一种调控油菜脂肪酸的OPR基因及其表达载体和应用的制作方法

本发明属于作物遗传育种领域，特别是指一种调控油菜脂肪酸的opr基因及其表达载体和应用。

背景技术：

脂肪酸(fattyacid)是维持人体健康的重要物质，可分饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸，这两者的成分比对脂肪酸的成分有很大的影响。动植物的油脂中，动物油脂的饱和脂肪酸含量偏高，而植物油脂中不饱和脂肪酸含量高。饱和脂肪酸主要包括棕榈酸(palmiticacid)和硬脂酸(stearicacid)，饱和脂肪酸摄入过高容易导致血胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇升高，引发动脉官腔狭窄，增加患冠心病的风险。不饱和脂肪酸主要包括油酸(oleicacid)、亚油酸(linoleicacid)和亚麻酸（α-linolenicacid），是动物体内多种代谢调节的关键因子，是人体发育过程中重要的营养物质，对某些疾病具有预防和治疗作用。油酸是一种单不饱和脂肪酸，是人体必需脂肪酸，以甘油酯的形式存在于一切动植物油脂中。油酸主要集中在甘油三酯上的sn-2位，是一种具有极高营养价值的植物油，油酸能够更有效地降低镉在小鼠肝、肾组织中的蓄积，缓解小鼠急性镉中毒，能降低大白鼠血清中的tc、tg含量(p<0.01)，有很好的营养保健功能。亚油酸是人和动物营养中必需的脂肪酸，具有降低血脂、软化血管、降低血压、促进微循环的作用，可预防或减少心血管病的发病率，特别是对高血压、高血脂、心绞痛、冠心病、动脉粥样硬化、老年性肥胖症等的防治极为有利，能起到防止人体血清胆固醇在血管壁的沉积，有“血管清道夫”的美誉，具有防治动脉粥样硬化及心血管疾病的保健效果。亚麻酸属ω-3系列多烯脂肪酸，为全顺式9、12、15十八碳三烯酸，以甘油酯的形式存在于深绿色植物中，是构成人体组织细胞的主要成分，在体内不能合成、代谢，转化为机体必需的生命活性因子二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid，dha）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoicacid，epa）。然而，它在人体内不能合成，必须从体外摄取。人体一旦缺乏，即会引导起机体脂质代谢紊乱，导致免疫力降低、健忘、疲劳、视力减退、动脉粥样硬化等症状的发生。尤其是婴幼儿、青少年如果缺乏亚麻酸，就会严重影响其智力正常发育，已被国内外科学家所证实，并被世界营养学界所公认。因各种脂肪酸占比的和为1，菜油中的饱和脂肪酸严重抑制了不饱和脂肪酸的比例，故可通过降低饱和脂肪酸的方法以提高不饱和脂肪酸的含量。

1，2-氧-植物二烯酸还原酶(1，2-oxo-phytodienoicacidreductase，opr)是茉莉酸生物合成即十八烷碳烯酸代谢途径中的一个关键酶，控制茉莉酸合成的最后步骤，opr参与脂肪酸β氧化，还原α-亚麻酸，在脂肪酸代谢中起作用，且由其形成的茉莉酸可广泛介导胁迫信号的传递等，在植物抗逆性中起着重要作用。

技术实现要素：

本发明提出一种调控油菜脂肪酸的opr基因及其表达载体和应用，本发明利用过表达技术，促使油菜内源opr基因的表达，引起脂肪酸成分变化，饱和脂肪酸占比下降，不饱和脂肪酸占比上升，促进食用菜籽油品质改良。具体的说就是将opr基因过表达，通过过表达创造出不饱和脂肪酸占比更高的油菜新品种。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种调控油菜脂肪酸的opr基因，所述opr基因的碱基序列如seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示。

含有所述的opr基因的表达载体，所述表达载体包括过表达载体和rnai载体。

上述的表达载体的构建方法，步骤如下：根据opr基因的a、c基因组序列设计opr基因引物，并扩增。通过pcr扩增得扩增产物。将产物经酶切回收后与pmd18-t载体相连。经筛选鉴定得携带有目的基因的表达载体。将带有opr基因的表达载体导入油菜后即可调控脂肪酸的含量。上述的表达载体作为培育高含量不饱和脂肪酸油菜新品种的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明的目的在于提供一种调控油菜脂肪酸比例的基因opr，该基因具有如seqidno：1所示的dna片段。该基因随着油菜生育期变化积累量增加，导致油菜不饱和脂肪酸积累量增加，因此该基因的过表达有助于理解油菜脂肪酸积累的分子机制。通过对opr基因在甘蓝型高油酸油菜中表达规律进行研究，结合相关材料的脂肪酸组成进行关联分析，并进一步对其克隆，目的是研究其在高油酸油菜脂肪酸代谢中的作用，促进我国菜油品质改良升级。

2、本发明利用过表达技术，促使油菜内源opr基因的表达，引起脂肪酸成分变化，饱和脂肪酸占比下降，不饱和脂肪酸占比上升，促进食用菜籽油品质改良。具体的说就是将opr基因过表达，通过过表达创造出不饱和脂肪酸占比更高的油菜新品种。

