物细胞保持冷冻。

在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的原代人肝细胞获得自以前取自受试者的肝组织样品。在一个实施方案中，在已经从以前取自受试者的肝组织样品获得以后，将待根据本发明的方法培养的原代人肝细胞保持冷冻。

根据本发明的方法，首先在非附着培养容器中培养所述动物细胞。不希望受任何理论约束，申请人建议，首先在非附着培养容器中培养动物细胞能够使动物细胞形成聚集体，并因此增强细胞-细胞相互作用。细胞-细胞相互作用对于包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构(例如，球状体)的后续发育、结构化和生长而言是必需的。

申请人实际上显示，将动物细胞直接添加到包含胶原的培养基中并培养因此包埋在胶原基质中的动物细胞而没有首先在非附着培养容器中培养动物细胞，不会获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。具体地，申请人显示，必须首先在非附着培养容器中培养原代人肝细胞，然后转移至包含胶原或明胶、尤其是甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基，并在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中培养，才能获得包含增殖性原代人肝细胞的球状体。

本文中使用的术语“非附着培养容器”表示不会造成细胞、尤其动物细胞对所述容器的附着的培养容器。换而言之，在非附着培养容器中培养的细胞、尤其动物细胞不附着或极少附着、并且不会铺展至所述培养容器的内表面(即，所述培养容器的壁和/或底)。

非附着培养容器包括、但不限于由玻璃制成的培养容器、未处理的培养容器、低附着培养容器和超低附着培养容器。

本文中使用的术语“未处理的培养容器”表示未经化学处理或不具有通常施加于培养容器的涂层(为了增强细胞对培养容器的附着)的培养容器。在细胞培养的领域中，“处理过的培养容器”通常表示这样的经常由聚苯乙烯制成的培养容器，诸如平板或盘：其经过化学处理或涂覆以增强细胞、尤其动物细胞向培养容器的内表面的附着。实际上，聚苯乙烯是细胞、尤其动物细胞难以附着的非常疏水的聚合物。

在一个实施方案中，如上文所述的非附着培养容器选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：由玻璃制成的培养容器、未处理的培养容器、低附着培养容器和超低附着培养容器；优选地所述非附着培养容器是低或超低附着培养容器。

低和超低附着培养容器的例子包括、但不限于，低和超低附着盘、低和超低附着烧瓶和低和超低附着平板，例如，低和超低附着多孔平板、或低和超低附着微量培养板。

低附着培养容器和超低附着培养容器的特征在于涂层(经常是亲水凝胶)的存在，所述涂层共价结合到培养皿的内表面。所述涂层抑制特异性和非特异性固定化，并因此防止细胞附着于培养容器的内表面，因此使细胞维持悬浮状态。

低和超低附着培养容器、尤其低附着平板(lap)和超低附着(ula)平板可从供应商容易获得，并且包括例如或perkin低和超低附着平板。

可替换地，制备低附着培养容器、尤其低附着平板的方法是本领域技术人员众所周知的。这样的方法包括、但不限于用1％琼脂糖涂覆未处理的培养容器，或用聚甲基丙烯酸2-羟基乙酯(也被称作聚-hema)涂覆未处理的培养容器。

在一个实施方案中，冷冻储存待用本发明的方法培养的动物细胞。因此，在一个实施方案中，首先将待用本发明的方法培养的动物细胞解冻。

将以前冷冻的动物细胞解冻的方法是动物细胞培养领域中众所周知的。

在一个实施方案中，首先在低附着平板(lap)中或在超低附着平板(ula)(例如，或perkin低或超低附着平板)中培养待用本发明的方法培养的动物细胞。

在一个实施方案中，将所述动物细胞在如上所述的非附着培养容器中培养至少约1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h或15h。

在一个实施方案中，将所述动物细胞在如上所述的非附着培养容器中培养至多约96h、84h、72h、60h、48h、36h、24h、23h、22h、21h或20h。

在一个实施方案中，将所述动物细胞在如上所述的非附着培养容器中培养约1h至约96h、优选约5h至约48h、更优选约10h至约20h范围内的持续时间。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以至少约10²、5x10²或10³个细胞/cm²的浓度培养所述动物细胞。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以至多约10⁶、5x10⁵或10⁵个细胞/cm²的浓度培养所述动物细胞。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以在约10²至约10⁶个细胞/cm²、优选约10³至约10⁵个细胞/cm²、更优选约1x10⁴至约9x10⁴个细胞/cm²范围内的浓度培养所述动物细胞。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以在约10⁵至约5x10⁵个细胞/cm²、优选约2x10⁵至约2.5x10⁵个细胞/cm²范围内的浓度培养所述动物细胞。在一个实施方案中，在低或超低附着平板中以在约10⁶至约5x10⁶个细胞/孔、优选约2x10⁶至约2.5x10⁶个细胞/孔范围内的浓度培养所述动物细胞，所述孔优选地具有约10cm²的表面。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以约10²、10³、10⁴、10⁵或10⁶个细胞/cm²的浓度培养所述动物细胞。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以约1x10⁴、2x10⁴、3x10⁴、4x10⁴、5x10⁴、6x10⁴、7x10⁴、8x10⁴或9x10⁴个细胞/cm²的浓度培养所述动物细胞。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以至少约5x10³、10⁴或5x10⁴个细胞/ml培养基的浓度培养所述动物细胞。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以至多约2x10⁷、10⁷或5x10⁶个细胞/ml培养基的浓度培养所述动物细胞。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以在约5x10³至约2x10⁷个细胞/ml培养基、优选约10⁴至约10⁷个细胞/ml培养基、更优选约10⁵至约10⁶个细胞/ml培养基范围内的浓度培养所述动物细胞。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中以约10⁴、10⁵、10⁶或10⁷个细胞/ml培养基的浓度培养所述动物细胞。

选择适合用于培养动物细胞的条件是本领域技术人员众所周知的。因此，根据本发明的方法待用于在如上所述的非附着培养容器中培养动物细胞的培养条件，例如培养基、温度、湿度和co2水平，是本领域技术人员将显而易见的且将取决于待培养的动物细胞。

可以根据本发明的方法使用的培养基包括天然培养基和合成培养基，例如，含血清的培养基，无血清的培养基，尤其用于人细胞培养的无异种的培养基，无蛋白的培养基，化学成分确定的培养基。

培养基的例子包括、但不限于william氏e培养基、eagle基础培养基(bme)、eagle氏最低基础培养基(emem)、最低基础培养基(mem)、dulbecco氏改良的eagles培养基(dmem)、ham氏f-10、ham氏f-12培养基、kaighn氏改良的ham氏f-12培养基、dmem/f-12培养基和mccoy氏5a培养基。

根据本发明的培养基还包括适合用于培养特定类型的动物细胞的培养基，例如，适合用于培养肝细胞的培养基(例如，william氏e培养基)。

根据本发明，可以给培养基补充其它物质，诸如盐、碳源、氨基酸、血清和血清组分、维生素、矿物质、还原剂、缓冲剂、脂质、核苷、抗生素、细胞因子和生长因子。

根据一个实施方案，待用本发明的方法培养的动物细胞是原代动物细胞，优选原代人细胞，并且在如上所述的非附着培养容器中在适合用于培养原代动物细胞(优选原代人细胞)的培养基中培养它们。

适合用于培养原代动物细胞的培养基是商购可得的。适合用于培养原代动物细胞(优选原代人细胞)的培养基是本领域技术人员将显而易见的并且将取决于待培养的原代动物细胞(例如，肝细胞、肺泡壁细胞、心肌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、多核体细胞(corneocytes)或神经元细胞)。

根据一个实施方案，待用本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且在如上所述的非附着培养容器中在适合用于培养肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞的培养基中培养它们。

适合用于培养肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞的培养基的例子包括、但不限于、dulbecco氏改良的eagles培养基(dmem)、william氏e培养基、肝细胞培养基、基础heparg培养基、hbm基础培养基和肝细胞基础培养基。

根据本发明，可以给所述适合用于培养肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞的培养基补充例如l-谷氨酰胺、白蛋白、青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、丙酮酸钠、亚硒酸钠、氢化可的松或地塞米松、hgf(肝细胞生长因子)、egf(表皮生长因子)和/或也被称作fbs(胎牛血清)的fcs(胎牛血清)。

在一个实施方案中，可以给所述适合用于培养肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞的培养基补充例如庆大霉素、l-谷氨酰胺、白蛋白、青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、丙酮酸钠、亚硒酸钠、氢化可的松或地塞米松、hgf(肝细胞生长因子)、egf(表皮生长因子)和/或也被称作fbs(胎牛血清)的fcs(胎牛血清)。

在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且在低或超低附着培养容器、优选低或超低附着平板中在william氏e培养基中培养它们，所述william氏e培养基补充有青霉素、链霉素、胰岛素、谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)和白蛋白，并任选地补充有转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、hgf(肝细胞生长因子)、egf(表皮生长因子)和/或fcs(胎牛血清)，也被称作wehh(william氏e培养基人肝细胞)。

在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且在低或超低附着培养容器、优选低或超低附着平板中在包含青霉素、链霉素、胰岛素、谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)、白蛋白和任选的fcs(胎牛血清)的wehh培养基中培养它们。

在一个实施方案中，本发明的wehh培养基包含：青霉素，其浓度是在约50至约200u/ml范围内，优选约100u/ml；链霉素，其浓度是在约50至约200μg/ml范围内，优选100μg/ml；胰岛素，其浓度是在约5至约30μg/ml范围内，优选约5μg/ml或约15μg/ml；谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)，其浓度是在约1至约10mm范围内，优选约2mm；白蛋白，其浓度是在约0.01至约1％(w/v)范围内，优选约0.1％(w/v)；和fcs(胎牛血清)，其浓度是在约0至约20％(v/v)或1％至约20％(v/v)范围内，且优选约10％(v/v)。

在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且在低或超低附着培养容器、优选低或超低附着平板中，在不包含或没有补充fcs(胎牛血清)的培养基中，优选在william氏e培养基中培养它们。

在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且在低或超低附着培养容器、优选低或超低附着平板中，在补充有青霉素、链霉素、胰岛素、谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)、白蛋白和氢化可的松且任选地补充有转铁蛋白、亚硒酸钠、hgf(肝细胞生长因子)、egf(表皮生长因子)和/或fcs(胎牛血清)的wehh培养基中培养它们。

在一个实施方案中，本发明的wehh培养基补充有青霉素、链霉素、胰岛素、谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)和白蛋白，补充有或没有补充fcs(胎牛血清)。

在一个实施方案中，本发明的wehh培养基补充有青霉素、链霉素、胰岛素、谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)、白蛋白、氢化可的松、转铁蛋白、亚硒酸钠、hgf(肝细胞生长因子)和egf(表皮生长因子)，补充有或没有补充fcs(胎牛血清)。

在一个实施方案中，本发明的wehh培养基包含：胰岛素，其浓度是在约5至约30μg/ml范围内，优选范围为约5至约15μg/ml，更优选约5μg/ml或约15μg/ml；转铁蛋白，其浓度是在约0至约10μg/ml、或约0.1至约10μg/ml范围内，且优选约5.5μg/ml；亚硒酸钠，其浓度是在约0至约10μg/ml、或约0.1至约10μg/ml范围内，且优选约5μg/ml；氢化可的松，其浓度是在约0.1至约50μm范围内，优选约1μm；rhhgf(重组人肝细胞生长因子)，其浓度是在约0至约10ng/ml、或约0.1至约10ng/ml范围内，且优选约2.5ng/ml；rhegf(重组人表皮生长因子)，其浓度是在约0至约1ng/μl、或约0.01至约1ng/μl范围内，且优选约0.05ng/μl；fcs(胎牛血清)，其浓度是在约0至约20％(v/v)、或约1％至约20％(v/v)范围内，且优选约10％(v/v)；谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)，其浓度是在约1至约10mm范围内，优选约2mm；白蛋白，其浓度是在约0.01至约1％(w/v)范围内，优选约0.1％(w/v)；青霉素，其浓度是在约50至约200u/ml范围内，优选约100u/ml；链霉素，其浓度是在约50至约200μg/ml范围内，优选100μg/ml。

在一个实施方案中，如上文所述的wehh培养基进一步包含庆大霉素。

因此，在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且在低或超低附着培养容器、优选低或超低附着平板中，在补充有庆大霉素、青霉素、链霉素、胰岛素、谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)、白蛋白和氢化可的松、补充有或没有补充fcs(胎牛血清)的wehh培养基中培养它们。

