一种基于DSN循环扩增技术对多种microRNA同时进行检测的液相色谱法的制作方法

本发明涉及一种基于双链特异核酸切割酶(dsn)循环扩增技术对多种microrna同时进行检测的液相色谱法，属于核酸检测技术领域。

背景技术：

目前普遍认为，microrna(mirna，也称微rna)是一系列内源性非编码小核糖核酸分子(18-25个核苷酸(nt))，在细胞分化、增殖、凋亡、死亡等生物进化过程中发挥重要作用。mirna的异常表达与各种疾病的发生、发展密切相关，尤其是各种类型的人类癌症、神经系统疾病、病毒感染和糖尿病。因此，mirna被认为是这些疾病的有价值的生物标志物。但是，通常一种疾病可能与多种mirna相关，或者一种特异性mirna的异常表达可能与多种疾病相关。因此，仅分析单一的mirna生物标志物不足以为癌症的早期诊断或监测癌症的治疗效果提供有说服力的证据。为了应对这一挑战，研究人员越来越重视通过开发各种检测方法来灵敏地分析多种mirna。

迄今为止，为了分析多种mirna，通常根据两种策略来设计方法。第一种策略是设计使用具有不同信号的探针。例如，ye及其同事提出了利用荧光拉曼双信号可切换纳米探针开关同时定量检测mirna-21和mirna-203。该策略适用于多种mirna的同时检测。但是通常提出的检测多种mirna的方法无法在一次测试中实现，比如，同一样本需使用相同的仪器进行多次检测，或者通过使用两个不同的仪器来检测不同的mirna。第二种策略依赖于通过高效液相色谱(hplc)分离mirna。高效液相色谱法是一种高效的分离技术。但由于不同mirna之间的差异太小，导致其分离效果仍不理想。尽管nakayama等人成功分离了四种类型的mirna，但这是通过纳米流动lc，使用串联质谱(ms/ms)进行mirna检测。为了区分五种mirna的重叠信号(保留时间非常接近)，xu等人引入了五种dna-肽探针作为这五种mirna的标记物进行lc-ms/ms分析。但是，串联质谱得到的数据的过程通常是繁琐的。此外，这些检测技术的检测限与利用遗传技术的检测限是远比不上的。因此，在一次测试中对多个mirna进行高灵敏分析是非常迫切的。

为了提高mirna检测的灵敏度，开发了许多信号放大策略。如热循环扩增技术，包含有实时pcr扩增(qrt-pcr)技术，滚环扩增技术，催化发夹组装技术等，再比如链置换扩增(sda)技术，它包括酶促sda和无酶sda等。其中，作为一种简单有效的策略，dsn辅助目标回收实现信号循环扩增已被尝试用于mirna的检测。在文献报道中，研究人员结合磁珠(mbs)的优良分离和dsn辅助的靶标回收，开发了一种简单、灵敏、高选择性的分析mirna的检测方法。也有研究人员尝试将dsn与lc-ms/ms结合起来进行mirna的检测。然而，它只适用于一种类型的mirna，因为涉及到dsn辅助扩增的探针不能被hplc有效地分离。

技术实现要素：

发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于双链特异核酸切割酶(dsn)循环扩增技术对多种microrna同时进行检测的液相色谱法。该方法采用高效液相色谱和dsn循环扩增相结合的方法，能够对多种mirna同时进行高灵敏度检测。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于双链特异核酸切割酶(dsn)循环扩增技术对多种microrna同时进行检测的液相色谱方法，包括以下步骤：