3、本发明通过促进opr基因不同mirna以调控期基因表达量，用气相色谱分析最终脂肪酸成分，研究了油菜opr基因调控脂肪酸成分的分子机制和分子生物学功能，并为培育高油酸或其他优质油菜提供了一个潜在的新基因资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为cleanreads的长度分布。

图2为样品聚类分析结果。

图3为go富集分析top10(筛选三种分类中基因数目前排10位的的go条目)。

图4为21个差异mirna的qrt-pcr结果（低油酸油菜基因表达量为对照）。

图5为mir156＞c＞g及其靶基因在高油酸油菜近等基因系不同材料表达情况。

图6为opr基因在20个高油酸油菜材料中表达情况。

图7为油菜目的基因rnai片段pcr电泳图。

图8为124与829过表达载体。

图9为opr各拷贝在拟南芥中过表达及rnai导致的脂肪酸成分变化。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一、mirna测序及脂肪酸代谢相关功能基因筛选

以高油酸油菜近等基因系（油酸含量分别为81.4%、56.2%），由湖南农业大学国家油料改良中心提供。取自交授粉后20-35d种子混合，置于灭菌研钵，迅速研成细末，整个操作置于液氮环境中，其余步骤参见总rna提取试剂盒提取说明书。

经srna文库构建与测序、mirna数据分析、差异mirna鉴定及靶基因预测、qrt-pcr对差异表达的mirna及其靶基因的验证、脂肪酸代谢相关差异mirna及其靶基因的表达规律分析五个步骤。

将cleanreads的长度进行统计发现，样本中的长度分布峰值在21-25bp，符合mirna特征（图1），表明srna测序结果质量高、可靠。利用聚类分析方法，通过计算高低油酸油菜之间的差mirna距离，研究了样品之间的相似性，在一个簇中分别发现了三个高油酸或低油酸样品，表明这些小rna可能具有相似的生物学功能（图2）。以p<0.05和log2（试验/对照）绝对值大于1.5来鉴别差异表达的小rna后，检测到21个差异表达的小rna（占总量的8.39%）。其中9个基因（42.86%）上调，12个基因（57.14%）下调。

利用targetfinder软件预测mirna靶基因，并进行go注释与kegg功能富集，发现有359个靶基因在20个代谢通路中富集表达，具体注释。其中go注释分析发现，133个假定的靶基因与21个差异表达的mirna相关。其中，分布在“生物过程”（46.62%）的62个、“细胞成分”（24.06%）的32个和“分子功能”（29.32%）39个（图3）。

在“生物过程”下，大多数靶基因与“转录”（9.68%）和“转录调控”（4.84%）有关。在“细胞成分”类别中，“细胞核”（28.13%）和“胞质溶胶”（9.38%）与“胞质”相同。在“分子功能”类基因中，大多数潜在功能与“转录因子活性”（10.26%）、“dna结合”和“催化活性”（5.13%）有关。这些靶基因的分布表明菜籽的代谢非常活跃。

对差异mirna进行qrt-pcr验证（图4）发现，除了nc_027772.1_2143，bna-mir156a，bna-mir156b>c>g，bna-mir160a>b>c>d和bna-mir166f外，其余基因的相对表达水平与测序分析得到的结果相同。其中，nc_027760.1_5272、nc_027760.1_5272*、nw_013650328.1_26640*、bna-mir156b>c>g、bna-mir166f、bna-mir167a>b、bna-mir169m、bna-mir396a、bna-mir824的qrt-pcr结果与对照在p<0.01水平上有极显著差异（分别是对照的0.77、0.72、0.50、0.74、1.56、0.59、0.54、0.20、1.90倍）；nc_027761.1_6665、nc_027772.1_21433、bna-mir156a、bna-mir160a>b>c>d的qrt-pcr结果与对照在p<0.05水平上有显著差异（分别是对照的0.87、0.81、0.81、0.83倍），其余与对照无显著差异。但是只有bna-mir167a>b、bna-mir396a、bna-mir824的qrt-pcr结果比测序结果差异更明显。另外，13个有显著及以上的mirna中，有9个具有靶基因，分别是nc_027760.1_5272、nw_013650328.1_26640*、bna-mir156b>c>g、bna-mir166f、bna-mir169m、bna-mir396a、bna-mir824、bna-mir156a和bna-mir160a>b>c>d，这可能是与油菜高油酸相关的新的mirna。

这些结果表明，mirna测序分析能够成功地发现新的候选mirna，且具有较高的准确性和效率。对上述验证差异显著的mirna进行筛选，选出与脂肪酸代谢相关的差异bna-mir156b>c>g。在高油酸油菜近等基因系不同的发育阶段取不同材料进行qrt-pcr分析（图5），验证bna-mir156b>c>g与其靶基因的间的表达关系。bna-mir156b>c>g在整个生长阶段表达下调，且随生长阶段而降低，其靶基因opr与之相反，随着生育期推进，表达量不断上升。