在一个实施方案中，如上文所述的wehh培养基包含在约1至约100μg/ml范围内、优选约50μg/ml的浓度的庆大霉素。

因此，在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且在低或超低附着培养容器、优选低或超低附着平板中，在wehh培养基中培养它们，所述wehh培养基补充有：庆大霉素，其浓度是在约1至约100μg/ml范围内，优选约50μg/ml；青霉素，其浓度是在约50至约200u/ml范围内，优选约100u/ml；链霉素，其浓度是在约50至约200μg/ml范围内，优选100μg/ml；胰岛素，其浓度是在约5至约30μg/ml范围内，优选范围为约5至约15μg/ml，更优选约5μg/ml；谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)，其浓度是在约1至约10mm范围内，优选约2mm；白蛋白，其浓度是在约0.01至约1％(w/v)范围内，优选约0.1％(w/v)；补充有或没有补充fcs(胎牛血清)，其浓度是在约1％至约20％(v/v)范围内，且优选约10％(v/v)。

在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是人细胞，优选原代人细胞诸如原代人肝细胞，并且在非附着培养容器、优选低或超低附着培养容器中，在约37℃和约5％co2下培养它们。

根据本发明的方法，在如上所述的非附着培养容器中培养所述动物细胞允许获得所述动物细胞的聚集体。

在一个实施方案中，在如上所述的非附着培养容器中培养所述动物细胞以后，至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％、优选至少约50％的动物细胞发生聚集。

观察细胞聚集体的形成的方法是本领域技术人员众所周知的，且包括，例如，荧光显微术诸如双光子激发的荧光(tpef)显微术。

根据本发明的方法，如上所述首先在非附着培养容器中培养以后，将所述动物细胞转移至包含胶原或截短的胶原(即，明胶)的培养基中，并因此包埋在胶原或明胶基质中。不希望受任何理论约束，申请人提出，将动物细胞包埋在胶原或明胶基质中会给动物细胞提供实现动物细胞的增殖和包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构的形成的微环境。具体地，申请人提出，将原代人肝细胞(phh)包埋在胶原基质或明胶基质、尤其是甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)基质中，会给phh提供实现phh的增殖和根据本发明的phh球状体(即，由形成具有空内腔的腺泡样结构的单层组织良好的phh限定的球体)的形成的微环境。

申请人实际上显示，在不曾将动物细胞包埋在胶原或明胶基质中的情况下，如上所述在非附着培养容器中连续培养所述动物细胞不允许获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。具体地，申请人显示，首先在非附着培养容器(诸如低附着平板)中培养的原代人肝细胞必须转移至包含胶原或明胶、尤其甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基并且包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中，才能获得包含增殖性原代人肝细胞的球状体，其中所述球状体是具有空内腔的腺泡样结构，其由形成的单层组织良好的phh限定。

根据本发明，如上文所述将胶原加入培养基中，以便获得包含胶原的培养基，并因此转移首先在所述包含胶原的培养基中在非附着培养容器中培养的动物细胞。

本文中使用的术语“胶原”涵盖胶原和截短的胶原(也被称作明胶)的不同亚家族。

因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含截短的胶原(即，明胶)的培养基。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含纤丝状胶原的培养基。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含从纤丝状胶原衍生出的明胶的培养基。

纤丝状胶原的例子包括、但不限于、i型胶原、ii型胶原、iii型胶原、v型胶原、vi型胶原、xi型胶原、xxiv型胶原和xxvii型胶原。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含纤丝状胶原的培养基，所述纤丝状胶原选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：i型胶原、ii型胶原、iii型胶原、v型胶原、vi型胶原、xi型胶原、xxiv型胶原、xxvii型胶原及其任何混合物。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含从纤丝状胶原衍生出的明胶的培养基，所述纤丝状胶原选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：i型胶原、ii型胶原、iii型胶原、v型胶原、vi型胶原、xi型胶原、xxiv型胶原、xxvii型胶原及其任何混合物。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含纤丝状胶原的培养基，所述纤丝状胶原选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：i型胶原、iii型胶原、及其任何混合物。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含从纤丝状胶原衍生出的明胶的培养基，所述纤丝状胶原选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：i型胶原、iii型胶原、及其任何混合物。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含i型胶原的培养基。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含从i型胶原衍生出的明胶的培养基。在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含a型明胶、尤其从i型胶原衍生出的a型明胶的培养基。

根据本发明的方法可以使用的i型胶原的例子包括、但不限于大鼠i型胶原、牛i型胶原、猪i型胶原、来自人胎盘的人i型胶原、重组人i型胶原、来自兔皮肤的i型胶原、羊i型胶原以及来自水母和海洋物质的i型相关纤丝状胶原。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原的培养基，所述胶原的浓度为至少约0.25mg/ml、0.30mg/ml、0.35mg/ml、0.40mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.65mg/ml、0.7mg/ml或0.75mg/ml。在另一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原的培养基，所述胶原的浓度为至少约0.70mg/ml、0.71mg/ml、0.72mg/ml、0.73mg/ml、0.74mg/ml或0.75mg/ml。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原的培养基，所述胶原的浓度为至多约4mg/ml、3.75mg/ml、3.5mg/ml、3.25mg/ml、3mg/ml、2.75mg/ml、2.5mg/ml、2.25mg/ml或2mg/ml。在另一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原的培养基，所述胶原的浓度为至多约4mg/ml、3.9mg/ml、3.8mg/ml、3.7mg/ml、3.6mg/ml、3.5mg/ml、3.4mg/ml、3.3mg/ml、3.2mg/ml、3.1mg/ml或3mg/ml。在另一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原的培养基，所述胶原的浓度为至多约3mg/ml、2.9mg/ml、2.8mg/ml、2.7mg/ml、2.6mg/ml、2.5mg/ml、2.4mg/ml、2.3mg/ml、2.2mg/ml、2.1mg/ml或2mg/ml。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原的培养基，所述胶原的浓度是在约0.25mg/ml至约3mg/ml、优选约0.5mg/ml至约2.5mg/ml、更优选约0.75mg/ml至约1.5mg/ml范围内。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含约0.75mg/ml、1mg/ml、1.25mg/ml或1.5mg/ml的浓度的胶原的培养基。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的明胶的培养基，所述明胶的浓度为至少约15％(w/v)、20％(v/w)、25％(w/v)、30％(w/v)、35％(w/v)、40％(w/v)、45％(w/v)或50％(w/v)。因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的明胶的培养基，所述明胶的浓度为至少约150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml、300mg/ml、350mg/ml、400mg/ml、450mg/ml或500mg/ml。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的明胶的培养基，所述明胶的浓度为至多约60％(w/v)、55％(w/v)、50％(w/v)、45％(w/v)或40％(w/v)。因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的明胶的培养基，所述明胶的浓度为至多约600mg/ml、550mg/ml、500mg/ml、450mg/ml或400mg/ml。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的明胶的培养基，所述明胶的浓度是在约15％(w/v)至约60％(w/v)、优选约20(w/v)至约50％(w/v)范围内。因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的明胶的培养基，所述明胶的浓度是在约150mg/ml至约600mg/ml、优选约200mg/ml至约500mg/ml范围内。

在一个特定实施方案中，将所述动物细胞转移至包含甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基。

在一个实施方案中，通过用甲基丙烯酸酸酐将如上文所述的明胶甲基丙烯酸酯化而获得gelma。在一个实施方案中，通过用甲基丙烯酸酸酐将从i型胶原衍生出的明胶甲基丙烯酸酯化而获得gelma。在一个实施方案中，通过a型明胶的甲基丙烯酸酯化而获得gelma。在一个实施方案中，通过用甲基丙烯酸酸酐将从i型胶原衍生出的a型明胶甲基丙烯酸酯化而获得gelma。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的gelma的培养基，所述gelma的浓度为至少约1％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)或5％(w/v)。因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的gelma的培养基，所述gelma的浓度为至少约10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml或50mg/ml。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的gelma的培养基，所述gelma的浓度为至多约20％(w/v)、15％(w/v)、10％(w/v)、9％(w/v)、8％(w/v)、7％(w/v)、7.5％(w/v)、6％(w/v)或5％(w/v)。因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的gelma的培养基，所述gelma的浓度为至多约200mg/ml、150mg/ml、100mg/ml、90mg/ml、80mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、60mg/ml或50mg/ml。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的gelma的培养基，所述gelma的浓度是在约1％(w/v)至约20％(w/v)、优选约2.5％(w/v)至约10％(w/v)、更优选约4％(w/v)至约6％(w/v)范围内。因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的gelma的培养基，所述gelma的浓度是在约10mg/ml至约200mg/ml、优选约25mg/ml至约100mg/ml、更优选约40mg/ml至约60mg/ml范围内。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至包含约5％(w/v)的浓度(即，约50mg/ml的浓度)的gelma的培养基。

在一个实施方案中，在如上文所述的培养基中包含的胶原、截短的胶原(即，明胶)或甲基丙烯酸酯化的明胶的浓度被称作胶原、截短的胶原(即，明胶)或甲基丙烯酸酯化的明胶在所述培养基中的终浓度。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至培养基，所述培养基包含如上文所述的gelma且进一步包含光引发剂以在光暴露后诱导聚合。

光引发剂的例子包括、但不限于2,2′-偶氮二[2-甲基-n-(2-羟基乙基)丙酰胺](也被称作va-086)、1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙酮(也被称作irgacure2959)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(也被称作lap或biokey)、2′,4′,5′,7′-四溴荧光素二钠盐(也被称作曙红y或ey)。

在一个实施方案中，所述光引发剂选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：2,2′-偶氮二[2-甲基-n-(2-羟基乙基)丙酰胺](也被称作va-086)、1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙酮(也被称作irgacure2959)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(也被称作lap或biokey)和2′,4′,5′,7′-四溴荧光素二钠盐(也被称作曙红y或ey)，优选地所述光引发剂是苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(也被称作lap或biokey)。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至培养基，所述培养基包含如上文所述的gelma且进一步包含至少约0.01％(w/v)、0.05％(w/v)、0.075％(w/v)、0.1％(w/v)、0.25％(w/v)或0.5％(w/v)的浓度的如上文所述的光引发剂。因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至培养基，所述培养基包含如上文所述的gelma且进一步包含至少约0.1mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、2.5mg/ml或5mg/ml的浓度的如上文所述的光引发剂。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至培养基，所述培养基包含如上文所述的gelma且进一步包含至多约2％(w/v)、1.5％(w/v)、1％(w/v)、0.75％(w/v)、0.5％(w/v)、0.25％(w/v)、0.1％(w/v)或0.05％(w/v)的浓度的如上文所述的光引发剂。因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至培养基，所述培养基包含如上文所述的gelma且进一步包含至多约20mg/ml、15mg/ml、10mg/ml、7.5mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml或0.5mg/ml的浓度的如上文所述的光引发剂。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至培养基，所述培养基包含如上文所述的gelma且进一步包含在约0.01％(w/v)至约2％(w/v)范围内的浓度的如上文所述的光引发剂。因此，在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至培养基，所述培养基包含如上文所述的gelma且进一步包含在约0.1mg/ml至约20mg/ml范围内的浓度的如上文所述的光引发剂。

在一个实施方案中，将所述动物细胞转移至培养基，所述培养基包含如上文所述的gelma且进一步包含约1％(w/v)的浓度(即，约1mg/ml的浓度)的如上文所述的光引发剂。

在一个实施方案中，在其中加入胶原或明胶以获得包含胶原或明胶的培养基的培养基和以前用于如上文所述在非附着培养容器中培养动物细胞的培养基是不同的培养基。在另一个实施方案中，在其中加入胶原或明胶以获得包含胶原或明胶的培养基的培养基和以前用于如上文所述在非附着培养容器中培养动物细胞的培养基是相同的培养基。

如在上文中所述，待根据本发明的方法使用的培养基是本领域技术人员将显而易见的并且将取决于待培养的动物细胞。在上文中描述了可以根据本发明的方法使用的培养基。

根据一个实施方案，待用本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并将它们转移至适合用于培养肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞的培养基，所述培养基进一步包含如上文所述的胶原或明胶。

