氨基酰化酶-1的用途的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，涉及玉米氨基酰化酶-1基因在提高细菌抗聚乙二醇能力和改善植物生长性能方面的用途。

背景技术：

氨基酰化酶-1具有结合zn²⁺离子的锌结合结构域和促进锌结合结构域二聚的主域，其活性位点位于两个锌结合域之间^[1-2]。结合锌通过促进n-酰基-l-氨基酸底物的结合，引起构象转移，蛋白质的亚单位在底物周围聚集，从而使催化得以发生^[3]。

氨基酰化酶-1(酰化酶i；n-酰基-l-氨基酸酰胺水解酶)参与n-酰化或n-乙酰化氨基酸的水解(除了l-天冬氨酸)，当l-氨基酸的n-端共价结合到酰基上时，形成n-酰基-l-氨基酸。酰基为氨基酸提供了稳定性，使其更耐降解。但n-酰基-l-氨基酸不能直接用作构建蛋白质的基块，必须先通过氨基酰化酶-1转化为l-氨基酸，而l-氨基酸产物可用于生物合成或分解代谢能量。

氨基酰化酶-1在动物机体内参与调节细胞对氧化应激作用，并参与氨基酸代谢和尿素循环，而植物中尿素循环的意义在于合成精氨酸，个别植物也可产生尿素，在脲酶作用下分解生成氨，用以合成包括核酸、激素、叶绿体、血红素、胺、生物碱等含氮化合物。然而，对于氨基酰化酶-1在植物中的研究极少。施华芳等^[4]从水稻中纯化得到的水稻氨基酰化酶对n-乙酰-l-甲硫氨酸的活性最大，其次为n-乙酰-dl-丝氨酸和n-乙酰-l-丙氨酸。

参考文献

[1]lindner-ha,lunin-vv,alary-a,etal.essentialrolesofzincligationandenzymedimerizationforcatalysisintheaminoacylase-1/m20family[j].journalofbiologicalchemistry,2003,278(45):44496-44504.

[2]fones-ws,lee-m.hydrolysisofn-acylderivativeofalanineandphenylalaninebyacylaseiandcarboxypeptidase[j].journalofbiologicalchemistry,1953,201(2):847-856.

[3]lindner-h,alary-a,wilke-m,etal.probingtheacyl-bindingpocketofaminoacylase-1[j].biochemistry,2008,47(14):66-75.

[4]施华芳,黄伟达,李宏杰.水稻氨基酰化酶的分类、纯化与性质分析[j].生物化学杂志,1997,13(1):54-58.

[5]fougere-f,le-rd,streeter-jg.effectsofsaltstressonaminoacid,organicacid,andcarbohydratecompositionofroots,bacteroids,andcytosolofalfalfa(medicagosatival.)[j].plantphysiology,1991,96(4):1228-1236.

[6]zorb-c,schmitt-s,neeb-a.thebiochemicalreactionofmaize(zeamaysl.)tosaltstressischaracterizedbyamitigationofsymptomsandnotbyaspecificadaptation[j].plantscience,2004,167(1):91-100.

[7]zhi-z,cui-ym,zheng-s,etal.theaminoacidmetabolicandcarbohydratemetabolicpathwayplayimportantrolesduringsalt-stressresponseintomato[j].frontiersinplantscience,2017,8:1231.

[8]khedr-ah,abbas-ma,wahid-aa,etal.prolineinducestheexpressionofsalt-stress-responsiveproteinsandmayimprovetheadaptationofpancratiummaritimuml.tosalt-stress[j].journalofexperimentalbotany,2003,54(392):2553-2562.

[9]abbasi-ar,hajirezaei-m,hofius-d,etal.specificrolesof-andgamma-ocopherolinadminbioticstressresponsesoftransgenictobacco[j].plantphysiology,2007,143(4):1720-1738.

技术实现要素：

本发明第一方面提供了一种氨基酰化酶-1在改善植物性状中的用途，所述改善植物性状选自：提高植物种子发芽率；提高植物植株高度；增加叶面积；增加茎粗；增加根长；增加叶片数；增大根面积；增加荚果重量；和增大植株鲜重中的任意种。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是植物来源的氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是玉米氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1的蛋白选自如seqidno.1所示的蛋白，或与如seqidno.1所示的蛋白具有90％(比如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％)以上序列同源性且具备氨基酰化酶-1酶活性的蛋白。在本发明中，与如seqidno.1所示的蛋白具有同源性的氨基酰化酶-1蛋白，包括但不限于：玉米与其他植物(比如，高粱)中存在的天然的、基因工程改造(比如，融合蛋白)的或人工环境下突变(比如，辐射突变)的，具备氨基酰化酶-1蛋白活性的蛋白。当大片段融合蛋白时，比如，绿色荧光蛋白与氨基酰化酶-1蛋白融合时，同源性可能会接近50％，本发明不限定在90％以上序列同源性。在一些实施方式中，编码所述氨基酰化酶-1的核酸序列如seqidno.2所示。在一些实施方式中，所述改善植物性状为改善烟草性状。在一些实施方式中，所述改善植物性状是通过提高nbexpa1基因和/或nbein2基因的表达量而改善的性状。

本发明第二方面提供了一种改善植物性状的方法，所述方法为向植物中转入可表达的氨基酰化酶-1基因，所述改善植物性状选自：提高植物种子发芽率；提高植物植株高度；增加叶面积；增加茎粗；增加根长；增加叶片数；增大根面积；增加荚果重量；和增大植株鲜重中的任意种。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是植物来源的氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是玉米氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1的蛋白选自如seqidno.1所示的蛋白，或与如seqidno.1所示的蛋白具有90％(比如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％)以上序列同源性且具备氨基酰化酶-1酶活性的蛋白。在一些实施方式中，编码所述氨基酰化酶-1的核酸序列如seqidno.2所示。在一些实施方式中，所述改善植物性状为改善烟草性状。在一些实施方式中，所述改善植物性状是通过提高nbexpa1基因和/或nbein2基因的表达量而改善的性状。