二、脂肪酸代谢相关功能基因筛选

以高油酸油菜近等基因系为材料，由湖南农业大学国家油料改良中心提供。以大肠杆菌感受态dh5α为菌株，购自于北京擎科生物公司。pcambia1300-35s-n1为载体。使用试剂盒包括1：植物总rna提取试剂盒transzolup、transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix购自北京全式金生物技术有限公司、pfu高保真酶、dnamarker购自天根公司，限制性内切酶、dntp、t4dnaligationkit购自北京擎科生物公司。使用仪器包括：pcr仪（ptc200）、琼脂糖凝胶成像系统（syngene）、高压灭菌锅（tomysx-500）、恒温水浴锅（amershambioscience）、细菌培养箱（eyelalti-700）、无菌超净工作台（thermoelectroindustries，s1-1203）、摇床（sciencificindustries，s1-1203）、geldoc2000凝胶成像仪等。按照transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书进行操作。

对通过验证的opr基因，利用tair和brassicadatabase数据库进行检索，发现opr基因有4个拷贝，a、c基因组各两个，并以此序列进行后续引物设计。

对opr基因在20个不同油菜品系材料营养生长期中表达量进行分析（图6a）发现除6和8之外，两基因表达量在幼苗期叶、5-6叶期叶、蕾薹期叶呈逐渐递增的趋势。且相关性分析表明（表1），在整个营养生长期，高油酸材料的opr基因表达量与5种脂肪酸成分均无显著相关性。

表1营养生长期opr基因表达量与不同脂肪酸成分间相关性分析

对opr基因在20个不同油菜品系材料花期花中的表达量进行分析（图6b），在盛开的花中表达量最高，在将凋零的花中表达量最低；另外，相关性分析表明（表2），opr在花蕾和盛开的花中表达量与油酸、亚油酸及亚麻酸有极显著相关关系，在将凋谢的花中表达量与5种脂肪酸成分均无显著相关性。

表2opr基因在花期不同材料相关性分析

对opr基因在20个不同油菜品系材料角果期的表达量进行分析（图6c），该基因在整个角果期呈逐渐递减的趋势，但角果期的整体表达量高于其他时期。相关性分析表明（表3），opr基因与棕榈酸、油酸、亚油酸及亚麻酸在整个角果期均有极显著/显著相关性。角果期是脂肪酸积累的关键期，而江南等发现，油茶果实中opr基因参与亚麻酸代谢，且在油茶种子成熟过程不同时期都有表达，但不同时期均表达丰度较低；推测opr基因参与了油菜籽脂肪酸积累过程。

表3opr基因在角果期不同材料相关性分析

对20个油菜材料中opr与乙酰转移酶基因表达情况进行分析发现，opr3与基因在苗期表达量逐渐升高直至花期盛开的花，角果期逐渐下降，opr基因表达量比内参基因低的多；通过综合基因表达情况结合脂肪酸成分分析得知，opr在35d种子中与油酸呈显著负相关关系、与亚油酸和亚麻酸呈显著正相关关系，可能为控制油酸合成的微效基因。

三、opr基因克隆及载体构建

通过靶基因扩增后，对pcr扩增产物凝胶电泳，拍照观察，并切胶回收。与pmd18-t载体相连，送擎科生物测序。高保真扩增了bna-mir156b>c>g的4个靶基因，其长度分别为1122bp（949），1119bp（124），1119bp（829），1125bp（135），bna-mir396的2个靶基因114和148均为1350bp，目的条带符合预期。以合成的cdna为模板，分别对6个靶基因特异片段进行pcr高保真扩增，均得到了目的片段长度大小的dna片段。opr基因的124与829拷贝见图7，949与135拷贝见图7。opr基因的四个拷贝124、829、949与135rnai重组质粒见图8。载体构建包括过表达重组质粒图谱（左）和rnai重组质粒图谱（右）两步（图8）。具体步骤如下：

（1）体外重组

双酶切pmd18-t载体，胶回收，产物进行体外同源重组反应，获得重组质粒。

（2）转化

连接产物加入感受态细胞（50-100μl）混匀，冰浴30min；42℃恒温热激90s，热激结束立即置于冰浴中2-3min；加500μl无抗生素的lb液体培养基，37℃，220rpm振荡培养45-60min；6000rpm离心1min，弃去上清，留悬浮菌液约100μl，均匀涂布到含卡那霉素（50mg/l）的lb固体琼脂培养基，37℃倒置培养12-16h。

（3）摇菌提取质粒并测序

挑取阳性菌落再培养，菌液送擎科生物公司测序，测序结果通过snapgene与dnaman比对，核对碱基判读结果，减少测序仪误差。

酶切重组质粒及rnai片段：

表4正向酶切体系

表5正向连接体系

连接体系在22℃反应1h，反应完成后连接产物置于冰上进入转化步骤。

四、opr基因过表达及rnai结果分析

由图9可知，不同拷贝调控后，效果略有差异，整体变化为油酸和亚油酸占比增加，硬脂酸占比下降，该结果说明，opr基因的过表达及rnai可用于调控脂肪酸的占比，为优质油菜培育提供方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<120>一种调控油菜脂肪酸的opr基因及其表达载体和应用

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