在上文中列出了适合用于培养肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞的培养基的例子。

在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并将它们转移进如上文定义的wehh，所述wehh进一步包含如上文所述的胶原或明胶。在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并将它们转移进如上文定义的wehh，所述wehh进一步包含如上文所述的甲基丙烯酸酯化的明胶。在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并将它们转移进如上文定义的wehh，所述wehh进一步包含甲基丙烯酸酯化的明胶和如上文所述的光引发剂，优选苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。

在一个实施方案中，所述wehh培养基补充有青霉素、链霉素、胰岛素、谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)、白蛋白、转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、hgf(肝细胞生长因子)和egf(表皮生长因子)和任选的庆大霉素和/或fcs(胎牛血清)。

在一个实施方案中，所述wehh培养基包含：青霉素，其浓度是在约50至约200u/ml范围内，优选约100u/ml；链霉素，其浓度是在约50至约200μg/ml范围内，优选100μg/ml；胰岛素，其浓度是在约5至约30μg/ml范围内，优选范围为约5至约15μg/ml，优选约15μg/ml；谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)，其浓度是在约1至约10mm范围内，优选约2mm；白蛋白，其浓度是在约0.01至约1％(w/v)范围内，优选约0.1％(w/v)；转铁蛋白，其浓度是在约0至约10μg/ml、或约0.1至约10μg/ml范围内，且优选约5.5μg/ml；亚硒酸钠，其浓度是在约0至约10μg/ml、或约0.1至约10μg/ml范围内，且优选约5μg/ml；氢化可的松，其浓度是在约0.1至约50μm范围内，优选约1μm；rhhgf(重组人肝细胞生长因子)，其浓度是在约0至约10ng/ml、或约0.1至约10ng/ml范围内，且优选约2.5ng/ml；rhegf(重组人表皮生长因子)，其浓度是在约0至约1ng/μl、或约0.01至约1ng/μl范围内，且优选约0.05ng/μl；和fcs(胎牛血清)，其浓度是在约0至约20％(v/v)、或约1％至约20％(v/v)范围内，且优选约10％(v/v)；和任选的庆大霉素，其浓度是在约1至约100μg/ml范围内，优选约50μg/ml。

在一个实施方案中，以至少约10³、5x10³或10⁴个细胞/ml包含胶原或明胶的培养基的浓度，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原或明胶的培养基。

在一个实施方案中，以至多约10⁷、5x10⁶或10⁶个细胞/ml包含胶原或明胶的培养基的浓度，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原或明胶的培养基。

在一个实施方案中，以在约10³个细胞/ml至约10⁷个细胞/ml、优选约10⁴个细胞/ml至约10⁶个细胞/ml、更优选约1x10⁵至约9x10⁵个细胞/ml包含胶原或明胶的培养基范围内的浓度，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原或明胶的培养基。

在另一个实施方案中，以在约3x10⁵个细胞/ml至约4.5x10⁵个细胞/ml、优选约3.25x10⁵个细胞/ml至约4x10⁵个细胞/ml、更优选约3.5x10⁵个细胞/ml至约3.75x10⁵个细胞/ml包含胶原或明胶的培养基范围内的浓度，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原或明胶的培养基。

在一个实施方案中，以约3x10⁵、3.25x10⁵、3.5x10⁵、3.65x10⁵、3.75x10⁵、4x10⁵、4.25x10⁵或4.5x10⁵个细胞/ml包含胶原或明胶的培养基的浓度，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原或明胶的培养基。在另一个实施方案中，以约3.65x10⁵个细胞/ml包含胶原或明胶的培养基的浓度，将所述动物细胞转移至包含如上文所述的胶原的培养基。

在一个实施方案中，将动物细胞转移至包含如上文所述的胶原或明胶的培养基以后，在约7至约8范围内的值，优选在约7.4的值，调节得到的混合物的ph。调节培养基的ph的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，根据需要加入适当体积的naoh溶液，可以增加培养基的ph。可替换地，根据需要加入适当体积的hcl溶液，可以降低培养基的ph。

选择适合用于培养动物细胞的条件是本领域技术人员众所周知的。因此，待根据本发明的方法使用的培养条件，例如，培养容器、温度、湿度和co2水平，是本领域技术人员将显而易见的并且将取决于待培养的动物细胞。

在一个实施方案中，将由动物细胞向包含如上文所述的胶原或明胶的培养基的转移所产生的混合物倒入培养容器诸如平板或多孔板，例如，24-孔板、48-孔板或96-孔板。本领域技术人员将显而易见，倒入培养容器中的体积将取决于培养容器的大小，例如平板的大小。在多孔板的情况下，每孔倒入的体积将取决于孔的大小且因此取决于多孔板的大小。

因此，在一个实施方案中，向96-孔板的每个孔倒入约100μl由动物细胞向包含如上文所述的胶原或明胶的培养基的转移所产生的混合物，向48-孔板的每个孔倒入约300μl，且向24-孔板的每个孔倒入约400μl。

根据本发明的方法的一个实施方案，将由动物细胞向包含如上文所述的胶原或明胶的培养基的转移所产生的混合物在培养容器、优选多孔板中温育至少约10min、20min、30min、45min、1h、2h、3h或4h，优选至少约2h。

在一个实施方案中，待根据本发明的方法培养的动物细胞是人细胞，优选原代人肝细胞，且将由所述人细胞、优选原代人肝细胞向包含胶原的培养基的转移所产生的混合物在约37℃和约5％co2、湿度80-100％、优选85-95％如上文所述温育。

根据本发明的方法的一个实施方案，在37℃温育至少约10min、20min、30min、45min、1h、2h、3h或4h、优选至少约2h以后，被包含在如上文所述的培养基中的胶原发生聚合且所述动物细胞因此被包埋在胶原基质中。

根据本发明的方法的另一个实施方案，用具有在约250nm至约530nm、优选约365至约405nm范围内的波长的光照射由动物细胞向包含如上文所述的甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基的转移所产生的混合物。在一个实施方案中，用具有约365nm或405nm的波长的光照射由动物细胞向包含如上文所述的甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基的转移所产生的混合物。

在一个实施方案中，如上文所述照射由动物细胞向包含如上文所述的甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基的转移所产生的混合物在约10秒至约10分钟、优选约30秒至约5分钟范围内的时间。

本领域众所周知，照射的时间将取决于波长和光的强度。因此，光的强度将取决于光的波长和照射时间。

光强度的例子包括在约1mw/cm²至约150mw/cm²范围内的强度。

根据本发明的方法，在照射，优选用具有约365nm或405nm的波长的光照射约60秒的时间以后，被包含在如上文所述的培养基中的甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)发生聚合且所述动物细胞因此被包埋在gelma基质中。

本发明的方法包括培养被包埋在如上文所述的胶原或明胶基质中的动物细胞的第三步，且因此允许获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构，优选球状体。

根据本发明的方法，将培养基加入包含如上文所述的胶原或明胶基质的培养容器中。

在一个实施方案中，相对于以前加入的由动物细胞向包含如上文所述的胶原或明胶的培养基的转移所产生的混合物的体积，以在约1.5:1至约1:1.5范围内的比例将培养基加入包含如上文所述的胶原或明胶基质的培养容器中。在一个实施方案中，相对于以前加入的由动物细胞向包含如上文所述的胶原或明胶的培养基的转移所产生的混合物的体积，以约1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5的比例，优选以约1:1的比例，将培养基加入包含如上文所述的胶原或明胶基质的培养容器。

在一个实施方案中，如上文所述加入的培养基和用于获得本发明的胶原或明胶基质的培养基是不同的培养基。在另一个实施方案中，如上文所述加入的培养基和用于获得本发明的胶原或明胶基质的培养基是相同的培养基。优选地，在本发明的方法的第二步和第三步中使用相同的培养基。

如在上文中所述，待根据本发明的方法使用的培养基是本领域技术人员将显而易见的并且将取决于待培养的动物细胞。在上文中描述了可以根据本发明的方法使用的培养基。

根据一个实施方案，根据本发明被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且在适合用于培养肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞的培养基中培养它们。

在上文中列出了适合用于培养肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞的培养基的例子。

在一个实施方案中，根据本发明将肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中，并在如上文定义的wehh中培养。

在一个实施方案中，所述wehh培养基补充有青霉素、链霉素、胰岛素、谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)、白蛋白、转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、hgf(肝细胞生长因子)和egf(表皮生长因子)和任选的庆大霉素和/或fcs(胎牛血清)。

在一个实施方案中，所述wehh培养基包含：青霉素，其浓度是在约50至约200u/ml范围内，优选约100u/ml；链霉素，其浓度是在约50至约200μg/ml范围内，优选100μg/ml；胰岛素，其浓度是在约5至约30μg/ml范围内，优选范围为约5至约15μg/ml，优选约15μg/ml；谷氨酰胺(l-谷氨酰胺)，其浓度是在约1至约10mm范围内，优选约2mm；白蛋白，其浓度是在约0.01至约1％(w/v)范围内，优选约0.1％(w/v)；转铁蛋白，其浓度是在约0至约10μg/ml、或约0.1至约10μg/ml范围内，且优选约5.5μg/ml；亚硒酸钠，其浓度是在约0至约10μg/ml、或约0.1至约10μg/ml范围内，且优选约5μg/ml；氢化可的松，其浓度是在约0.1至约50μm范围内，优选约1μm；rhhgf(重组人肝细胞生长因子)，其浓度是在约0至约10ng/ml、或约0.1至约10ng/ml范围内，且优选约2.5ng/ml；rhegf(重组人表皮生长因子)，其浓度是在约0至约1ng/μl、或约0.01至约1ng/μl范围内，且优选约0.05ng/μl；和fcs(胎牛血清)，其浓度是在约0至约20％(v/v)、或约1％至约20％(v/v)范围内，且优选约10％(v/v)；和任选的庆大霉素，其浓度是在约1至约100μg/ml范围内，优选约50μg/ml。

选择适合用于培养动物细胞的条件是本领域技术人员众所周知的。因此，根据本发明的方法待用于培养被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞的培养条件，例如，培养基更新、温度、湿度和co2水平，是本领域技术人员将显而易见的并且将取决于待培养的动物细胞。

在一个实施方案中，每1、2、3、4天或更多天，优选每2天，更换加入包含如上文所述的胶原或明胶基质的培养容器中的培养基。

在一个实施方案中，每24h、36h、48h、60h、72h或更久，优选每48h，更换加入包含如上文所述的胶原或明胶基质的培养容器中的培养基。

更换培养基的频率是本领域技术人员将显而易见的并且将取决于培养的目的。

在一个实施方案中，根据本发明的方法被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞是人细胞、优选原代人肝细胞，并且在约37℃和约5％co2、湿度80-100％、优选85-95％培养它们。

在一个实施方案中，将根据本发明的方法被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30或35天。

在一个实施方案中，将根据本发明的方法被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞培养至少约1、2、3、4、5或6周。

根据一个实施方案，根据本发明被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且培养它们至少约2天，以便获得包含增殖性肝细胞的3d动物细胞结构、优选球状体。

根据一个实施方案，如果原代肝细胞、优选原代人肝细胞的总数的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％、优选至少约20％、更优选至少约30％、甚至更优选至少约40％是增殖标志物阳性的，例如，brdu掺入阳性的(brdu⁺)、edu掺入阳性的(edu⁺)、ki67表达阳性的(ki67⁺)或细胞周期蛋白d1表达阳性的(细胞周期蛋白d1⁺)，那么原代肝细胞、优选原代人肝细胞是增殖性的。

在一个实施方案中，通过检测肝细胞标志物，例如，白蛋白(alb)表达，评估原代肝细胞、优选原代人肝细胞的总数。

在一个实施方案中，如果alb⁺原代肝细胞的总数的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％、优选至少约20％、更优选至少约30％、甚至更优选至少约40％是增殖标志物阳性的，例如，brdu掺入阳性的(brdu⁺)、edu掺入阳性的(edu⁺)、ki67表达阳性的(ki67⁺)或细胞周期蛋白d1表达阳性的(细胞周期蛋白d1⁺)，那么原代肝细胞、优选原代人肝细胞是增殖性的。

在一个实施方案中，原代肝细胞、尤其alb⁺原代肝细胞的总数对应于当评估增殖标志物(例如通过测量mrna表达或蛋白表达和/或水平)时观察到或考虑的原代肝细胞、尤其alb⁺原代肝细胞的总数。