本发明第三方面提供了一种氨基酰化酶-1在提高细菌抗聚乙二醇中的用途。在一些实施方式中，所述细菌抗聚乙二醇是所述细菌在含有1wt％-20wt％(比如2wt％、3wt％、5wt％、8wt％、10wt％、12wt％、15wt％、18wt％)优选5wt％-15wt％的聚乙二醇的液体培养基中生长。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是植物来源的氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是玉米氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1的蛋白选自如seqidno.1所示的蛋白，或与如seqidno.1所示的蛋白具有90％(比如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％)以上序列同源性且具备氨基酰化酶-1酶活性的蛋白。在一些实施方式中，编码所述氨基酰化酶-1的核酸序列如seqidno.2所示。在一些实施方式中，所述细菌为大肠杆菌，优选，大肠杆菌bl21。

本发明第四方面提供了一种提高细菌抗聚乙二醇能力的方法，所述方法为向细菌中转入可表达的氨基酰化酶-1基因。在一些实施方式中，所述细菌抗聚乙二醇是所述细菌在含有1wt％-20wt％(比如2wt％、3wt％、5wt％、8wt％、10wt％、12wt％、15wt％、18wt％)优选5wt％-15wt％的聚乙二醇的液体培养基中生长。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是植物来源的氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是玉米氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1的蛋白选自如seqidno.1所示的蛋白，或与如seqidno.1所示的蛋白具有90％(比如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％)以上序列同源性且具备氨基酰化酶-1酶活性的蛋白。在一些实施方式中，编码所述氨基酰化酶-1的核酸序列如seqidno.2所示。在一些实施方式中，所述细菌为大肠杆菌，优选，大肠杆菌bl21。

本发明第五方面提供了一种重组基因工程载体，所述重组基因工程载体中含有可表达的氨基酰化酶-1基因。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是植物来源的氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1是玉米氨基酰化酶-1。在一些实施方式中，所述氨基酰化酶-1的蛋白选自如seqidno.1所示的蛋白，或与如seqidno.1所示的蛋白具有90％(比如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％)以上序列同源性且具备氨基酰化酶-1酶活性的蛋白。在一些实施方式中，编码所述氨基酰化酶-1的核酸序列如seqidno.2所示。在一些实施方式中，所述重组基因工程载体为重组原核基因表达载体；优选地，所述重组原核基因表达载体的载体为pet28a。在一些实施方式中，所述重组基因工程载体为重组真核基因表达载体；优选地，所述重组真核基因表达载体的载体为pcambia1300。在一些实施方式中，所述重组基因工程载体为重组基因表达穿梭载体。

本发明第六方面提供了一种包含上述重组基因工程载体的宿主。在一些实施方式中，所述宿主为细菌或植物；优选地，所述细菌为大肠杆菌，更优选，大肠杆菌bl21。所述植物优选为烟草。

本发明的氨基酰化酶-1是一种锌结合酶，在动物体内参与了尿素循环以及氨(nh4⁺)清除，并调节细胞对氧化应激的反应，但在植物中鲜有研究。本发明以玉米自交系郑58作为材料，克隆了玉米氨基酰化酶-1基因zmacy-1，并在原核和真核水平对zmacy-1进行了生物学功能分析和研究，结果如下：

1、生物信息学分析表明zmacy-1(loc100283955)属于锌肽酶超家族，m20氨基酰化酶-1亚家族基因，zmacy-1基因所编码的开放阅读框序列长度为1317bp，编码439个氨基酸，编码的蛋白质相对分子量为48.33kd，理论等电点为6.02。

2、构建了原核表达载体pet28a-zmacy-1，转入大肠杆菌bl21中进行耐盐抗聚乙二醇分析。结果表明：与pet28a对照组菌株相比，在5％，10％和15％peg6000胁迫下，重组pet28a-zmacy-1大肠杆菌菌株表现出一定的抗性能力；而在0.4mol/l，0.6mol/l和0.8mol/lnacl胁迫下，随着盐浓度的加大，pet28a-zmacy-1在大肠杆菌菌株的过表达严重抑制了菌株的耐盐性。由此推测，重组大肠杆菌bl21(pet28a-zmacy-1)对nacl胁迫及聚乙二醇胁迫具有不同的耐受模式。

3、构建了植物双元表达载体pcambia1300-zmacy-1，利用农杆菌侵染本生烟烟草，并对转基因烟草进行表型鉴定。结果表明：与野生型相比，zmacy-1在本生烟烟草中的过表达促进了转基因植株的生长发育，包括提高种子萌发速度，增加叶面积、株高、茎粗、地上部分重量、地下部分重量、根长、根面积和成熟植株的荚果大小。并且在一月龄转基因本生烟中，与植株生长相关的基因nbexpa1及nbein2的表达量均显著高于野生型。

4、对烟草t3代转基因株系及野生型进行nacl处理及自然干旱处理，发现盐胁迫处理后，转基因株系的地上部分鲜重和叶绿素含量均显著低于野生型；干旱胁迫处理后，转基因株系地上部分鲜重显著低于野生型，且萎蔫程度更为严重。此外，对胁迫相关生理指标的测定发现，盐胁迫及干旱胁迫下，保护酶pod、sod和cat在转基因株系中的含量均低于野生型，而mda和相对电导率则高于野生型。这些结果表明zmacy-1在本氏烟草中的过表达负调控转基因植株的抗旱耐盐能力。同时也表明，zmacy-1在大肠杆菌和烟草中的过表达具有不同的抗聚乙二醇模式。

所有的结果表明，zmacy-1参与植物的各种生命活动及响应逆境胁迫，虽然促进了植物的生长发育，但却抑制了植物的抗旱耐盐能力。

附图说明

图1为primerstarmaxdnapolymerase扩增zmacy-1基因的凝胶照片。

注：m：takaradl2000dnamarker；泳道1-4：zmacy-1基因扩增结果。

图2为pmd19t-zmacy-1质粒菌落pcr鉴定凝胶照片(a)及双酶切验证凝胶照片(b)。

注：泳道m1、m2：takaradl2000dnamarker；泳道1-7：pmd19t-zmacy-1质粒菌落pcr鉴定；泳道8-11：pmd19t-zmacy-1质粒双酶切验证。

图3为zmacy-1蛋白质保守区预测示意图。

图4为zmacy-1基因进化分析示意图。

图5pet28a-zmacy-1pcr验证凝胶图(a)及双酶切结果凝胶图(b)。

注：m1：takaradl2000dnamarker，m2：takaradl5000dnamarker:；泳道1-4：pet28a-zmacy-1质粒菌落pcr鉴定；泳道5-6：pet28a-zmacy-1质粒双酶切验证。