(1)根据待检测的目标microrna，设计荧光基团修饰的单链dna探针，然后将其装载至链霉亲和素包被的磁珠(mbs)表面作为检测探针；

(2)在上述检测探针中加入待检测的目标mirna样品和dsn，充分混合，孵育；

(3)孵育后，将磁珠和未反应的dna探针完全去除，得分离液；

(4)将分离液注入到高效液相色谱系统进行分离和定量。

作为优选：

步骤(1)中，所述磁珠上包被的链霉亲和素结合位点的摩尔量与dna探针摩尔量的比例为(3-5):1。

步骤(1)中，装载过程在2×b&w缓冲液中进行，所述缓冲液是由tris-hcl和edta、nacl配制成。

步骤(2)中，所述待检测的目标microrna选自两种、三种或者多种不同目标microrna的组合；所述目标microrna为具有18-25个核苷酸的microrna。

作为本发明的一种具体实施方案，所述目标mirna选自mirna-155和mirna-21，步骤(1)中对应的单链dna探针选自p155和p21：

p155的序列为5’-生物素-t9acccctatcacgattagcattaat3-荧光基团-3’。

p21的序列为5’-生物素-t9tcaacatcagtctgataagctat25-荧光基团-3’。

步骤(2)中，所述孵育是在36-38℃下孵育140-160分钟。

步骤(3)中，利用永磁体将磁珠和未反应的dna探针完全去除。

步骤(4)中，所述高效液相色谱系统采用c18反向色谱柱，采用梯度洗脱模式。

进一步优选，所述梯度洗脱模式为：甲醇的比例在20分钟内从10％变化到60％；流动相由有机相和包含teaa的水相组成。

优选，所述方法的过程均在避光条件下进行。

本发明首先将生物素和荧光基团修饰的多种长度不同、碱基序列不同的单链dna装载至磁珠(mbs)表面作为检测探针。磁珠上的dna探针(例如p155和p21)与匹配的目标mirna杂交形成dna/rna异源双链。在双链特异核酸切割酶(dsn)的作用下，双链中的dna被切割，导致含有荧光基团的不同长度的dna探针的解离和目标mirna的释放，所释放的目标mirna进行下一次循环。利用永磁铁将mbs上未反应的dna探针完全去除，使背景信号最小化。由于切割后的探针的长度和碱基序列不同，在色谱图中保留时间各异：较短的dna探针(p155)的保留时间为5.6min，较长的dna探针(p21)的保留时间为7.8min，从而实现了多种mirna的同时检测。该方法对mirna-155的检测限为0.33fm，对mirna-21的检测限为0.24fm，线性范围均为1.0fm至10pm。所建立的方法成功应用于检测红斑狼疮、宫颈癌、卵巢癌患者和健康人血清样本中的mirna-155和mirna-21。后续研究表明，该方法通合理设计dna探针，也可实现对mirna-155，mirna-21和mirna122三种mirna的同时检测。由此推论，该方法对两种，三种及以上的mirna(例如microrna-141、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7i、microrna-200、microrna-203、microrna-223、microrna-16、microrna-125b、microrna-199a、microrna-182-5p、microrna-210、microrna-200b、microrna-200c、microrna-429、has-microrna-20a、has-microrna-20b中的两种或两种以上的组合，或者与前述microrna的组合)，即2-24种的组合以及更多的组合均适用。

有益效果：相对于现有技术，本发明方法能利用常用的液相色谱仪实现对多种mirna的同时检测，仪器成本低，操作方便，方法的灵敏度高，检测限低，线性范围广。如示例中：对mirna-155的检测限为0.33fm，对mirna-21的检测限为0.24fm，线性范围均为1.0fm至10pm。所建立的方法能够成功应用于检测红斑狼疮、宫颈癌、卵巢癌患者和健康人血清样本中的mirna-155和mirna-21。

附图说明

图1基于dsn循环扩增技术同时检测mirna-155和mirna-21的高效液相色谱分析方法机理图。

图2为dna探针的色谱图，其中：a为相同长度(25nt)不同碱基序列的dna探针的色谱图；b为不同长度相同碱基序列(胸腺嘧啶)的dna探针的色谱图。

图3为验证同时检测mirna-155和mirna-21可行性的荧光信号图，(a)空白，(b)0.4udsn，(c)100pmmirna-155+100pmmirna-21，(d)100pmmirna-155+0.4udsn，(e)100pmmirna-21+0.4udsn，(f)100pmmirna-155+0.4udsn+100pmmirna-21。(实验条件：100nmdna探针，25mmmg²⁺，ph8.0，40℃下孵育150min)