在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括在如上文所述的胶原或明胶基质中在培养物中诱导所述动物细胞的一个或多个额外增殖波的步骤。

在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括在如上文所述的胶原或明胶基质中在培养物中暂时抑制动物细胞中的mapkmek1/2-erk1/2途径的步骤。

申请人实际上显示，在如上文所述的胶原基质中在培养物中暂时抑制动物细胞中的mapkmek1/2-erk1/2途径诱导所述动物细胞的一个额外增殖波。具体地，申请人显示，原代人肝细胞经历由mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂向培养物中的添加所诱导的一个额外增殖波。

如在本发明中使用的，mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂涵盖mek1/2抑制剂、mek1抑制剂、mek2抑制剂、erk1/2抑制剂、erk1抑制剂和erk2抑制剂。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括第四步(即，步骤d))：向被包埋在如上文所述的胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中的动物细胞的培养物添加mek1/2抑制剂、mek1抑制剂、mek2抑制剂、erk1/2抑制剂、erk1抑制剂或erk2抑制剂。

mek抑制剂的例子包括、但不限于u0126、pd98059、pd184352、cl-1040、fr180204和bud-523。

在一个实施方案中，在根据本发明开始培养被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞以后至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天，向被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞的培养物添加如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂。

在一个实施方案中，将如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂向被包埋在如上文所述的胶原或明胶基质中的动物细胞的培养物添加约24h、36h、48h、60h或72h，优选约48h。

因此，在一个实施方案中，在约24h、36h、48h、60h或72h以后，优选约48h以后，用不含mapkmek1/2-erk1/2途径抑制剂的培养基替换包含如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂的培养基。

在一个实施方案中，在期望时重复如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂的添加以诱导额外增殖波。

在一个实施方案中，将根据本发明的方法获得的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构、优选球状体包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中。

在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括从胶原基质或从明胶基质、尤其gelma基质分离包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构、优选球状体的步骤。

在一个实施方案中，在胶原的酶消化以后，从胶原或明胶基质分离包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构、优选球状体。因此，在一个实施方案中，在与胶原酶或具有溶胶原活性的酶混合物一起温育以后，从胶原或明胶基质分离包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构、优选球状体。

在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括最终步骤(例如，步骤e))：将被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构、优选球状体与胶原酶或具有溶胶原活性的酶混合物一起温育。

具有溶胶原活性的酶混合物的例子包括、但不限于和

本发明因此涉及一种培养动物细胞、优选原代动物细胞的方法，其包括：

a)首先如上文所述在非附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含胶原或截短的胶原(即明胶)的培养基，由此将所述动物细胞包埋在胶原或明胶基质中；

c)培养被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞，由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构；

d)任选地将如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂加入被包埋在胶原或明胶基质中的动物细胞的培养物，由此诱导所述动物细胞的一个或多个额外增殖波；和

e)任选地将被包埋在胶原或明胶基质中的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构与胶原酶或具有溶胶原活性的酶混合物一起温育，由此将包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构与胶原或明胶基质分离。

本发明也涉及一种培养动物细胞、优选原代动物细胞的方法，其包括：

a)首先如上文所述在非附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含胶原、优选纤丝状胶原的培养基，由此将所述动物细胞包埋在胶原基质、优选纤丝状胶原基质中；

c)培养被包埋在胶原基质中的动物细胞，由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构；

d)任选地将如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂加入被包埋在胶原基质中的动物细胞的培养物，由此诱导所述动物细胞的一个或多个额外增殖波；和

e)任选地将被包埋在胶原基质中的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构与胶原酶或具有溶胶原活性的酶混合物一起温育，由此从胶原基质分离包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

在一个实施方案中，本发明涉及一种培养动物细胞、优选原代动物细胞的方法，其包括：

a)首先在低或超低附着培养容器、优选低或超低附着平板中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至以在约0.25mg/ml至约3mg/ml、优选约0.5mg/ml至约2.5mg/ml、更优选约0.75mg/ml至约1.5mg/ml范围内的浓度包含纤丝状胶原、优选i型胶原的培养基，由此将所述动物细胞包埋在纤丝状胶原基质中；和

c)培养被包埋在胶原基质中的动物细胞，由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构；

d)任选地将如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂加入被包埋在胶原基质中的动物细胞的培养物，由此诱导所述动物细胞的一个或多个额外增殖波；和

e)任选地将被包埋在胶原基质中的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构与胶原酶或具有溶胶原活性的酶混合物一起温育，由此从胶原基质分离包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

本发明也涉及一种培养动物细胞、优选原代动物细胞的方法，其包括：

a)首先如上文所述在非附着培养容器中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至包含甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基，由此将所述动物细胞包埋在gelma基质中；

c)培养被包埋在gelma基质中的动物细胞，由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构；

d)任选地将如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂加入被包埋在gelma基质中的动物细胞的培养物，由此诱导所述动物细胞的一个或多个额外增殖波；和

e)任选地将被包埋在gelma基质中的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构与胶原酶或具有溶胶原活性的酶混合物一起温育，由此从gelma基质分离包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

在一个实施方案中，本发明涉及一种培养动物细胞、优选原代动物细胞的方法，其包括：

a)首先在低或超低附着培养容器、优选低或超低附着平板中培养动物细胞；

b)然后将所述动物细胞转移至以在约1％(w/v)至约20％(w/v)、优选约2.5％(w/v)至约10％(w/v)、更优选约5％(w/v)范围内的浓度包含甲基丙烯酸酯化的明胶的培养基，由此将所述动物细胞包埋在gelma基质中；和

c)培养被包埋在gelma基质中的动物细胞，由此获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构；

d)任选地将如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂加入被包埋在gelma基质中的动物细胞的培养物，由此诱导所述动物细胞的一个或多个额外增殖波；和

e)任选地将被包埋在gelma基质中的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构与胶原酶或具有溶胶原活性的酶混合物一起温育，由此从gelma基质分离包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构。

在一个实施方案中，待用本发明的方法培养的动物细胞是原代人肝细胞(phh)，并且在步骤c)中获得的包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构是包含增殖性phh的球状体。

根据一个实施方案，待用本发明的方法培养的动物细胞是原代动物细胞、尤其原代人细胞，并且本发明的方法允许获得包含增殖性原代动物细胞、尤其原代人细胞的3d动物细胞结构。

在一个实施方案中，待用本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且本发明的方法允许获得包含增殖性肝细胞、尤其增殖性原代肝细胞、优选增殖性原代人肝细胞的球状体。

在一个实施方案中，待用本发明的方法培养的动物细胞是肝细胞、尤其原代肝细胞、优选原代人肝细胞，并且本发明的方法允许获得包含增殖性肝细胞、尤其增殖性原代肝细胞、优选增殖性原代人肝细胞的球状体，其中所述球状体具有包含空内腔的腺泡样结构。

因此，本发明也涉及一种诱导原代肝细胞、优选原代人肝细胞的体外增殖的方法，所述方法包括：

a)首先在非附着培养容器、优选低或超低附着培养容器中培养原代肝细胞、优选原代人肝细胞；

b)然后如上文所述将所述原代肝细胞、优选原代人肝细胞转移至包含胶原或明胶、尤其甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基，由此将所述原代肝细胞、优选原代人肝细胞包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中；

c)培养被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中的原代肝细胞、优选原代人肝细胞，由此获得包含增殖性原代肝细胞、优选增殖性原代人肝细胞的球状体；和

d)任选地将如上所述的mapkmek1/2-erk1/2途径的抑制剂加入被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中的原代肝细胞、优选原代人肝细胞的培养物，由此诱导原代肝细胞、优选原代人肝细胞的一个或多个额外增殖波。

本发明的另一个目的是包含增殖性原代肝细胞、优选增殖性原代人肝细胞(phh)的球状体。

根据本发明的一个实施方案，所述球状体包含原代肝细胞，在如上文所述在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中培养它们的时间中，所述原代肝细胞保留它们的分化状态和它们的肝功能。

根据本发明的一个实施方案，本发明的包含原代肝细胞、优选原代人肝细胞的球状体具有包含空内腔的腺泡样结构。

在一个实施方案中，根据本发明的球状体因此表现为由单层组织良好的原代肝细胞、优选原代人肝细胞限定的球，从而形成包含空内腔的腺泡样结构。

用于评估原代肝细胞的分化状态的方法包括、但不限于：上皮标志物诸如e-钙粘着蛋白的检测和细胞内定位；和间质标志物诸如n-钙粘着蛋白、波形蛋白、细胞角蛋白8和细胞角蛋白18的检测和细胞内定位。

本文中使用的“肝功能”涵盖肝细胞特有的极化、蛋白表达、蛋白分泌和酶活性。

因此，可以如下评估肝功能，例如通过：确定胎蛋白、白蛋白和/或醛缩酶b的表达；确定白蛋白的分泌；确定异源物代谢酶诸如阶段i、阶段ii和/或阶段iii酶的表达、细胞内定位和/或活性；确定药物转运蛋白诸如mrp2和/或mrp3的表达、细胞内定位和/或活性。

在一个实施方案中，本发明的球状体包含增殖性原代肝细胞、优选增殖性phh，其可以进一步表征为是以下中的至少一种：

-极化的增殖性原代肝细胞、优选极化的增殖性phh；

-表达胎蛋白、白蛋白和/或醛缩酶b、优选白蛋白和/或醛缩酶b的增殖性原代肝细胞、优选增殖性phh；

-分泌白蛋白的增殖性原代肝细胞、优选增殖性phh；

-表达阶段i、阶段ii和/或阶段iii代谢酶的增殖性原代肝细胞、优选增殖性phh；和/或

-表达药物转运蛋白诸如mrp2和/或mrp3的增殖性原代肝细胞、优选增殖性phh。

在一个实施方案中，本发明的球状体包含极化的增殖性原代肝细胞、优选极化的增殖性phh。在一个实施方案中，本发明的球状体包含表达胎蛋白、白蛋白和/或醛缩酶b的增殖性原代肝细胞、优选增殖性phh。在一个实施方案中，本发明的球状体包含分泌白蛋白的增殖性原代肝细胞、优选增殖性phh。在一个实施方案中，本发明的球状体包含表达阶段i、阶段ii和/或阶段iii代谢酶的增殖性原代肝细胞、优选增殖性phh。在一个实施方案中，本发明的球状体包含表达药物转运蛋白诸如mrp2和/或mrp3的增殖性原代肝细胞、优选增殖性phh。

在一个实施方案中，本发明的球状体包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中。在另一个实施方案中，本发明的球状体没有被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中。因此，在一个实施方案中，本发明的球状体是分离的包含增殖性原代肝细胞的球状体。在一个实施方案中，本发明的球状体悬浮于适合用于培养原代肝细胞的培养基中。

在一个实施方案中，根据如上文所述的方法获得或易于获得本发明的球状体。因此，在一个实施方案中，根据包括以下步骤的方法获得或易于获得本发明的球状体：

a)首先在低或超低培养容器中、优选在低或超低附着平板中培养原代肝细胞；

b)然后如上文所述将所述原代肝细胞转移至包含胶原或明胶、尤其甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)的培养基，由此将所述原代肝细胞包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中；

c)培养被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中的原代肝细胞，由此获得包含增殖性原代肝细胞的球状体；和

d)任选地将被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中的包含增殖性原代肝细胞的球状体与胶原酶或具有溶胶原活性的酶混合物一起温育，由此从胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质分离包含增殖性原代肝细胞的球状体。

在一个实施方案中，如上文所述的本发明的球状体包含增殖性原代人肝细胞。

在一个实施方案中，本发明的球状体具有在约50μm至约150μm范围内的直径。

在一个实施方案中，本发明的球状体具有在约20μm至约130μm、优选约30μm至约100μm、更优选约40μm至约90μm、甚至更优选约45μm至约80μm范围内的直径。

在一个实施方案中，本发明的球状体具有在约4pl至约2000pl、优选约100pl至约600pl范围内的体积。

在一个实施方案中，本发明的球状体包含约2至约150个增殖性原代肝细胞，优选约5至约100个增殖性原代肝细胞，更优选约5至约50个增殖性原代肝细胞。

本发明也涉及如上文所述的包含增殖性原代肝细胞的球状体用于工程改造人工肝模型或人工肝器官的用途。

本发明也涉及如上文所述的包含增殖性原代肝细胞的球状体用于体外评估药物或化合物的毒性和/或作用的用途。

可以对其检查以评估药物或化合物的毒性和/或作用的参数的例子包括、但不限于细胞形态学和活力、基质重构和胶原合成、细胞死亡、细胞增殖、细胞代谢、细胞极性和细胞分化。

用于评估肝细胞的形态学和活力的方法的例子包括、但不限于通过双光子显微术成像对肝细胞或肝细胞球状体进行的对比光学显微术、共焦显微术、自发荧光成像；时间推移活力成像，和invadosomes/pmlc、mlck/rho激酶免疫定位。