图6为pet28a-zmacy-1原核表达产物分析凝胶照片。

注：m：蛋白质marker；1和2：分别为pet28a-zmacy-1菌株的诱导上清和沉淀；泳道3和4：分别为pet28a-zmacy-1菌株的未诱导上清和沉淀；泳道5、6分别为空载体菌株的诱导上清和沉淀；泳道7、8分别为空载体菌株的诱导上清和沉淀；目的蛋白如箭头所指。

图7为不同浓度nacl或不同浓度peg6000胁迫下细菌的生长曲线。

注：a-c:重组菌与对照菌分别在(0.4mol/l、0.6mol/l和0.8mol/l)nacl浓度胁迫下生长曲线。

d-f:重组菌与对照菌分别在(5％、10％和15％)peg6000水溶液下生长曲线。

图8为植物表达载pcambia1300-acy-1质粒pcr鉴定(a)和质粒双酶切(b)结果凝胶照片。

注：泳道m1：takaradl2000dnamarker，泳道m2：takaradl15000dnamarker；泳道1-6：筛选的阳性克隆pcr结果；泳道7-9：重组质粒双酶切结果。

图9为本生烟叶片的侵染及筛选过程示意图。

注：a:离体叶片b：愈伤组织；c-d：不定芽；e:幼苗；f：移栽后烟草植株。

图10为筛选苗基因组pcr扩增结果(a)及zmacy-1在t3代转基因本生烟中的相对表达水平(b)。

a：泳道m：takaradl2000dnamarker；泳道1:野生型本生烟；泳道2-7：t0代转zmacy-1筛选苗本生烟pcr结果；b：wt为野生型本生烟草，oe1、oe3、oe5为zmacy-1三个转基因株系t3代。

图11示出了野生型和转zmacy-1基因本生烟幼苗表型鉴定结果。

注：a:烟草在添加ms培养基平板中的发芽率；b-d：在添加ms培养基平板中生长10天的烟草长势；“*”：p<0.05，“**”：p<0.01。

图12示出了一月龄野生型和转zmacy-1基因本生烟植株表型鉴定结果。

注：a：一月龄烟草长势；b-h：一月龄烟草表型鉴定；“*”：p<0.05，“**”：p<0.01。

图13为生长相关基因在转基因和野生型本生烟中的表达量示意图。

注：a：nbexpa1基因相对表达量；b：nbein2基因相对表达量；“*”：p<0.05，“**”：p<0.01。

图14示出了野生型和转zmacy-1基因本生烟荚果表型鉴定结果。

注：a：野生型和转基因株系发育完全的荚果照片；b：野生型和转基因株系荚果果重；“*”：p<0.05，“**”：p<0.01。

图15示出了转zmacy-1基因本生烟的耐盐性分析结果。

注：a:350mmol/lnacl胁迫和清水处理下各烟草株系表型；b：350mmol/lnacl胁迫处理下和清水处理下各烟草株系地上部分鲜重；c:350mmol/lnacl胁迫处理下和清水处理下各烟草株系叶绿素含量；“*”：p<0.05，“**”：p<0.01。

图16为转zmacy-1基因本生烟的抗旱性分析照片。

注：a:自然干旱和清水处理下各烟草株系表型；b：自然干旱和清水处理下各烟草株系地上部分鲜重。

图17为盐胁迫及干旱胁迫下野生型和转基因本生烟烟草胁迫相关生理指标的测定结果示意图。

注：a:pod活性；b:sod活性；c:cat活性；d：mda活性；e：相对电导率；“*”：p<0.05，“**”：p<0.01。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

材料与方法

供试材料：玉米自交系‘郑58’和野生型本生烟烟草(nicotianabenthamiana)种子由青岛农业大学作物育种实验室提供。菌株：大肠杆菌(escherichiacoli)感受态细胞bl21(de3)和dh5α、农杆菌(agrobacteriumrhizogenes)感受态细胞lba4404由博康生物有限公司(青岛)提供。质粒：pmd19-t购自takara，植物表达载体pcambia1300和原核表达载体pet28a由青岛农业大学分子实验室所提供。试剂：异丙醇、无水乙醇、amp、x-gal、iptg、卡那霉素kana、利福平rif、潮霉素hyg、头孢霉素cef、2000dnamarker、15000dnamarker、核酸染料、ms培养基、1/2ms培养基、lb、yeb培养基均为常规试剂。仪器：实时荧光定量pcr仪、恒温培养箱、摇床、冷冻离心机、超净工作台、分光光度计、核酸浓度测定仪(nanodrop2000)均为常规仪器。

引物序列：郑58玉米氨基酰化酶-1基因(zmacy-1基因)的genbank号为：np_001150325.2。其蛋白序列如序列表中seqidno.1所示。其核苷酸编码序列如序列表中seqidno.2所示。根据zmacy-1基因序列等信息，用软件primerpremier5设计引物，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物如下(表1)。

表1引物序列

材料cdna的获取：先根据takara公司的plantrnaextractionkit试剂盒所提供说明进行rna的提取；再利用分光光度计对所提取的rna进行浓度检测，测定rna的纯度与浓度，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测；再进行反转录，体系为：mastermix2.0μl，rna2.0-4.0μl(<500ng)，rnasefreewater补足10μl，pcr反应程序为：37℃反应15min，85℃反应5s，4℃保存。由此得到试验材料的cdna用于荧光定量pcr。

实施例1：玉米zmacy-1基因的克隆

(一)rna的提取：根据takara公司的plantrnaextractionkit试剂盒所提供说明进行郑58玉米叶片组织的总rna(totalrna)的提取。

(二)rna质量检测：利用分光光度计对所提取的rna进行浓度检测，测定rna的纯度与浓度，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(三)cdna模板合成：在冰上配制反转录体系，具体步骤为mastermix2.0μl、totalrna2.0-4.0μl(<500ng)，加rnasefreewater使反应体系达到10μl。按照反应体系加入反应液，充分混匀。在pcr仪中进行反应，反应程序为：37℃反应15min，85℃反应5s，4℃保存。

(四)高保真酶扩增zmacy-1基因：提取叶片中rna，并进行反转录。以步骤(三)中经rna反转录出来的总cdna作为反应模板，利用高保真酶(primerstarmaxdnapolymerase)进行基因扩增，扩增zmacy-1基因，体系(takara)为：takaraprimerstarmaxdnapolymerase25μl，表1所示zmacy-1-f1μl，表1所示zmacy-1-r1μl，cdna2μl，加rnasefreewater至反应体系50μl。pcr反应步骤为：98℃变性10s；58℃退火30s；72℃延伸15s；循环数35；4℃保存。