图4为实验条件的优化图，100pm的目标mirna-155和mirna-21,100nmdna探针：(a)dsn的浓度从0.05u到0.50u；(b)缓冲溶液ph值从6.5到9；(c)mg²⁺浓度从10mm到35mm；(d)不同浓度mg²⁺存在时探针的色谱图；(e)孵化温度从30℃到60℃；(f)孵化时间从30min到210min的优化图。

图5为mirna的色谱图和校准曲线，其中：a为不同浓度的目标mirna的色谱图(实验条件：100nmdna探针，0.4udsn，40℃下孵育150min)；b为mirna-155的校准曲线(实验条件：100nmdna探针，0.4udsn，40℃下孵育150min)；c为mirna-21的校准曲线(实验条件：100nmdna探针，0.4udsn，40℃下孵育150min)。

图6为对mirna-155和mirna-21的选择性检测图：m1(单碱基不匹配)、m2(双碱基不匹配)和nm(无碱基匹配)，每个mirna的浓度为100pm。

图7为原始的和加入一定量的mirna的血清样本的色谱图(实验条件：100nmdna探针，25mmmg²⁺，ph8.0，40℃下孵育150min)。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明方法做出进一步说明。

一种基于dsn循环扩增技术对多种microrna同时进行检测的液相色谱方法，包括以下步骤：

首先将40μl粒径为300nm的链霉亲和素包被的磁珠加入到1.5ml的棕色聚丙烯离心管中，磁性分离移去溶剂并将mbs保留在管中。再用1×b&w缓冲液洗涤3次后，将mbs重新分散于90μl2×b&w缓冲液中，同时加入5μl10μm不同长短的dna探针(本示例中，p155为35nt，p21为58nt)。为了保证探针上的生物素和磁珠的链霉亲和素能充分结合，在室温下轻轻涡流15分钟。磁性分离取上清液，在激发波长495nm，发射波长518nm处进行荧光检测。然后根据荧光数据估算了探针与mbs之间的偶联效率。据估计，约有～1.1×10⁴个dna探针(p155和p21的总和)偶联到每个mb，约占mbs总容量的17％。因此，有足够的空间进行目标mirna杂交和dsn切割。最后，将得到的长、短dna探针与mb偶联物在杂交缓冲液中洗涤、分散，并在4℃下储存备用。

在对目标mirna检测前，首先对所有实验条件进行优化。将39μl100nm的p155和p21加入到离心管中，然后再加入0.4u的dsn和5μl的两种浓度的目标mirna。随后进行约2秒的短暂的震荡处理，使反应混合物充分混合。在37℃下孵育150分钟后，用永磁体将mbs连同未反应的dna探针分离出来。最后，将上清液注入高效液相色谱系统进行分离和定量。

采用岛津lc-20a系统，配备岛津rp-20a荧光检测器进行高效液相色谱分析。数据采集和处理使用lcsolution数据分析软件(免费版)完成。使用phenomenonex的clarity反向色谱柱(50×4.6mm(内部直径),3μm粒径)用于mirna的分离。柱温保持在35℃。采用梯度洗脱模式。荧光检测器的参数设置为：激发波长为495nm，发射波长为518nm。

所述1×b&w缓冲液是由5.0mmtris-hcl和0.5mmedta、1.0mnacl配制成实验所需的ph＝7.5的1×b&w缓冲液。所述2×b&w缓冲液是由10.0mmtris-hcl和1.0mmedta、2.0mnacl配制成实验所需的ph＝7.5的2×b&w缓冲液。所述杂交缓冲液是由50mmtris-hcl和25mmmgcl2配制成实验所需的ph＝8的杂交缓冲液。

