猪Delta冠状病毒病毒样颗粒及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种猪delta冠状病毒病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

对2010年以来我国爆发了以哺乳仔猪的高死亡率为特征的猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)，疫情波及十几个省份，致使100万仔猪死亡。同样，ped在美国等地也频频流行发生，严重影响世界养猪业的发展。对于ped致病原的研究发现，新发猪delta冠状病毒(porcinedeltacoronavirus，pdcov)和猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)是引发该病的重要病原，且两种病毒存在共感染现象。

电子显微镜下观察，pdcov呈球形或椭圆形，囊膜外有冠状棘突，病毒颗粒大小为150-180nm。pdcov基因组是单股正链rna。根据目前已经测定的pdcov全基因组序列，病毒基因组大小约为25.4kb，g+c百分含量约为43％，是已知含有最小基因组序列的冠状病毒。pdcov基因组主要包括两端的非编码区(untranslatedregion，utr)，即5’-utr和3’-utr以及多个开放阅读框(openreadingflame，orf)。pdcov基因组大部分序列编码两个重叠的orf1a和orf1b，分别编码多聚蛋白pp1a和pp1ab。pdcov基因组剩余序列主要编码病毒结构蛋白，依次包括表面纤突蛋白(spike，s)、小包膜蛋白(smallmembrane，e)、膜蛋白(membrane，m)和核衣壳蛋白(nucleocapsid，n)。目前，对于新发现的猪delta冠状病毒的疫苗研制尚无报道。

病毒样颗粒(virus-likeparticle，vlp)疫苗可诱导体液免疫和细胞免疫应答，通过鼻腔内接种或口服免疫可极大提升局部粘膜的免疫保护效果。vlp又称伪病毒或假病毒，是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白通过自组装形成的空心颗粒，在形态上与真正病毒粒子相同或相似，保留了病毒原有的抗原表位和空间构象，但不含有病毒基因组，故不能自主复制，因此无致病性。由于其具有与完整病毒相似的免疫原性，且颗粒呈现纳米大小，通过激活抗原提呈细胞，可诱导多种类型的免疫应答，特别是粘膜免疫，并且具有良好的免疫原性和较高的安全性等特点，目前已经成为研制用于人或动物病毒性感染疾病的潜在的安全高效候选疫苗之一。

综上所述，目前亟待研发一种能够高效、安全、低成本地制备猪delta冠状病毒病毒样颗粒的方法，为防控pdcov的感染提供疫苗。

技术实现要素：

针对现有技术中目前尚无用于防控pdcov感染的安全有效的疫苗问题，本发明的首要目的是提供一种猪delta冠状病毒病毒样颗粒。

本发明的第二个目的是提供上述猪delta冠状病毒病毒样颗粒的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述猪delta冠状病毒病毒样颗粒的应用。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种猪delta冠状病毒结构蛋白基因，其包括结构蛋白s基因、结构蛋白e基因、结构蛋白m基因和结构蛋白n基因并分别进行扩增；

结构蛋白s基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；

结构蛋白e基因的核苷酸序列如seqidno.2所示；

结构蛋白m基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；

结构蛋白n基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。

作为本发明的优选实施例时，扩增时，结构蛋白s基因的核苷酸序列的正向引物序列如seqidno.5所示；反向引物序列如seqidno.6所示；

结构蛋白e基因的核苷酸序列的正向引物序列如seqidno.7所示；反向引物序列如seqidno.8所示；

结构蛋白m基因的核苷酸序列的正向引物序列如seqidno.9所示；反向引物序列如seqidno.10所示；

结构蛋白n基因的核苷酸序列的正向引物序列如seqidno.11所示；反向引物序列如seqidno.12所示。

作为本发明的优选实施例时，克隆结构蛋白s基因、结构蛋白m基因和结构蛋白n基因的核苷酸序列时，起始密码子atg前设有ecorⅰ酶切位点序列，终止密码子后设有hindiii酶切位点序列；

克隆结构蛋白e基因的核苷酸序列时，起始密码子atg前设有xhoi酶切位点序列，终止密码子后设有kpni酶切位点序列。

一种重组穿梭质粒，其包括上述的猪delta冠状病毒结构蛋白基因。

一种重组杆粒，其包括上述的重组穿梭质粒。

一种重组杆状病毒，其包括上述的重组杆粒。

一种猪delta冠状病毒病毒样颗粒，其由上述的重组杆状病毒感染sf9细胞纯化制得。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：

一种如上述的猪delta冠状病毒病毒样颗粒的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、设计并扩增猪delta冠状病毒结构蛋白基因；

(2)、构建包括步骤(1)的猪delta冠状病毒结构蛋白基因的重组穿梭质粒；

(3)、构建包括步骤(2)的重组穿梭质粒的重组杆粒；

(4)、将步骤(3)的重组杆粒感染sf9细胞，得到重组杆状病毒；

(5)、将步骤(4)的重组杆状病毒感染sf9细胞，纯化得到猪delta冠状病毒病毒样颗粒。

为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：

一种如上述的猪delta冠状病毒病毒样颗粒在预防猪delta冠状病毒引起的猪腹泻疾病疫苗中的应用。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

第一、本发明的制备方法基于杆状病毒-昆虫细胞表达系统(bac-to-bac)，使用无血清培养的sf9细胞表达制备，结合蔗糖密度溶液超速离心获得猪delta冠状病毒病毒样颗粒，该pdcov-vlp病毒样颗粒具有完整性，免疫原性好，免疫动物产生抗体滴度和安全性高的优点，可用于猪delta冠状病毒病毒病的预防，因此，该方法适合于进行大规模制备猪delta冠状病毒病毒样颗粒可作为候选疫苗，具有良好的开发与应用前景。