得到如图1所示的大小约为1320bp的单一条带。结果表明引物特异性较好，所扩增出来的片段清晰且条带大小与目的基因大小一致，可以进行进一步克隆实验。

(五)扩增产物进行回收及加a尾

按照胶回收试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，型号dc301-01)的操作步骤如下：

1.用移液枪吸取100μlpcr产物移至灭菌后的1.5ml离心管中。2.加入等倍体积的buffergdp，颠倒或涡旋混匀。3.将dna吸附柱套在收集管后，把混合液转移至dna吸附柱中，10,000×g离心1min。4.弃掉滤液，将吸附柱重新置于收集管后，加入600μlbuffergw(已加入无水乙醇)至吸附柱中，12,000×g离心1min。5.重复步骤4。6.弃滤液，把吸附柱放回回收集管中，12,000×g离心2min。7.将吸附柱置于经灭菌的1.5ml离心管中，往吸附柱中央加入30μlelutionbuffer，静置2min后，12,000×g离心1min。弃去吸附柱，将纯化后的dna溶液保存于-20℃冰箱中。8.产物加“a”(脱氧腺嘌呤核苷)，以回收后的pcr产物为模板，取14.5μlpcr产物，加入2μltaqbuffer，3μldntps，0.5μltaq酶，在72℃下反应30min。

(六)克隆载体pmd19t-zmacy-1的构建

中间载体pmd19t-zmacy-1的构建步骤如下，扩增产物完成加“a”反应后进行dna纯化回收。

(1)回收后的片段连接到线性pmd19-t载体

在微量离心管中配制连接反应液。pmd19t-zmacy-1体系为：t-vectorpmd191μl；pcr产物1μl；dnaligase5μl；rnasefreewater添加至体系10μl。

将上述反应体系加到ep管中，充分混匀。放入pcr仪中设置温度16℃，反应时间30min。反应结束后，将反应液按照1:10体积比例加入100μl的大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，迅速放入冰上反应40min。再放入42℃水浴加热处理90s后迅速放入冰中反应2min，最后将反应液加入到不含抗生素的lb液体培养基中，放入振荡摇床中37℃震荡培养60min。

(七)克隆载体pmd19t-zmacy-1的筛选

(1)蓝白斑筛选。在超净台中向含amp的lb平板中加入30μlx-gal和3μliptg涂匀，静置1小时，然后将转化的大肠杆菌涂布于平板上，静置30分钟后，37℃倒置过夜培养。

(2)阳性菌筛选。挑选白色单菌落，进行菌液pcr以筛选阳性重组质粒。反应体系为：2×taqplusmastermixii(dyeplus)25μl；zmacy-1-f1μl；zmacy-1-r1μl；strainsolution2μl；rnasefreewater添加至体系50μl。

(八)克隆载体pmd19t-zmacy-1的鉴定

(1)质粒提取

挑取白色单菌落，接种到lb培养基中(含amp)，37℃过夜培养。吸取菌液于离心管中，转速10,000rpm离心1min，收集菌体。按照质粒提取试剂盒步骤提取质粒：1.取2ml过夜培养(12-16h)的重组大肠杆菌菌液，加入2ml的离心管中，10,000×g离心1min，将离心管倒扣于滤纸上以吸尽残液。2.往留有菌体沉淀的离心管中加入250μlbufferp1(使用前先检查是否已加入rnasea)，涡旋振荡混匀。3.向步骤2中加入250μlbufferp2，温和的上下颠倒离心管10次，以充分裂解菌体。4.向步骤3中加入350μlbufferp3，立即温和上下颠倒离心管10次以彻底充分中和bufferp2，13,000×g离心10min。5.将fastpurednaminicolumns吸附柱置于collectiontube2ml收集管中。用移液枪将步骤4中上清液小心转移至吸附柱中，并避免吸到沉淀，13,000×g离心1min。将收集管中的废液弃掉，并把吸附柱重新放入收集管中。6.加入600μlbufferpw2(已用无水乙醇稀释)至吸附柱中，13,000×g离心1min。弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。7.重复步骤6。8.将吸附柱放回收集管中。13,000×g离心1min干燥吸附柱，以彻底清除吸附柱中残留的漂洗液。9.把吸附柱重新置于新的灭菌后的1.5ml离心管中。往吸附柱膜中央加入50μlelutionbuffer。室温静置2min，13,000×g离心1min洗脱质粒。10.弃去吸附柱，质粒保存于-20℃，以防止dna降解。

(2)酶切验证：用限制性核酸内切酶bamhi和hindiii对质粒进行双酶切鉴定，酶切pmd19t-zmacy-1质粒体系为：10×kbuffer5μl；bamhi1μl；hindiii1μl；plasmid15μl；rnasefreewater添加至体系50μl。

pmd19t-zmacy-1质粒菌落pcr鉴定结果如图2a所示，扩增得到大小约为1320bp的单一条带。对菌液pcr正确的转化子提取质粒双酶切验证结果如图2b所示。鉴定出的阳性克隆送青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。测序结果表明pcr产物中与编码序列相关的部分与seqidno.2相同，表明克隆成功。

实施例2：生物信息学分析

用dnaman软件对测序结果进行氨基酸序列比对，用mega5.1软件对该基因进行系统进化树分析。利用bioxm软件对所克隆出的zmacy-1基因进行序列分析，分析表明该基因所编码的开放阅读框的序列长度(不计终止密码子)为1317bp，编码了439个氨基酸。通过protparam(https://web.expasy.org/protparam/)在线软件进行预测分析，结果显示zmacy-1基因所编码的蛋白质分子式为c2173h3367n599o625s14，相对分子量为48.33kd，理论等电点为6.02，正电荷残基(arg+lys)总数为42，负电荷残基(asp+glu)总数为50，不稳定系数为46.03，属于不稳定型蛋白。通过ncbi的保守功能区域分析程序cds(conserveddomains)分析zmacy-1基因所编码的氨基酸序列保守区如图3所示，表明zmacy-1属于锌肽酶超家族，m20氨基酰化酶-1亚家族，具有m20-酰化酶结构域和五个锌结合位点。zmacy-1进化分析参见图4。