用于评估基质重构和胶原合成的方法的例子包括、但不限于用二次谐波生成(shg)显微术对肝细胞球状体的成像。

用于评估细胞死亡的方法的例子包括、但不限于核碎裂的成像(tunel测定)，用于评估肝细胞的细胞凋亡的方法诸如胱天蛋白酶成像测定和胱天蛋白酶活性测定，和用于评估肝细胞的坏死的方法(用yoyo染色)。

用于评估肝细胞的增殖的方法的例子包括、但不限于从3dz-堆叠图像的双光子细胞计数、brdu掺入的确定、edu掺入的确定、有丝分裂指数的确定以及ki67、β-微管蛋白、细胞周期蛋白d1、细胞周期蛋白d2、细胞周期蛋白d3、细胞周期蛋白e、细胞周期蛋白a2、细胞周期蛋白b、cdk1、cdk2和/或auroraa的表达的免疫组织化学染色或测量。

用于评估异源物代谢或肝细胞的肝功能的方法的例子包括、但不限于以下测定：确定酶活性、蛋白和mrna表达，阶段i和阶段ii异源物代谢酶诸如cyps、gsts、ugts、nats和有关核因子car、pxr、ahr的调节；通过二乙酸荧光素加工实现的mrp2活性(与胆汁阻塞状态有关)；和确定脂质含量诸如油红染色，或bodipy493/503标记。

在一个实施方案中，将如上文所述的包含增殖性原代肝细胞的球状体用于评估药物或化合物的肝遗传毒性。

可以对其检查以评估药物或化合物的肝遗传毒性的参数的例子包括、但不限于肝细胞增殖、dna复制、染色体畸变(例如，单链和双链断裂、丢失、微核的形成)、dna损伤的存在和突变的存在。

因此，例如，通过在根据本发明的包含增殖性phh的球状体上执行的微核形成的检测、彗星测定(cometassay)、组蛋白h2ax的磷酸化的检测和外显子组测序(例如以建立与异源物暴露关联的热点标签)，可以评估药物或化合物的肝遗传毒性。

本发明也涉及评估药物或化合物的毒性和/或作用的体外方法，所述方法包括：

a)根据如上文所述的方法获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构；

b)使包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构与药物或化合物接触；和

c)评估药物或化合物对包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构的毒性和/或作用。

在一个优选的实施方案中，所述体外方法包括：

a)根据如上文所述的方法获得包含增殖性原代人肝细胞(phh)的球状体；

b)使包含增殖性phh的球状体与药物或化合物接触；和

c)评估药物或化合物对包含增殖性phh的球状体的毒性和/或作用。

如在上文中所述，可以对其检查以评估药物或化合物对包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构、尤其对包含增殖性phh的球状体的毒性和/或作用的参数包括、但不限于细胞形态学和活力、基质重构和胶原合成、细胞死亡、细胞增殖、细胞代谢、细胞极性和细胞分化。

在一个实施方案中，本发明的方法用于评估药物或化合物的肝遗传毒性。

如在上文中所述，可以对其检查以评估药物或化合物对包含增殖性phh的球状体的肝遗传毒性的参数包括、但不限于肝细胞增殖、dna复制、染色体畸变(例如，单链断裂或双链断裂、丢失、微核形成)的存在、dna损伤的存在和突变的存在。

因此，例如，通过在根据本发明的包含增殖性phh的球状体上执行的微核的检测、彗星测定(cometassay)、组蛋白h2ax的磷酸化的存在的检测和外显子组测序(例如以建立异源物标签)，可以评估药物或化合物的肝遗传毒性。

在一个实施方案中，如上文所述，将包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构，优选包含增殖性phh的球状体包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中。

在一个实施方案中，在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天以后，使包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构、优选包含增殖性phh的球状体与药物或化合物接触。在另一个实施方案中，在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中培养至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天以后，使包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构，优选包含增殖性phh的球状体与药物或化合物接触。

本发明的用于培养动物细胞的方法允许获得包含增殖性动物细胞的3d动物细胞结构，所述增殖性动物细胞保留它们的表型，例如，它们的分化状态和它们的功能。

如在下面实施例中举例说明的，申请人显示，本发明的方法特别适合用于培养原代人肝细胞并允许获得包含增殖性原代人肝细胞的球状体。特别重要的是，本发明的方法允许甚至在没有生长因子诸如hgf(肝细胞生长因子)和/或egf(表皮生长因子)存在下获得包含增殖性原代人肝细胞的球状体。本发明的方法也允许甚至在没有fcs(胎牛血清)存在下获得包含增殖性原代人肝细胞的球状体。

具体地，申请人令人惊讶地发现，原代人肝细胞保持它们的分化状态和它们的肝功能并且能够在根据本发明的方法在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中培养的第一周期间经历第一个包含至少2个细胞周期的增殖波。申请人还发现，原代人肝细胞能够在根据本发明的方法在胶原基质中培养的第二周期间经历第二个增殖波。当用抑制剂诸如mek抑制剂u0126暂时抑制mek/erk时，可以发生其它额外增殖波。

值得注意的是，申请人显示，仅当根据如上文所述的本发明的方法将原代人肝细胞首先在非附着培养容器(诸如低附着培养容器)中培养、然后在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中包埋和培养时，才发生原代人肝细胞的增殖。如果不曾被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中类似的时间和包埋在相同培养基中，在低附着培养容器中连续培养的原代人肝细胞不能增殖。类似地，直接在胶原基质中包埋和培养类似的时间和在相同培养基中的原代人肝细胞不能增殖。

本发明的方法因此允许获得非转化的增殖性人肝细胞，其是进一步开发具有治疗和药物应用的体外模型所必需的。例如，扩增原代人肝细胞的能力将最可能影响目的在于恢复受试者中的肝功能的肝细胞、球状体或类器官移植物的开发。扩增原代人肝细胞的能力还将改善用于预测候选药物和环境污染物的肝毒性和尤其肝遗传毒性的体外phh模型。

附图简要说明

图1是说明用于培养动物细胞诸如肝细胞的本发明方法的示意图。(a)本发明方法的第一步的图示：在非附着培养容器(诸如低或超低附着平板)中培养动物细胞。(b)本发明方法的第二步和第三步的图示：首先在非附着培养容器中培养的动物细胞被包埋在胶原基质或明胶基质、尤其gelma基质中(第二步)并在所述基质内培养(第三步)。

图2是一组照片，其显示了在胶原基质中的3d培养物中的原代人肝细胞(phh)的球状体的形成。在根据本发明的方法建立的3d培养物的2天(a、b)之后或7天(c、d、e、f)之后，使用双光子激发的荧光(tpef)显微术拍摄照片。将100μm深度图像堆叠(tpef堆叠)用于3d重构(b、d、f)。根据本发明的方法建立的3d培养物的15天后，使用二次谐波生成(shg)显微术，以便分析在phh球状体(g、h)周围(cs1)和之间(cs2)的胶原标签(cs)。a,c条比例尺＝100μm；e条比例尺＝20μm,h条比例尺＝50μm。

图3是一组蛋白质印迹，其显示了在对照2d培养物中(2d)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(3d)培养2、5、10和15天以后，(a)促凋亡因子(磷酸-bad、bax、bak、bid、bim和puma)和(b)促存活因子(mcl1、bcl2-xl、bcl2)在phh中的表达。将β-肌动蛋白用作负载对照。数据代表至少三次独立实验。

图4是一组直方图(a)和蛋白质印迹(b)，其显示了参与间质-至-上皮转化(met)的因子的表达。(a)直方图，其显示了在对照2d培养物中(白色)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(黑色)培养4和15天以后，在phh中的e-钙粘着蛋白、n-钙粘着蛋白、波形蛋白、细胞角蛋白8和细胞角蛋白18的mrna表达。所述mrna表达对应于关于在对照2d培养物中培养4天以后的表达水平的比率。(b)蛋白质印迹，其显示了在对照2d培养物中(2d)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(3d)培养2、5、10和15天以后，在phh中的波形蛋白、n-钙粘着蛋白和e-钙粘着蛋白的表达。将β-肌动蛋白用作负载对照。

图5是一组直方图，其显示了在对照2d培养物中(白色)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(黑色)培养4、15和28天(最后一个仅关于hnf4α)以后，在phh中的以下对象的mrna表达：肝细胞分化标志物(a),阶段i的药物代谢酶(b),阶段ii的药物代谢酶(c),药物转运蛋白(d),cyp调节剂(e),3-mc诱导24h(5μm)以后的cyp1a2(f)和hnf4α(g)。所述mrna表达对应于关于在对照2d培养物中培养4天以后的表达水平的比率。从至少三次独立实验的一次代表性实验获得指示的值(平均值±sd,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。(h)直方图，其显示了在对照2d培养物中(白色)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(黑色)培养4和15天以后，3-mc诱导24h(5μm)以后的cyp1a(erod)活性和在phh中的基础cyp1a2(mrod)活性。

图6是用荧光显微术获得的一组照片，其显示了在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中4、15和28天以后，在phh球状体中的药物转运蛋白mrp2和mrp3、白蛋白和核的定位。使用二乙酸荧光素cdfda测定法评价mrp2功能活性，其显示了在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中4、15和28天以后，phh球状体的中央腔中的基质的明显流出。条比例尺＝25μm。

图7a是一组在hes染色以后获得的照片，其显示了在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中在2、4、6、10和15天以后的phh球状体。条比例尺＝25μm。图7b-c的一组图显示了随着培养时间而变化的phh球状体的平均直径(μm)的演变(b)，和随着培养时间而变化的具有<60μm的直径的phh球状体的数目和具有>60μm的直径的phh球状体的数目(c)。

图8的一组图显示了:(a)基于增殖标志物ki67和白蛋白在核中的表达的定量，在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中的phh随时间的增殖(表示为ki67⁺和alb⁺的核的百分比)；(b)在对照2d培养物中(白色)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(黑色)培养2和4天以后，增殖标志物cdk2、细胞周期蛋白d1、pcna、p21、p27在phh中的mrna表达。所述mrna表达对应于关于在对照2d培养物中培养2天的表达水平的比率。

图9的一组图显示了：(a)在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中的brdu掺入的定量；(b)基于增殖标志物ki67(灰色框)和brdu的掺入(黑色线)的同时定量，在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中的phh随时间的增殖(表示为增殖细胞的百分比)；(c)如通过指示的ki67染色和brdu掺入所检测到的，从不同供体的肝细胞在胶原基质中根据本发明的方法建立的8个3d培养物中在第2和7天之间增殖波的图示。

图10是一组直方图，其显示了如下证实的在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中，两个增殖波在phh中的存在：(a)在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物经13天的ki67⁺/alb⁺核的百分比的定量；(b)在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物经15天的细胞周期蛋白d1⁺/alb⁺核的百分比的定量；(c)在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物经15天的brdu掺入的定量。

图11a的示意图说明了在培养的第一周期间(第一个增殖波:平均在第3天和第7天之间)和在培养的第二周期间(第二个增殖波:平均在第9天和第14天之间)来自不同供体的肝细胞在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中发生的增殖波。图11b是在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中10天以后，在phh球状体中的磷酸-组蛋白h3(处于细胞周期的m期中的细胞的标志物)、白蛋白和核的免疫染色的图示。条比例尺＝25μm。图11c是在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物经15天的磷酸-组蛋白h3⁺/alb⁺核的定量。

图12说明了在mek-erk途径的暂时阻断以后在phh中观察到的增殖。(a)蛋白质印迹，其显示了在第12天和第14天之间在加入u0126(+)或dmso(-)的情况下在对照2d培养物中(2d)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(3d)培养14天以后的erk磷酸化的抑制。(b)在第12天和第14天之间在用u0126进行mek抑制以后在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中的phh在第12天和第18天之间的增殖。通过增殖标志物ki67的定量(表示为ki67⁺和alb⁺的核的百分比)来评估增殖。使用dmso替代u0126完成阴性对照。(c)在第15天和第17天之间在用u0126进行mek抑制以后在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中的phh在第13天和第21天之间的增殖。通过增殖标志物细胞周期蛋白d1的定量(表示为细胞周期蛋白d1⁺和alb⁺的核的百分比)来评估增殖。使用dmso替代u0126完成阴性对照。