本实验所述色谱柱的固定相为十八烷基(c18)。c18柱是典型的反相(rp)柱，常用于保留和分离疏水化合物。然而，寡核苷酸具有很强的极性，很难保留在任何rp柱中。因此，在流动相中加入50mmteaa作为离子对试剂，使该柱上的dna探针保留时间更长。

本实验为了防止暴露于可能对荧光基团的荧光性质产生不利影响的光照下，所有与荧光基团相关的步骤均在铝箔包裹的离心管中进行。

本实验采用的梯度洗脱模式为：甲醇的比例在20分钟内从10％变化到60％，流速为1ml/min。

本实验的流动相由有机相：甲醇，水相：50mmteaa水溶液和5％乙腈组成。

通过上述方法检测，本发明方法实现了对多种mirna的同时检测。示例中，对mirna-155的检测限为0.33fm，对mirna-21的检测限为0.24fm，线性范围均为1.0fm至10pm。所建立的方法成功应用于检测红斑狼疮、宫颈癌、卵巢癌患者和健康人血清样本中的mirna-155和mirna-21。

采用上述方法，对健康人血清样本、红斑狼疮、宫颈癌、卵巢癌患者血清样本中的mirna-155和mirna-21进行检测，具体实例如下：

实施例1、健康人血清样本中mirna-155和mirna-21的检测：

对健康人血清样本中mirna-155和mirna-21的检测结果如表1所示，健康人血清样本中分别检测到0.086pm的mirna-155和0.040pm的mirna-21。为了评估基质效应，在样品1中还分别加入0.05pm、0.5pm和5pm的mirna-155和0.05pm、0.5pm和5pm的mirna-21。结果如表1所示，获得了较好的回收率(97.0-103％)。相对标准偏差(rsd)为1.70％～3.70％。这些结果与qrt-pcr的结果一致。以上结果清楚地表明，本文提出的方法对于实际样品中多个mirna的分析具有良好的实用性。

表1健康人血清样本中mirna-155和mirna-21的检测

^a相对回收率＝(总浓度-空白浓度)/掺入浓度

实施例2、红斑狼疮患者血清样本中mirna-155和mirna-21的检测：

对红斑狼疮患者血清样本中mirna-155和mirna-21的检测结果如表2所示，红斑狼疮患者血清样本中分别检测到0.399pm的mirna-155和0.034pm的mirna-21。与健康人相比，红斑狼疮患者的mirna-155有明显的过度表达。这些结果与qrt-pcr的结果一致。以上结果清楚地表明，本文提出的方法对于实际样品中多个mirna的分析具有良好的实用性。

表2红斑狼疮患者血清样本中mirna-155和mirna-21的检测

^a相对回收率＝(总浓度-空白浓度)/掺入浓度

实施例3、卵巢癌患者血清样本中mirna-155和mirna-21的检测：

对卵巢癌患者血清样本中mirna-155和mirna-21的检测结果如表3所示，卵巢癌患者血清样本中分别检测到0.090pm的mirna-155和0.137pm的mirna-21。与健康人相比，卵巢癌患者的mirna-21有明显的过度表达。这些结果与qrt-pcr的结果一致。以上结果清楚地表明，本文提出的方法对于实际样品中多个mirna的分析具有良好的实用性。

表3卵巢癌患者血清样本中mirna-155和mirna-21的检测

实施例4、宫颈癌患者血清样本中mirna-155和mirna-21的检测：

对宫颈癌患者血清样本中mirna-155和mirna-21的检测结果如表4所示，卵巢癌患者血清样本中分别检测到0.317pm的mirna-155和0.080pm的mirna-21。与健康人相比，宫颈癌患者的mirna-155和mirna-21有明显的过度表达。这些结果与qrt-pcr的结果一致。以上结果清楚地表明，本文提出的方法对于实际样品中多个mirna的分析具有良好的实用性。

表4宫颈癌患者血清样本中mirna-155和mirna-21的检测

^a相对回收率＝(总浓度-空白浓度)/掺入浓度。