实施例3：原核表达载体pet28a-zmacy-1的构建

(一)构建重组细菌

以表1所示xbai-zmacy-1-f和bamhi-zmacy-1-r为引物，用高保真酶对重组质粒pmd19t-zmacy-1进行pcr扩增，从而在质粒两端加上保护碱基。pcr反应体系为：takaraprimerstarmaxdnapolymerase25μl；xbai-zmacy-1-f1μl；bamhi-zmacy-1-r1μl；pmd19t-zmacy-12μl(0.1-10ng)；rnasefreewater添加至体系50μl。

胶回收目的片段，把原核表达载体pet28a与阳性克隆pmd19t-acy-1的扩增片段分别用xbai和bamhi在37℃酶切5h，酶切反应体系为：10×kbuffer5μl；xbai1μl；bamhi1μl；plasmid20μl；rnasefreewater添加至体系50μl。

酶切反应结束后，按照胶回收试剂盒回收产物，再按如下体系连接目的片段和载体片段，放入pcr仪中16℃过夜连接，得到原核表达载体pet28a-zmacy-1。连接体系为：vector3μl；pcrproduct12μl；dnaligase1μl；10×buffer2μl；rnasefreewater添加至体系20μl。

将重组质粒转化原核表达宿主菌bl21(de3)，然后涂布含卡那霉素(浓度为50μg/ml)的lb培养基上过夜培养，进行筛选后，提取质粒进行酶切鉴定，其中，筛选阳性克隆并进行pcr验证结果如图5a所示。pcr验证成功后的菌株进行扩摇并提取质粒，重组质粒双酶切鉴定结果如图5b所示，结果表明pet28a-zmacy-1原核表达载体已经成功构建。阳性质粒送青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，得到了seqidno.2所示相同的编码序列。

(二)原核表达融合蛋白

zmacy-1基因在大肠杆菌bl21(de3)中原核表达

1.把过夜培养的宿主菌bl21(de3)按体积比1:100的比例接种到含有amp抗性的10ml的lb液体培养基中，放入振荡培养箱中37℃转速200rpm震荡培养5个小时，测定od值至od600达到0.8。

2.加入浓度为0.1m的iptg至终浓度0.05mmol/l，实验以不添加诱导剂iptg为对照，放于培养箱中于28℃诱导5h。然后取100μl菌液进行离心后sds-page电泳，以确定重组蛋白是否表达。3.取100μl的bl21(pet28a-acy-1)重组菌加入到10ml的lb液体培养基中，按照以上的方法进行诱导表达，转速10,000rpm离心1min，倒掉上清液，用pbs重悬沉淀，转速10,000rpm离心10min，重复三遍，收集的菌体放到冰中冰浴然后进行超声破碎5min后，重复一遍，待菌液比较清亮时，转速10,000rpm离心20min。4.取20μl的上清液和沉淀悬浮液，分别加入10μl的5×sdsloadingbuffer，放入到100℃沸水中煮沸10min，进行sds-page电泳分析，确定表达产物是可溶性的(存在上清中)还是以包涵体形式存在(沉淀中)。zmacy-1编码的蛋白经iptg诱导后进行离心、重悬及超声破碎离心后进行sds-page检测，结果如图6所示，蛋白大小在48.33kd左右，与protparam所预测的zmacy-1蛋白质分子量相一致，表明pet28a-zmacy-1能在大肠杆菌bl21中表达出蛋白质，因此，可进行下一步的耐盐抗聚乙二醇分析。

实施例4：重组宿主菌bl21(pet28a-zmacy-1)的抗盐和抗聚乙二醇测试

重组宿主菌bl21(pet28a-zmacy-1)的抗盐分析：设置三个含nacl不同浓度的lb液体培养基中(nacl终浓度分别为0.4mol/l、0.6mol/l、0.8mol/l)，分别取1mliptg诱导后的bl21(pet28a-zmacy-1)宿主菌和对照组bl21(pet28a)宿主菌加到培养基里混匀，放于振荡培养箱中37℃振荡培养，每隔l个小时进行测定od600值。每个处理测定3个重复。

重组宿主菌bl21(pet28a-zmacy-1)的抗聚乙二醇分析：设置三个含peg6000不同浓度的lb液体培养基中(peg6000终浓度分别为5％、10％、15％)，分别取1ml诱导后的bl21(pet28a-zmacy-1宿主菌和对照组bl21(pet28a)宿主菌加到培养基里混匀，放于振荡培养箱中37℃振荡培养，每隔l个小时进行测定od600值。每个处理测定3个重复。

观察不同胁迫时间对宿主菌生长的影响。以培养时间为横坐标，平均od600值为纵坐标，绘制生长曲线。结果显示，与转化pet28a的宿主菌相比，转化pet28a-zmacy-1的宿主菌在低浓度盐胁迫(图7a)前期生长良好，但在中浓度盐胁迫(图7b)和高浓度盐胁迫(图7c)下，转化pet28a-zmacy-1的宿主菌生长情况却弱于对照宿主菌，并且0.8mol/l高浓度盐胁迫下，pet28a-zmacy-1宿主菌生长曲线无法随着时间的推移继续增长，高浓度的盐弱化了宿主菌的耐中盐胁迫和耐高盐胁迫能力。然而，在不同浓度的peg6000胁迫(图7d-f)下，pet28a-zmacy-1宿主菌生长情况均优于pet28a宿主菌，这表明zmacy-1在大肠杆菌bl21的过表达使宿主菌具有一定的抗聚乙二醇能力，而且在高peg浓度下比低peg浓度下od差别幅度更大，比如，在5％peg浓度下，转peg基因菌株od值仅有微弱上升，而在15％peg浓度下，转peg基因菌株od值上升约50％，这说明在本发明所用peg浓度范围内，随着peg浓度的上升，zmacy-1基因对大肠杆菌的抗peg能力在增强。

实施例5：zmacy-1转基因烟草

(一)植物表达载体pcambia1300-zmacy-1的构建

pmd19-acy-1为模板，以zmacy-1-xbai-f(序列与表1所示xbai-zmacy-1-f相同)和zmacy-1-bamhi-r(序列与表1所示bamhi-zmacy-1-r相同)为引物，高保真酶进行pcr扩增，从而在质粒两端加上保护碱基，回收目的片段。把pcambia1300表达载体与阳性克隆pmd19t-zmacy-1的扩增片段分别用xbai和bamhi在37℃双酶切3h，酶切体系如下：10×kbuffer5μl；xbai1μl；bamhi1μl；plasmid20μl；rnasefreewater添加至体系50μl。连接体系如下：t-vectorpcambia1300(酶切后)3μl；pcrproduct(酶切后)12μl；dnaligase1μl；10×buffer2μl；rnasefreewater添加至体系20μl。