图13的直方图显示了在对照2d培养物中(2d)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(3d)与指示浓度的指示遗传毒性药物一起温育9天以后，通过在单个phh中的尾巴dna的百分比评价的dna损伤。对照：没有遗传毒性药物；afb11:0.1μm；afb12:0.5μm；4-abp1:1μm；4-abp2:10μm。

图14的直方图显示了在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(3d)与指示浓度的指示遗传毒性药物一起温育9天以后，通过免疫染色评估的γh2ax-阳性的phh的数目的定量。t：没有遗传毒性药物；cis1:5μg/ml顺铂；cis2:10μg/ml顺铂；afb11:0.1μmafb1；afb12:0.5μm；4-abp1:1μm；4-abp2:10μm。

图15是一组照片，是在hes染色后获得的一组照片，其显示了在甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中5、10和15天以后的phh球状体。条比例尺＝50μm。数据代表三次独立实验。

图16是用荧光显微术获得的一组照片，其显示了在甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中10天以后，在phh球状体中的n钙粘着蛋白、白蛋白和核的定位。条比例尺＝50μm。数据代表三次独立实验。

图17的直方图显示了基于phh中的增殖标志物细胞周期蛋白d1和白蛋白的表达的定量，在甲基丙烯酸酯化的明胶(gelma)基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中的phh随时间的增殖(表示为细胞周期蛋白d1⁺和alb⁺细胞的百分比)。

实施例

下述实施例进一步举例说明了本发明。

实施例1：

材料和方法

材料

细胞

通过centrederessourcesbiologiques(crb)-santéofrennes(chrupontchaillou,rennes,法国)从由于原发性肝细胞癌或肝转移经历肝切除术的患者获得人肝样品。在法国法律指南和当地机构伦理委员会下进行研究方案。在下面表1中详述了人肝样品的临床特征。

表1:从其获得人肝样品的供体的临床特征

通过两步胶原酶灌注程序分离人肝细胞，并将实质细胞维持在改良的william氏e培养基(称作wehh(人肝细胞))中，该培养基包含青霉素(100u)、链霉素(100μg/ml)、胰岛素(15μg/ml)、谷氨酰胺(2mm)、白蛋白(0.1％(w/v))、转铁蛋白(5.5μg/ml)、亚硒酸钠(5μg/ml)、氢化可的松(1μm)、hgf(肝细胞生长因子)(2.5ng/ml)、egf(表皮生长因子)(0.05ng/μl)，含有或没有fcs(胎牛血清)(10％(v/v))。

试剂

细胞增殖试剂wst-1、liberase(10μg/ml)和秋水仙胺(1μm)获得自roche。顺铂获得自mylan。i型胶原、乙氧基试卤灵、甲氧基试卤灵、hoechst、5(6)-羧基-2',7'-二氯二乙酸荧光素(cdfda,10μm)、1xits(胰岛素,转铁蛋白,硒)和抗β-肌动蛋白抗体(a-5441,1/1000)获得自sigma-aldrich。brdu(rpn201v,1:1000)和抗-brdu抗体(rpn202,1:100)获得自gehealthcare(chicago,usa)。rhegf获得自promega(fitchburg,usa)，且rhhgf获得自r&dsystems。抗-hsc-70抗体(sc-7298,1:5000)获得自santa-cruzbiotechnology。抗-ki67(ma5-14520,1:400)抗体获得自invitrogen。针对磷酸-p44/42mapk(thr202/tyr204)(9106,1:1000)、e-钙粘着蛋白(3195,1:100)、促凋亡的bcl-2家族(1:500)和促存活的bcl-2家族(1:500)的抗体获得自cellsignaling。抗-n-钙粘着蛋白抗体(610921,1:100)获得自bdbiosciences。针对mrp2(ab3373,1:100)和细胞周期蛋白d1(ab16663,1:100)的抗体获得自abcam。抗-波形蛋白抗体(m0725,1:1000)获得自dako。抗磷酸-组蛋白h3(ser10)抗体(06-570,1:100)获得自merck，且抗-白蛋白抗体(a80-229a,1:100)获得自bethyllaboratories,inc。mek抑制剂u0126(50μm)获得自promega。

方法

原代人肝细胞2d培养物

作为对照，将如下所示在低附着平板中形成的原代人肝细胞(phh)的聚集体接种在标准多孔平板中并在相同培养基(即，在上文中描述的wehh培养基)中培养。

原代人肝细胞3d培养物

如图1所示，将如上所述分离的原代人肝细胞(phh)首先在低附着平板中培养(图1a)。然后，将因此获得的phh的聚集体包埋在胶原基质(也被称作胶原凝胶)中并进一步在胶原基质中培养(图1b)。

在低附着平板中培养：将分离的人肝细胞在6-孔低附着平板中以2x10⁶至2.5x10⁶个细胞/孔的浓度在we或wehh中在37℃、5％co2、湿度85-95％下温育一夜(约15-20h)。

包含在胶原基质中、随后培养被包埋在胶原基质中的肝细胞：将来自sigma-aldrich的3mg/ml或6mg/ml的i型胶原稀释进wehh培养基中以获得所需浓度的胶原溶液。将人肝细胞以3.65x10⁵个细胞/ml的浓度加入包含胶原的wehh中，并用0.1n的naoh将ph调至7.4。将得到的人肝细胞和包含胶原的dmemhh的混合物倒入96-孔平板(100μl)或48-孔平板(300μl)中，并在37℃、5％co2、湿度85-95％下温育。至少2h以后，凝胶发生聚合，并加入与凝胶体积相等体积的wehh培养基。将包埋在凝胶基质中的肝细胞在如上所述的改良的wehh中在37℃、5％co2、湿度85-95％下培养至少2天。肝细胞在胶原基质中的包含因此允许肝细胞的3d培养。

此后，在实施例1中，术语“3d培养物”表示如上文所述建立的phh的培养物，其中根据本发明的方法首先在低附着平板中温育(或培养)phh，随后将phh包含在胶原基质中。

但是，培养时间的任何提及，例如，培养的第5天，表示在胶原基质中(或关于2d对照条件在标准多孔板中)的培养时间。换而言之，此后提及的任何培养时间不包括在低附着平板中的温育(或培养)时段。

将胶原凝胶包含在石蜡中

在4％的福尔马林(也被称作甲醛)中固定以后，如下将胶原凝胶脱水：在递增浓度的酒精和二甲苯浴中连续温育，然后使用excelsiores工具(thermofisherscientific,waltham,usa)用石蜡浸渍。浸渍以后，将凝胶包含在石蜡块中并制作4μm切片。

肝细胞dna合成

胸苷类似物brdu的掺入用作细胞增殖的指标。掺入24h后，将胶原凝胶中的细胞固定在乙醇-甘氨酸中，并如上所示将其包含在石蜡中。使用抗-brdu抗体(rpn202,1:100)检测brdu阳性细胞。

免疫组织化学

使用discoveryrhodamine试剂盒(ventanamedicalsystems,tucson,usa)在discoveryautomatedihc染色机上进行免疫组织化学染色。在75℃用ventanaezprep溶液脱石蜡8min后，使用基于tris的缓冲溶液cc1(ventanamedicalsystems,tucson,usa)在95℃至100℃进行抗原修复36min。将内源过氧化物酶在37℃用3％h2o2(ventanamedicalsystems,tucson,usa)封闭8min。用反应缓冲液(roche,basel,瑞士)冲洗后，将载玻片与期望的第一抗体的适当稀释液一起在37℃温育60min。冲洗后，使用ventanarhodamine试剂盒进行信号增强，并与第二抗体抗-兔hrp(roche,basel,瑞士)一起温育16min。从仪器中取出后，将载玻片手动冲洗，用白蛋白(1:100)、用于白蛋白检测的第二抗体(驴抗-山羊655，1:250)和hoechst(1:1500)染色，并盖上盖玻片。

rt-qpcr分析

通过用10μg/ml的liberase酶掺合物(roche,basel,瑞士)在37℃作用15min，从胶原凝胶提取细胞。然后，使用nucleospinrna(macherey-nagel,hoerdt,法国)从细胞沉淀物提取总rna，并用nanodropnd-1000(nanodroptechnologies,wilmington,usa)测量总rna的浓度。使用highcapacitycdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems,saintaubin,法国)将总rna用于cdna合成。根据生产商的推荐，使用sybrgreen技术，用powersybrgreenpcr主混合物(appliedbiosystems,saintaubin,法国)和cfx384real-time系统(biorad)对所有基因进行实时pcr。在下面表2和3中描述了所用的引物序列。

使用比较回归方法，使用bioradcfxmanager软件分析扩增曲线。将gapdh用于表达数据的归一化。使用2-δδct方法确定样品中测得的mrna的相对量，其中δδct＝(ct靶标-ctgapdh)样品-(ct靶标-ctgapdh)校准品。将最终结果表示为与校准品的平均表达值相比测试样品中靶基因表达的n倍差异。给出至少三次独立实验的一次代表性实验的值。

表2:正向引物序列

表3:反向引物序列

免疫印迹法分析

通过用10μg/ml的liberase酶掺合物(roche,basel,瑞士)在37℃作用15min，从胶原凝胶提取细胞。从细胞沉淀物提取蛋白样品并定量。然后将蛋白样品使用sds-page分离并在转移缓冲液(25mmtris,200mm甘氨酸,乙醇20％)中转移到硝酸纤维素膜上。将印迹在室温用tris-缓冲盐水(tbs)(65mmtrisph7.4,150mmnacl)中的5％低脂奶封闭1h。将印迹与期望的第一抗体一起在4℃温育过夜。将印迹用tbs洗涤，并与小鼠-igghrp或兔-igghrp第二抗体(1:1000)一起在tbs中的5％低脂奶中在室温温育1h。然后将印迹用tbs洗涤。使用immobilonwesternchemiluminescenthrp底物(millipore,merck,darmstadt,德国)进行化学发光反应以后，用fujifilmlas-3000成像仪(fujifilm,tokyo,日本)使免疫复合物显影。使用multigauge软件(fujifilm,tokyo,日本)进行条带的密度计分析。

mrp2转运蛋白活性

将基于荧光的外流测定用于研究3d原代人肝细胞(phh)培养物中的mrp2转运蛋白活性。膜可渗透的且非荧光的底物5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯二乙酸荧光素(cdfda)进入肝细胞，在那里其通过细胞内非特异性酯酶的水解产生荧光产物。该产物(其为膜转运蛋白mrp-2的底物)从肝细胞流出到胆小管中。

将3d培养物与cdfda(10μm)一起温育10min。然后用无血清培养基替换染料溶液2h。将培养物用pbs溶液洗涤2次，然后使用显微术评估荧光。

cyp活性测量

如burke和mayer(burke和mayer,1983)所述，在培养的肝细胞中测量了分别与cyp1a1/2和1a2活性有关的乙氧基试卤灵o-去乙基化(erod)和甲氧基试卤灵o-去乙基化(mrod)。简而言之，将细胞用磷酸盐-缓冲盐水在37℃洗涤，然后与水杨酰胺(1.5mm)一起温育以封闭阶段ii-缀合酶。在1min以后加入7-乙氧基试卤灵或7-甲氧基试卤灵，并在37℃在20min期间每2min通过荧光检测来测量底物的氧化。反应速率与时间成线性关系。在评估p4501a1/2和1a2活性之后，进行基于比色测量wst-1的测定以用活细胞的数量以将所述活性归一化。值(pmol/min/od)对应于三次测量的平均值±标准偏差。

有丝分裂指数

为了测量在根据本发明的方法建立的3d培养物中培养的phh的有丝分裂指数，使用微管-解聚药物秋水仙胺将细胞停滞在分裂中期。将细胞用秋水仙胺处理24h，然后固定在4％的福尔马林中。通过对磷酸化的组蛋白h3的免疫染色，进行有丝分裂指数的定量。