将重组质粒转化大肠杆菌dh5α，含卡那霉素(浓度为50μg/ml)lb培养基37℃过夜培养，提取质粒进行酶切鉴定，pcr鉴定和酶切图谱如图8所示，由此可见，成功构建植物表达载体pcambia1300-zmacy-1。阳性质粒送青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，验证了载体构建的正确性。

(二)zmacy-1基因遗传转化本生烟

转化lba4404感受态细胞

1.将农杆菌lba4404感受态细胞从-80℃超低温冰箱中取出，待感受态菌液稍融化后插入冰中冰浴10min。2.在超净工作台中，向感受态细胞加入1μl表达载体质粒pcambia1300-zmacy-1，轻轻吹打混匀，冰浴5min，转入液氮中5min，转移至37℃水浴锅中水浴5min，再将其冰浴2min。3.向冰浴后的农杆菌感受态中加入600μllb液体培养基中，放入振荡培养箱中，条件设置：28℃，转速200rpm，振荡培养2-3h。4.转速10,000rpm离心3min，弃上清，用100μlyeb(或lb)液体培养基重悬沉淀菌体。5.将重悬后的菌液涂于含有50mg/l卡那霉素和20mg/l利福平的yeb固体培养基上，倒放入培养箱中，28℃培养36-48h。6.挑取培养36-48h后的农杆菌单菌落接种于装有yeb(或lb)液体培养基(50mg/lkan+20mg/lrif)的离心管中进行过夜培养(>16h)，菌液浑浊后进行pcr验证。将菌液与灭菌后50％甘油按1:1比例进行保菌，存于-80℃冰箱中。

(三)遗传转化本生烟(叶圆盘法)

1.取出-80℃超低温冰箱中保存的含有表达载体pcambia1300-zmacy-1的农杆菌lba4404菌株200μl接种于10mlyeb液体培养基(50mg/lkan+20mg/lrif)中进行过夜(>16h)震荡培养，活化菌株。2.将活化后的菌液，按1:50体积比于yeb液体培养基(50mg/lkan)中继续震荡培养，过夜培养后，进行离心收样(7,000rpm离心3min)。3.在超净工作台中，用5％蔗糖的1/2培养基(不含琼脂)对菌液进行重悬(od600值：0.6-0.8)，将预培养两天后的本生烟叶片置于重悬液中浸泡5-10min，浸泡完毕后于滤纸上晾干，然后将叶片移至覆有两层滤纸的共培养培养基(ms+3mg/l6ba+0.2mg/lnaa+150μmol/l乙酰丁香酮，ph＝5.8)中暗处共培养3天。4.将共培养3天后的烟草叶片移至添加潮霉素及头孢霉素的诱导愈伤培养基(ms+3mg/l6ba+0.2mg/lnaa+25mg/lhyg+250mg/lcef，ph＝5.8)中进行筛选培养(25℃，光照16h)，每周更换一次培养基。5.待愈伤组织长出不定芽后，在超净工作台中将嫩芽切下，移至生芽培养基(ms+20mg/lhyg+200mg/lcef，ph＝5.8)中进行筛选，待嫩芽形成3-5cm幼苗时，将植株切下，移至(1/2ms+15mg/lhyg+150mg/lcef，ph＝5.6)生根筛选培养基中进行培养。6.待筛选苗长出根后，将组培瓶盖子打开，换上封口膜，并将封口膜用手术刀切开若干裂口，进行练苗。两天后，用镊子轻轻移出组培苗，并用清水对其根部进行冲洗，直至将根部培养基冲洗干净后，移栽至灭菌后的土壤中。7.移栽后的本生烟，浇透水，并放入光照培养中25℃恒温培养，前三天需覆膜保湿。三天后，正常培养。

(四)本生烟的种植

(1)种子消毒及无菌播种

先将种子放在干净的器皿上，去掉杂质，然后再将种子移至ep管，用无菌水将种子清洗一遍，其次再用75％酒精浸泡30-60s。然后用2％naclo清洗本生烟种子10min。最后再用无菌水清洗3-5遍。将消毒处理后的种子，利用无菌的1ml枪头点到ms培养基上。

(2)本生烟移栽

首先移栽前，先将营养土120℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植本生烟的花盆中。用镊子将长势健壮的本生烟移到营养土中，每盆移栽1棵。将移栽完成的本生烟放入光照培养箱中，25℃恒温培养。

本生烟烟草叶片的侵染及筛选过程概述如图9所示。将侵染完的叶片于加有潮霉素的诱导愈伤筛选培养基(图9a)中进行筛选，得到了愈伤组织(图9b)，将愈伤组织换至加有潮霉素的生芽筛选培养基中筛选并得到了幼芽(图9c),将幼芽切下于生根筛选培养基中继续筛选培养(图9d)，芽长成成形的植株且生出幼根(图9e)表明筛选完成，便可进行练苗，并移至土中(图9f)。

(五)本生烟烟草的鉴定

dna的提取

将经潮霉素筛选后的阳性本生烟苗，移栽到营养土中生长两周后，剪取烟草叶片进行dna的提取。步骤如下：1.将0.5g烟草叶片放入液氮预冷的研钵中，充分研磨并不断加入液氮，迅速移入2mlep管中。2.往ep管加入700μl的ctab(65℃水浴预热)提取缓冲液，充分混匀，加入20μlβ-巯基乙醇。3.65℃水浴40min每20min轻轻摇匀。4.冷却至室温后，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(1:1:1)溶液，充分混匀，冰浴5min，12,000rpm，离心15min。5.将上清液取出，重复步骤4。6.吸取上清于新的ep管，加入等体积异丙醇，混匀，放入-20℃冰箱中静置1h，12,000rpm，离心8min。7.弃上清液，用4℃预冷后的70％无水乙醇将沉淀洗涤3遍，12,000rpm，离心2min。8.放置室温下干燥数分钟后，加入50μl的去离子水，离心后于-20℃下保存备用。

pcr扩增检测：以前面步骤提取的dna为模板，对zmacy-1基因进行扩增，realtimepcr反应体系为：tbgreenpremixextaqii12.5μl；qrt-zmacy-1-f0.5μl；qrt-zmacy-1-r0.5μl，反转录后的cdna2.0μl；rnasefreewater至25μl。realtimepcr反应步骤为：94℃预变性5min；94℃变性30s；55-60℃退火30s；72℃延伸30s；循环40次。

实时荧光定量pcr：以野生型本生烟为对照，使用tbgreenpremixextaqii(tlirnasehplus)试剂盒(takara公司)来进行荧光定量pcr检测zmacy-1在本生烟中的表达情况。实验以本生烟的内源基因nbef1a作为内参基因(以表1所示nbef1a-f和nbef1a-r为引物)，测定zmacy-1在转录水平上的相对表达量(以qrt-zmacy-1-f和qrt-zmacy-1-r为引物)。实时荧光定量pcr反应体系同上。

提取经潮霉素筛选得到的筛选苗叶片dna，进行t0阳性转化株系的分子检测。结果如图10a所示，共获得六株t0代zmacy-1阳性苗，均为成功转化的阳性苗，挑选出3个转zmacy-1株系分别命名为oe1、oe3和oe5作为后续实验材料。提取t3代转zmacy-1纯化苗及野生型本生烟叶片rna进行实时荧光定量，以检测zmacy-1在各株系中的相对表达量，方法同上，结果如图10b所示。由此可知，zmacy-1在野生型本生烟中几乎不表达，而在oe1、oe3和oe5株中高表达，这说明oe1、oe3和oe5株中相对野生型本生烟改变的表型(性状)是由zmacy-1基因直接或间接引起的。

(六)转zmacy-1烟草表型的鉴定

1、转zmacy-1烟草种子和野生型烟草种子发芽率的测定及比较

在超净工作台中无菌播种转基因株系oe1、oe3、oe5及野生型烟草种子于含ms培养基的培养皿中之中，每个平板点一百粒种子，从第三天开始进行发芽率(统计数据参见图11a)测定及比较。为比较转基因株系和野生型株系的长势(参见图11-b-d)，将各株系种子无菌播种于同一平板中，每个株系播种25粒种子。由此可知，zmacy-1基因能够提高烟草种子的发芽率，促进烟草的生长。

2、转zmacy-1烟草植株和野生型烟草植株表型的鉴定

对t3代转基因株系oe1、oe3、oe5和野生型烟草幼苗在ms培养基中培养15天后，移栽至土中，15天后测量一月龄烟草植株株高(结果参见图12c)、叶面积(结果参见图12b)、茎粗(结果参见图12d)、根长(结果参见图12f)、叶片数(结果参见图12a)、根面积(结果参见图12g)、地上部分鲜重量(结果参见图12e)以及地下部分鲜重量(结果参见图12h)。

3、提取转基因株系oe1、oe3、oe5和野生型烟草本生烟同一部位叶片rna进行实时荧光定量pcr，pcr方法同实施例5第(五)节，采用表1所示nbexpa1-f、nbexpa1-r为引物对nbexpa1基因进行扩增。采用表1所示nbein2-f、nbein2-r为引物对nbein2基因进行扩增。测量nbexpa1(genbank号为：nm_001325646.1)、nbein2(genbank号为：xm_016579720.1)两个基因的相对表达量。结果参见图13。

nbexpa1属于膨胀素蛋白家族，对于促进叶片的生长起到了极为重要的作用。nbein2是乙烯信号通路中的一个必需的正调节因子。从图13中可见，nbexpa1、nbein2在转基因本生烟中的表达量显著高于野生型。说明zmacy-1基因在本生烟中的过表达通过正调控植物生长相关基因nbexpa1以及nbein2的表达从而引起植株生长速度加快。由此可见，zmacy-1不仅响应植物激素的调控，从而促进了植物的生长发育进程，并在提高植物的生物量和产量方面起到了重要的作用。

5、挑取成熟期烟草中部发育完全荚果进行称重及果长果宽测量(结果参见图14)。

如图11、图12和图14所示，zmacy-1在本生烟烟草的过表达显著促进了植株生长发育，转基因植株的发芽率、株高、根长、茎粗、叶面积(第五片功能叶)、根面积、地上部分鲜重、地下部分鲜重、荚果(成熟植株)均显著大于野生型植株。zmacy-1在能够促进本生烟烟草生长。

(七)转zmacy-1烟草对盐胁迫以及peg胁迫响应的研究

盐胁迫和peg胁迫对转zmacy-1本生烟生理生化的影响

1、对一月龄本氏烟幼苗浇灌350mmol/lnacl进行盐胁迫，peg胁迫为20％peg6000水溶液处理。

转zmacy-1本生烟对盐胁迫的响应

对于对t3代一月龄本生烟进行350mmol/l的nacl溶液处理的结果表明，处理10天后，野生型和转zmacy-1各株系均逐渐失绿发黄，但转zmacy-1本氏烟的失绿发黄情况更为明显，显著高于野生型(图15a)。此外，以清水浇灌作为对照，测量盐胁迫处理10天后各株系本生烟烟草的地上部分鲜重(图15b)和叶绿素含量(图15c)，结果发现，清水浇灌10天后的转基因株系地上部分鲜重及叶绿素含量均明显高于野生型，而盐胁迫10天后，各株系的地上部分鲜重及叶绿素含量均下降，且转基因株系地上部分鲜重及叶绿素含量显著低于野生型。这说明zmacy-1在本生烟中的过表达弱化了植株的耐盐性。

转zmacy-1本生烟对干旱胁迫的响应。

本研究对t3代一月龄本生烟进行干旱处理，并以清水浇灌作为对照。结果发现，干旱处理7天后，与野生型本生烟烟草相比，转基因株系的萎蔫程度更为严重，且复水两天后，野生型本生烟烟草恢复程度也明显高于zmacy-1转基因株系(图16a)。此外，本研究还测定各株系本生烟烟草在未处理和干旱处理情况下的地上部分鲜重，结果发现，干旱胁迫均明显导致野生型和转基因株系的地上部分鲜重下降，并且，未处理情况下，转基因株系的地上部分鲜重显著高于野生型，然而，干旱胁迫处理下，转基因株系的地上部分鲜重却鲜重低于野生型(图16b)。以上结果表明，与在大肠杆菌bl21的表现不同，zmacy-1在本生烟烟草中的过表达弱化了植株的抗旱能力。