成像

使用双光子激发的荧光(tpef)显微术(也被称作非线性的、多光子或双光子激光扫描显微术)对培养的肝细胞进行观察和成像。tpef显微术是共焦和解卷积显微术的替代技术，其特别适合用于深层和高分辨率三维成像。tpef可以观察未染色或染色的内源性自发荧光样品。与允许观察可超极化的纤丝状蛋白(诸如1型或3型胶原)的二次谐波生成(shg)结合，这些方法提供了细胞和胶原基质在空间上分辨的3维结构的图像。shg成像系统由共焦sp5扫描头(leicamicrosystems，mannheim,德国)组成，该扫描头安装在dmi6000倒置显微镜(leicamicrosystems)上并配有maitai飞秒激光(spectraphysics,santaclara,ca)。使用了高na水浸物镜(lumfl60w×1.1na；olympus,tokyo,日本)。使用水浸冷凝器(s1，na＝0.9；leicamicrosystems)沿向前方向收集shg信号。在光电倍增管和油浸物镜10x/0.4hcplapo油或20x/0.7hcplapo油之前放置一个405-20带通滤光片。

统计分析

将结果表示为平均值±标准偏差。采用双尾student氏t-检验分析数据。当p<0.05(*)、p<0.01(**)或p<0.001(***)时，差异被视作显著的。所有实验进行至少3次。

结果

在lap中预培养后在胶原基质中的3d培养允许成体原代人肝细胞的长期存活

如上文所述，将原代人肝细胞首先在低附着平板中培养15h，然后在有适当的生长因子/细胞因子混合物存在下包埋在胶原凝胶中。如图2a-b所示，包含在胶原凝胶中以后2天(d2)，原代人肝细胞显示为分离的细胞或小的圆形细胞簇，该簇没有任何膜延伸且没有任何特定组构(关于3d重构，参见图2b)。这些簇具有非常不均一的大小，并且没有较好地组织。但是，如图2c-d所示，在包含在胶原凝胶中以后7天(d7)，原代人肝细胞的簇数更高，并且所述簇更大，因此显示胶原基质可随着培养时间影响簇形成。如图2e-f所示，在第7天进行的tpef成像和z堆叠重构显示，原代人肝细胞的簇已组织成具有空内腔的不同大小的腺泡样结构。这些腺泡样结构(也被称作肝球或球状体)的特征是，包埋在胶原基质中的一层组织良好的肝细胞的存在。包含在胶原凝胶中以后15天(d15)，shg显微术显示，在距球状体一定距离处，胶原纤维显得松弛，具有光滑的随机取向的纳米纤维(图2g)。这些胶原纤维似乎更集中在球状体的邻近微环境中，并且也被拉伸，从而限制了球状体体积(参见图2h上的胶原标签cs-1)。值得注意的是，胶原纤维的平行束垂直于密集球状体分布(参见图2h上胶原标签cs-2)。因此，所有这些观察结果证实，当被包埋在胶原凝胶中时，成体原代人肝细胞可以形成腺泡样结构，即，球状体。该过程似乎是动态的，并且球状体似乎能够在培养时间内重塑胶原基质。

然后，通过分析一组促凋亡因子和促存活因子来评价原代人肝细胞(phh)的长期存活。如图3所示，在对照2d培养物中或在如上文所述建立的3d培养物中在phh中评估了促凋亡因子(磷酸-bad、bax、bak、bid、bim、puma)(图3a)和促存活因子(mcl1、bcl2-xl、bcl2)(图3b)在培养时间内的表达。评估的大多数促凋亡蛋白的表达在对照2d培养物内的phh中和在3d培养物内的phh中似乎相似。在3d培养物内的phh中，仅p-bad的磷酸化程度低于2d培养物中的phh。相比之下，在2d培养物内的phh中促存活蛋白的表达迅速降低，而在3d培养物内的phh中它们的表达得以维持并且对于某些而言实际上上调(bcl2-xl、bcl2)。促存活蛋白表达的差异在第5天开始清楚可见，并在此后增加直到培养的至少第15天。此外，在3d培养物内的phh中未检测到裂解的胱天蛋白酶3，但通过顺铂处理在3d培养物内的phh中可诱导胱天蛋白酶依赖性的细胞凋亡(数据未显示)。总之，这些数据证实，3d培养物内的phh不经历细胞凋亡。

在lap中预培养后在胶原基质中的3d培养允许成体原代人肝细胞的稳定分化

如图4所示，通过rt-qpcr和蛋白质印迹法的分析显示，3d培养物内的phh的长期存活与上皮标志物(e-钙粘着蛋白)的表达的增加以及间质标志物(n-钙粘着蛋白、波形蛋白、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18)的表达的减少有关。在相同的生长因子/细胞因子的刺激下，在mrna水平(图4a)和在蛋白水平(图4b)，在3d培养物内的phh中n-钙粘着蛋白和波形蛋白的表达均显著低于在对照2d培养物内的phh中。值得注意的是，从培养的第2天开始和在以后，在对照2d培养物内的phh中n-钙粘着蛋白的表达迅速增加。在3d培养物内的phh中e-钙粘着蛋白在mrna水平高度表达，并且该表达随着培养时间进一步增加。此外，phh球状体中的免疫检测显示n-和e-钙粘着蛋白在顶膜、侧膜和基底膜处的不同定位。更准确地说，在第5天和第15天之间可以在顶膜和侧膜处清楚地看到增加的e-钙粘着蛋白标记，而与它们在人肝内肝细胞中的特异性定位相一致，n-钙粘着蛋白优先定位于侧膜和基底膜(数据未显示)。令人感兴趣的是，mkl1/mrtf-a转录因子(巨核母细胞性白血病1/心肌蛋白相关的转录因子)(其已被描述为力介导的依赖性的(willer等人,2017；flouriot等人.2014))仅在3d培养物内的phh中显示出核定位。在2d培养物内的phh中，无论是在细胞核中还是在细胞质中都没有检测到转录因子(数据未显示)。

总之，这些数据指示，如上文所述建立的3d培养物内的phh中的蛋白表达显著不同于在对照2d培养物内的phh中的蛋白表达，并且非常类似于原位肝细胞的蛋白表达。

在lap中预培养后在胶原基质中的3d培养物内的成体原代人肝细胞展示肝功能

为了确定3d培养对人肝细胞分化的影响，通过rt-qpcr进行了分析，以研究甲胎蛋白、白蛋白、醛缩酶b和阶段i-ii-iii异源物代谢酶(也被称作解毒酶)的mrna表达水平。如图5a所示，在相同的生长因子/细胞因子混合物的刺激下，在3d培养物内的phh中的甲胎蛋白、白蛋白和醛缩酶b的mrna表达显著高于对照2d培养物内的phh中。如图5b-d所示，阶段i(cyp1a2、cyp3a4、cyp2e1)、阶段ii(gsta1/2、ugt1a1、nat2)和阶段iii(mrp2、oct1)解毒酶也在3d培养物内的phh中高表达。

rt-qpcr分析还显示，与对照2d培养物内的phh中相比，在3d培养物内的phh中与解毒途径(car、pxr和ahr)的调节有关的转录因子的表达受到强诱导(图5e)。cyp1a2(mrod)活性在3d培养物内的phh中显著增加，且令人感兴趣的是，仅在3d培养物内的phh中观察到cyp1a(erod)活性的3-甲基胆蒽(3-mc)诱导的增强(图5h)。所述增强表明，根据上文所述的方法被包埋在胶原基质中的原代人肝细胞具有高解毒能力。观察到在相同的生长因子/细胞因子混合物刺激下，与对照2d培养物内的phh中相比显著增加的3d培养物内的phh中的cyp1a2mrna表达，从而证实了3d培养物内的phh中cyp1a活性的明显3-mc诱导(图5f)。在第4、15和28天，在3d培养物内的phh中核受体hnf4α的mrna表达也比在2d培养物内的phh中高(图5g)。

如图6所示，药物转运蛋白mrp2仅定位在顶-侧区域和顶/胆小管结构域。此外，使用二乙酸荧光素cdfda测定对mrp2功能活性的评价显示，在第4、10、28天，在phh球状体的中央腔中有明显的流出。药物转运蛋白mrp3定位在顶和侧结构域上。

在lap中预培养以后在胶原基质中的3d培养物内的phh球状体的形成

在培养的两周内评估了肝球状体的大小和形态(图7)。在苏木精、曙红和藏红花(hes)染色后观察细胞，并对球状体的平均直径进行定量。在培养的两周中，所有的球状体仅显示一层细胞，并展示具有空内腔的腺泡样结构(参见图6和7a)。

如上面指出的，形成球状体的phh是极化的，这可以通过药物转运蛋白mrp2在顶-侧区域和顶/胆小管结构域的排它定位而明显观察到。此外，如上面指出的，形成球状体的phh保持它们的分化状态和它们的肝功能。

在用本发明的方法获得的球状体中未检测到低氧和/或细胞凋亡标志物的表达。此外，在3d培养过程中，球状体的尺寸没有随时间而减小。相反，如图7a-b所示，球状体的尺寸随时间逐渐增加。

在lap中预培养后在胶原基质中的3d培养物内的成体原代人肝细胞的增殖

如上所述，球状体的尺寸随时间逐渐增加。值得注意的是，具有小于60μm的直径的肝细胞球状体的数量减少，而具有大于60μm的直径的球状体的数量逐渐增加(图7c)。如下表4中所示，尺寸定量表明，球状体的平均直径从第2天的47.62μm±1.61μm增加到第10天的72.04μm±6.92μm，大致对应于球状体体积的3倍增加。在第15天，球状体尺寸稳定或略有减小，此后保持不变(表4和未显示的结果)。

表4:3d培养物内的phh球状体的尺寸的定量

接着，在培养的前8天中定量ki67和brdu阳性细胞的数量。ki67和brdu都是细胞增殖的标志物，且ki67和brdu阳性细胞都是正在经历s期的细胞。从8位不同的患者分离出肝细胞(参见表1)，并在3d和2d培养物中分析了ki67染色或brdu标记。检测了白蛋白(其是成熟肝细胞功能的标志物)作为阳性对照，以仅定量alb⁺肝细胞。如图8a和9a-b所示，在第2天和第7天之间观察到的大量ki67⁺/alb⁺和/或brdu⁺/alb⁺肝细胞证明增殖性原代人肝细胞在如上文所述建立的3d培养物中的存在。在相同的生长因子/细胞因子混合物的刺激下，在对照2d培养物中未检测到ki67⁺肝细胞。对细胞周期标志物cdk2、细胞周期蛋白d1、pcna、p21和p27的表达进行的rt-qpcr分析显示，与第2天的3d以及第2和4天的2d相比，所述细胞周期标志物在第4天在3d培养物中最高表达(图8b)。总之，对来自8位不同患者的原代人肝细胞的3d培养物的分析给出了高度相似的结果(图9c)，表明大量在标志物表达的动力学方面仅有微小差异的ki67⁺/alb⁺和brdu⁺/alb⁺肝细胞的存在。相反，对照2d培养物中的alb⁺肝细胞总是ki67^-和brdu^-(数据未显示)。来自所有实验的ki67⁺/alb⁺肝细胞的累积/累加指数的平均值达到280％(+/-60％)，表明原代人肝细胞可以在如上文所述建立的3d培养物的第一周期间经历至少2个细胞周期。

结果首次清楚地证明，如上文所述建立的胶原凝胶中的3d培养物提供了微环境，该微环境使得成体原代人肝细胞能够增殖，尤其在有生长因子混合物存在下。相反，即使在相同的生长因子混合物存在下，对照2d培养物内的phh也没有增殖。

在如上文所述从七个不同供体建立的原代人肝细胞的3d培养物中接种后的前15天期间，进行了ki67(图10a)和细胞周期蛋白d1(图10b)表达的分析以及brdu掺入的分析(图10c)。如在图11a中所示，所述3d培养物中的原代人肝细胞在培养的第二周期间在第8天和第15天之间(取决于供体)会经历第二个增殖波。通过磷酸-组蛋白h3免疫染色也检测到这两个连续的增殖波(图11b)，从而允许定量用秋水仙胺处理24小时后在细胞周期的m期受阻的细胞的比例。累积的有丝分裂指数(图11c)显示，在培养的第一周期间约300％的细胞处于m期中，且在第二周期间约200％的细胞处于m期中。此后，不再检测到ki67、细胞周期蛋白d1和brdu阳性细胞(结果未显示)。