(1)丙二醛(mda)含量测定

剪取0.2g本生烟叶片，加3ml的5％三氯乙酸(tca)，研磨成浆，5,000rmp离心10min，取上清液加入试管，加入等体积的0.5％硫代巴比妥酸(tba)，混匀后放入沸水浴，30min后取出冷却后测定其在450nm、532nm和600nm处的吸光度^[5]。

mda含量(nmol/l)＝6.45×(a532-a600)-0.56×a450

结果参见图17d，从中可见，盐胁迫和干旱胁迫后转zmacy-1本生烟相比野生本生烟过氧化物酶活性更强。

(2)相对电导率的测定

剪取0.2g左右的本生烟叶片，移至试管中，加入20ml的去离子水，直至浸没叶片，室温静置4h，充分摇匀后，用电导仪测得叶片电导率为r1，沸水浴煮沸25min，冷却后摇匀，再次测电导率r2^[6]。

相对电导率＝r1/r2×100％

结果参见图17e，从中可见，盐胁迫和干旱胁迫后转zmacy-1本生烟相比野生本生烟过相对电导率更强。

(3)保护酶活性的测定

粗酶液提取：剪取0.2g本生烟叶片放入研钵中，加2ml预冷的0.1mol/ltris-hcl缓冲液，研磨后吸取到2ml离心管中，再用1ml缓冲液将研钵中剩余的物质冲洗，吸取到离心管中。4℃下8,000rpm离心30min，取上清即为粗酶液分装后保存于-20℃冰箱。

①超氧化物歧化酶(sod)活性测定

sod活性的测定采用氮蓝四唑(nbt)法，将处理好的粗酶液样品，用酶标仪测定样品在560nm处波长的吸光值^[7]。sod活性(u/mg蛋白)＝(a0-a)×vt×(0.5a0×w×v1)；其中，a0：560nm下对照管的吸光值；a：560nm下样品管的吸光值；vt：酶提取液总体积(ml)；v1：测定时加入的酶液体积(ml)；w：样品鲜重(g)。

结果参见图20b，从中可见，盐胁迫和干旱胁迫后转zmacy-1本生烟相比野生本生烟过氧化物酶活性更强。

②过氧化物酶(pod)活性测定

pod活性的测定采用愈创木酚显色法测定，将粗酶液样品，用酶标仪测定470nm处的吸光值，每隔1min测一次(5次)。以每分钟变化0.01为1个酶活单位^[8]。

pod活性＝10⁵×△a470/c·vs·t；△a470：反应时间(t)内的光吸收值变化；c：酶液蛋白质的浓度(μg/μl)；vs：测定时取用酶液的体积(ml)；t：反应时间(min)。

结果参见图17a，从中可见，盐胁迫和干旱胁迫后转zmacy-1本生烟相比野生本生烟过氧化物酶活性更强。

③过氧化氢酶(cat)活性测定

采用愈创木酚显色法测定，将粗酶液样品，用分光光度计测定470nm处的吸光值，每隔1min测一次(5次)。以每分钟变化0.01为1个酶活单位。

3.过氧化氢酶(cat)

吸取22.5μl酶提取液，加入1.5ml100mm的pbs和3.75ul30％的h2o2，混匀去气泡。在240nm下每隔10sec记录一次吸光值，最终以吸光度变化值来表示酶活力的大小。结果参见图17c，从中可见，盐胁迫和干旱胁迫后转zmacy-1本生烟相比野生本生烟过氧化氢酶活性更强。

综上可知，在盐胁迫和干旱胁迫逆境条件下，超氧化物歧化酶(sod)可将细胞内的有害物质转化生成h2o2和o2，而cat和pod将清除这些产物，因此这三种抗氧化酶在协同作用下减轻了逆境胁迫对植株的伤害。mda是脂质过氧化的最终分解产物，mda的水平反应了植物损伤的程度。为了更进一步验证zmacy-1在本生烟烟草中的过表达弱化了植株的抗旱耐盐能力，本研究测定了清水(ck)、20％peg600和350mmol/lnacl处理两天后，各株系叶片中保护酶pod、sod、cat的含量以及mda含量和相对电导率。结果发现，干旱胁迫及盐胁迫均使转基因株系和野生型本生烟烟草的保护酶pod、sod和cat活性上升以及mda含量和相对电导率的上升(图17a-e)。其中，盐胁迫和干旱胁迫下，转基因株系的保护酶pod、sod和cat的活性低于野生型，但其mda含量及相对电导率高于野生型。

数据釆用2^-△△ct相对定量分析方法^[9]计算。采用microsoftexcel2007整理数据，作图分析。

可见，盐胁迫和干旱胁迫后转zmacy-1本生烟受到的损伤更严重。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>氨基酰化酶-1的用途

<130>c1cncn191049

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>439

<212>prt

<213>玉米(zeamays)

<400>1

metproproproleuargcysleuleuleualaphevalvalvalleu

151015

serglypheproargleualahisprophethralaleugluserasp

202530

glnilealaargpheglnglutyrleuargileargthralahispro

354045

serproasptyralaglyalaseralapheleuleuhistyralaala

505560

serleuglyleuhisthrthrthrleuhisphethrprocyslysthr

65707580

lysproleuleuleuleuthrtrpargglyseraspproserleupro

859095

servalleuleuasnserhismetaspservalproalagluproglu

100105110

histrpalahisproprophealaalahisargaspprothrthrgly

115120125

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130135140

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145150155160

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180185190

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195200205

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210215220

alaglyalaproglyhisglyserargmetleuaspglyalaalaval

225230235240

aspasnleumetaspcysvalgluthrilealaalapheargaspala

245250255

glnpheargmetvallysserglyglulysglyproglygluvalval

260265270

servalasnprovaltyrmetlysalaglyileproserprothrgly

275280285

phevalmetasnmetglnproserglualagluvalglypheaspleu

290295300

argleuproprothrgluaspilegluglnilelysargargvalglu

305310315320

gluglutrpalaproserhislysasnleuthrtyrgluleuvalgln

325330335

lysglyproalathraspvalserglyargprovalserthralathr

340345350

asnalaserasnprotrptrpleuthrphegluargalailealaser

355360365

alaglyglygluleuserlysprogluileleuserserthrthrasp

370375380

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