暂时mek/erk途径抑制诱导新的增殖波

如上文所述，对根据本发明的方法从分离自不同供体(hl-a至hl-j,参见表1)的肝细胞建立的所有3d培养物的分析证明了成体人肝细胞在第2天和第15天之间的增殖能力，具有增殖应答的小变化，这取决于供体。培养两周后未检测到进一步的增殖。先前显示，mek/erk途径的暂时激活会刺激啮齿动物肝细胞中的dna复制，而mek/erk途径的抑制会阻断啮齿动物肝细胞增殖。还显示mek/erk途径的持续激活可能对大鼠肝细胞增殖具有负面作用(fremin等人,2009)，并且级联的过度激活也可以抑制人肝癌细胞系huh-7中的细胞复制(guegan等人,2015)。在第12天或第15天在如上文所述建立的3d培养物中用mek抑制剂u0126暂时抑制mapkmek1/2-erk1/2途径48h后，评估了原代人肝细胞的增殖。在所有培养条件下在u0126处理结束时，erk1/2磷酸化的控制证实了erk1/2活性的强抑制(图12a)。除去mek抑制剂后，累积的ki67(图12b)和细胞周期蛋白d1(图12c)阳性细胞表明，50％至70％的细胞可以经历新的细胞周期(ki67⁺/alb⁺和细胞周期蛋白d1⁺/alb⁺)。类似的暂时mek/erk抑制后，在dmso对照实验中或在对照2d培养物中没有检测到阳性细胞(数据未显示)。

实施例2：

材料和方法

材料

细胞

如上文所述获得原代人肝细胞(phh)。

方法

原代人肝细胞培养

如上文所述建立原代人肝细胞3d培养物(参见实施例1)。简而言之，首先在低附着平板中培养phh。然后，将因此获得的phh的聚集体包埋在胶原基质中，并进一步在胶原基质中培养。

培养基

将phh在上文定义的wehh培养基中培养(参见实施例1)。

免疫组织化学

如上文所述进行免疫组织化学染色以评估phh的增殖。

结果

进一步研究了生长因子刺激对于根据本发明的3d培养物中phh的增殖的重要性。在剥夺了egf、hgf和/或its(胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠)的wehh培养基中如上文所述培养胶原基质中的phh。还在剥夺了fcs的wehh培养基中如上文所述培养胶原基质中的phh。如下表5中所示，通过定量细胞周期蛋白d1⁺/alb⁺细胞的数量相对于培养物对照(wehh培养基)中阳性细胞的百分比，评估在不同培养基中培养的phh的增殖，并与检测到的细胞数有关。

表5：关于对照培养条件(wehh培养基)在不同培养基中的增殖性phh的百分比

数据来自三次实验的一次代表性实验。

当在包含50μm浓度(即，比对照条件下的浓度高50倍的浓度)的氢化可的松(“hydron”)的wehh培养基中生长时，pph展示与当它们生长在对照条件下时观察到的结果相似的增殖的百分比。在混合物中存在的每种生长因子的单独剥夺(“-egf”、“-hgf”或“-its”)仅导致phh增殖的部分减少(至多30％减少)。此外，egf、hgf和its的伴随剥夺(“-egf/-hgf/-its”)或胎牛血清的单独剥夺(“-fcs”)都没有消除phh的增殖。因此，这些结果证实，即使在不存在egf、不存在hgf和/或不存在its的情况下，phh也可以在根据本发明的3d培养物中增殖。令人惊讶的是，观察到的结果也证实，即使在没有胎牛血清(fcs)的情况下，phh也可以在根据本发明的3d培养物中增殖。

还评估了胶原劲度对phh增殖的影响。如下表6中所示，通过定量细胞周期蛋白d1⁺/alb⁺细胞的数量相对于胶原基质对照(1.5mg/ml)中阳性细胞的百分比，评估在指定的胶原基质中培养的phh的增殖，并与检测到的细胞数量有关。使i型胶原浓度从1.5mg/ml增加到3mg/ml或4mg/ml，分别诱导约50％和80％的phh增殖减少。相反，使i型胶原浓度从1.5mg/ml降低至0.75mg/ml，不会诱导phh增殖的减少。因此，这些结果证实，增加3d基质的胶原浓度并因此增加基质劲度，以浓度依赖性的方式抑制肝细胞的增殖。

表6：与对照培养条件(1.5mg/ml胶原)相比在不同培养条件下增殖性phh的百分比

令人惊讶的是，直接包埋在3d胶原凝胶中并在wehh培养基中培养(没有在低附着平板中预先温育)的phh展示非常低的增殖率(16.9％,参见表6)。类似地，如果不曾包埋在3d胶原基质中，在低附着平板中在wehh培养基中培养的phh展示非常低的增殖率(11.7％,参见表6)。

总之，这些结果证实，3d微环境和受控的胶原劲度是诱导人成体原代肝细胞增殖的主要因素。此外，这些结果显示，需要首先在非附着培养容器(例如，低附着平板)中温育(或培养)phh并随后将phh包含在胶原基质中才能诱导成体phh的增殖。

实施例3：

材料和方法

材料

细胞

如上文所述获得原代人肝细胞(phh)(参见实施例1)。

方法

原代人肝细胞培养

如上文所述建立在胶原基质中的原代人肝细胞2d和3d培养物(参见实施例1)。如上文所述在wehh培养基中培养phh。

彗星测定(cometassay)

从培养开始将在对照2d培养物中(2d)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(3d)的phh与指示浓度(参见表7)的指示遗传毒性药物一起温育。9天后，通过纯化的胶原酶的作用，从胶原基质提取phh。将细胞沉淀物重新悬浮于0.5％低熔点琼脂糖中并铺在用常规琼脂糖覆盖的常规显微镜载玻片上。将电泳迁移处理并在用碘化丙啶染色后，使用荧光显微镜获得至少100个图像。使用cometassayiv软件分析图像。通过尾巴dna的百分比，评价单个细胞中的dna损伤的程度。

表7:遗传毒性药物

在phh处理后的γh2ax免疫染色

从培养开始将根据本发明的方法建立的胶原基质中的3d培养物内的phh(3d)与指示浓度(参见表7)的指示遗传毒性药物一起温育。9天后，如上文所述进行免疫组织化学染色以检测磷酸化的h2ax(即，γh2ax)(dna双链断裂的一种标志物)在phh中的存在。

结果

为了评估包含增殖性phh的球状体作为测试药物诱发的遗传毒性的模型的灵敏度，研究了两类化合物对所述球状体的影响：烷化剂，即，顺铂(磷酸化的组蛋白γh2ax测定,参见图14)，其在没有被代谢的情况下对dna发挥直接作用；2种经证实的致癌原，即，4-abp(4-氨基联苯)和afb-1(黄曲霉毒素b1)，其仅在代谢激活后才变得遗传毒性(图13和14)。从3d培养开始，在它们增殖期间将原代人肝细胞与遗传毒性药物一起温育9天。

为了对比这些化合物在对照2d培养物中(2d)或在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中(3d)的诱导的遗传毒性，进行了彗星测定(cometassay)。在2d培养物中，4-abp和afb1仅造成非常低的损伤水平(约3％)。相反，在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中，afb-1造成高的且剂量依赖性的dna损伤水平(高达约25％)，且4-abp1造成更高的(约2倍)且剂量依赖性的dna损伤水平(图13)。

为了证实这些结果，通过免疫染色定量了在胶原基质中根据本发明的方法建立的3d培养物中的γh2ax阳性细胞的数量。因此，用3种受试药物观察到了非常高的dna损伤水平：顺铂在约90％的phh中诱导dna损伤，4-abp在约50％的phh中诱导dna损伤，且afb1在约35％的phh中诱导dna损伤(图14)。

因此，这些结果证实，由于它们的高度分化和增殖状态，包含增殖性phh的球状体构成用于测试环境化合物和化学化合物的遗传毒性的相关模型。

实施例4：

材料和方法

材料

细胞

如上文所述获得原代人肝细胞(phh)(参见实施例1)。

试剂

甲基丙烯酸酯化的明胶获得自artbio-encres(accélérateurderecherchestechnologiquesdel’inserm,波尔多)。苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)获得自tci。

方法

在明胶甲基丙烯酸酯(gelma)中的原代人肝细胞培养

以与图1所示类似的方式，将如上所示(参见实施例1)分离的原代人肝细胞(phh)首先在低附着平板中培养(图1a)。然后，将因此获得的phh的聚集体包埋在gelma基质(也被称作gelma水凝胶)中并在gelma基质中进一步培养(图1b)。

在低附着平板中培养：如上所示(参见实施例1)，在包含庆大霉素(50μg/ml)、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)、胰岛素(5μg/ml)、l-谷氨酰胺(2mm)、白蛋白(0.1％(w/v)且含有或不含fcs(胎牛血清)(10％(v/v))的改良的william氏e培养基中，将分离的人肝细胞在6-孔低附着平板中以约3x10⁶个细胞/孔的浓度在37℃、5％co2、湿度100％下温育2天(约48h)。

包含5％gelma的培养基的制备：在包含庆大霉素(50μg/ml)、青霉素(100u/ml)、链霉素(100mg/ml)、胰岛素(15μg/ml)、l-谷氨酰胺(2mm)、白蛋白(0.1％(w/v))、转铁蛋白(5.5μg/ml)、亚硒酸钠(5μg/ml)、氢化可的松(1μm)、hgf(肝细胞生长因子)(2.5ng/ml)、egf(表皮生长因子)(0.05ng/μl)且含有或不含fcs(胎牛血清)(10％(v/v))的改良的william氏e培养基中，将冷冻干燥的gelma的小碎片(最高达2mm长度)在37℃溶解最少8h。以10mg/ml的浓度加入一定体积的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)以获得包含5g/100ml的gelma浓度(即，5％gelma的终浓度)和100mg/ml的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的终浓度(即，0.1％lap的终浓度)的改良的william氏e培养基。在使用前，将包含5％gelma和0.1％lap的培养基在37℃避光保存。

包含在gelma基质中，随后培养被包埋在胶原基质中的肝细胞：将人肝细胞转移至合适的容器诸如eppendorf试管(1.5或2ml)或falcon试管(15ml)并以200g离心2min。除去上清液并加入包含5％gelma和0.1％lap的培养基以获得约10⁶个人肝细胞/mlgelma基质(即，包含5％gelma和0.1％lap的培养基)的浓度。将100μl包含5％gelma、0.1％lap和人肝细胞的培养基加入96-孔板的孔。可替换地，将300μl包含5％gelma、0.1％lap和人肝细胞的培养基加入48-孔板的孔。通过用365、405nm或530nmled照射30秒至10min，优选通过用405nmled照射60秒，诱导gelma基质的聚合。在gelma基质的聚合以后，加入与gelma基质的体积等体积的相同的改良的william氏e培养基。将被包埋在gelma基质中的肝细胞在如上所述的改良的william氏e培养基中在37℃、5％co2、湿度100％下培养至少2天。每48h更换培养基。

结果

在lap中预培养以后在gelma基质内的3d培养物中形成phh球状体

在培养的两周中评估了肝球状体的大小和形态(图15)。在苏木精、曙红和藏红花(hes)染色后观察细胞。在培养的两周中，所有球状体仅显示一层细胞，并展示具有空内腔的腺泡样结构(参见图15和16)。

与在胶原基质中培养的phh球状体一样，在gelma基质中培养的形成球状体的phh是极化的，这通过药物转运蛋白mrp2在顶-侧区域和顶/胆小管结构域处的排它定位来显著观察到。

在lap中预培养以后成体原代人肝细胞在gelma基质中的增殖

在将根据本发明的方法建立的3d培养物接种在gelma基质中以后，在30天中通过分析细胞周期蛋白d1和白蛋白(alb)表达来评估原代人肝细胞在gelma基质中的增殖(图17)。

从第2天可以检测到alb⁺/细胞周期蛋白d1⁺phh，从而证实phh能够在gelma基质中在根据本发明的方法建立的3d培养物中增殖。如图17所示，在增殖波期间，观察到约60％的最大增殖水平。

序列表

<110>国家健康科学研究所

雷恩第一大学

公共卫生高等研究学院

g·柏菲特

s·朗圭特

f·伊赞

s·罗斯

m·库维利埃

<120>培养增殖性肝细胞的方法

<130>cv-956/pct

<160>54

<170>bissap1.3.6

<210>1

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