第二、本发明的猪delta冠状病毒病毒样颗粒中westernblot结果显示其可与pdcov各结构蛋白的抗体发生特异性结合，表明重组杆状病毒能够在昆虫细胞中成功表达猪delta冠状病毒的4种结构蛋白。

附图说明

图1为本发明中实施例1的猪delta冠状病毒结构蛋白(s，e，m，n)基因扩增条带电泳图；泳道m为核酸分子量。

图2为本发明中实施例2的猪delta冠状病毒pfbd-pdcov-s、pfbd-pdcov-n和pfbd-pdcov-e/m重组载体的酶切鉴定核酸电泳图；其中泳道1为pfbd-pdcov-s重组质粒电泳图；泳道2为pfbd-pdcov-s重组质粒经限制性核酸内切酶作用后的电泳图；泳道3为pfbd-pdcov-e/m重组质粒电泳图；泳道4为pfbd-pdcov-e/m重组质粒经限制性核酸内切酶作用酶切m基因后的电泳图；泳道5为pfbd-pdcov-e/m重组质粒经限制性核酸内切酶作用酶切e基因后的电泳图；泳道6为pfbd-pdcov-n重组质粒电泳图；泳道7为pfbd-pdcov-n重组质粒经限制性核酸内切酶作用后的电泳图；泳道m为不同核酸分子量。

图3为本发明中实施例5的猪delta冠状病毒结构蛋白(s，e，m，n)westernblot鉴定结果图；其中泳道1，3，6，8为阴性对照；泳道2为s蛋白样品；泳道4为e蛋白样品；泳道5为n蛋白样品；泳道7为m蛋白样品；m为蛋白标准分子质量；泳道1和2使用s蛋白鼠源抗体；泳道3和4使用e蛋白鼠源抗体；泳道5和6使用n蛋白鼠源抗体；泳道7和8使用m蛋白鼠源抗体。

图4为本发明中实施例6的猪delta冠状病毒病毒样颗粒pdcov-vlp的电镜图。

具体实施方式

本发明提供了一种猪delta冠状病毒病毒样颗粒及其制备方法和应用。

<猪delta冠状病毒病毒样颗粒>

(结构蛋白基因)

本发明的猪delta冠状病毒(pdcov)结构蛋白基因包括结构蛋白s基因、结构蛋白e基因、结构蛋白m基因和结构蛋白n基因并分别进行扩增；其中，结构蛋白s基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；结构蛋白e基因的核苷酸序列如seqidno.2所示；结构蛋白m基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；结构蛋白n基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。

其中，猪delta冠状病毒结构蛋白s基因的核苷酸序列的扩增正向引物pdcov-s-pf序列如seqidno.5所示，反向引物pdcov-s-pr序列如seqidno.6所示；结构蛋白e基因的核苷酸序列的扩增正向引物pdcov-e-pf序列如seqidno.7所示，反向引物pdcov-e-pr序列如seqidno.8所示；结构蛋白m基因的核苷酸序列的扩增正向引物pdcov-m-pf序列如seqidno.9所示，反向引物pdcov-m-pr序列如seqidno.10所示；结构蛋白n基因的核苷酸序列的扩增正向引物pdcov-n-pf序列如seqidno.11所示，反向引物pdcov-n-pr序列如seqidno.12所示。

实际上，克隆猪delta冠状病毒结构蛋白(s，n，m)基因核苷酸序列时，起始密码子atg前设有ecorⅰ酶切位点序列，终止密码子后设有hindiii酶切位点序列；结构蛋白e基因核苷酸序列起始密码子atg前设有xhoi酶切位点序列，终止密码子后设有kpni酶切位点序列。

(重组穿梭质粒)

重组穿梭质粒pfbd-pdcov-s、pfbd-pdcov-n和pfbd-pdcov-e/m是将猪delta冠状病毒的结构蛋白(s，e，m，n)基因插入到pfastbactmdual载体形成得到。

(重组杆粒)

rb-pdcov-s、rb-pdcov-n和rb-pdcov-e/m重组杆粒是将pfbd-pdcov-s、pfbd-pdcov-n和pfbd-pdcov-e/m重组质粒转化至dh10bac感受态细胞发生转座所得。

(重组杆状病毒)

将rb-pdcov-s、rb-pdcov-n和rb-pdcov-e/m重组杆粒分别转染sf9细胞，得到表达猪delta冠状病毒结构蛋白(s，e，m，n)的重组杆状病毒rbv-pdcov-s、rbv-pdcov-n和rbv-pdcov-e/m。

(猪delta冠状病毒病毒样颗粒)

将重组杆状病毒rbv-pdcov-s、rbv-pdcov-n和rbv-pdcov-e/m共感染sf9细胞，纯化，得到猪delta冠状病毒病毒样颗粒pdcov-vlp。

<猪delta冠状病毒病毒样颗粒的制备方法>

本发明的猪delta冠状病毒病毒样颗粒的制备方法包括如下步骤：

(1)、扩增猪delta冠状病毒结构蛋白(s，e，m，n)基因；

(2)、利用步骤(1)的结构蛋白基因构建3种重组穿梭质粒：pfbd-pdcov-s、pfbd-pdcov-n和pfbd-pdcov-e/m；

(3)、利用步骤(2)的重组穿梭质粒构建3种重组杆粒：rb-pdcov-s、rb-pdcov-n和rb-pdcov-e/m；

(4)、将步骤(3)的3种重组杆粒分别转染sf9细胞，得到表达猪delta冠状病毒结构蛋白(s，n，e/m)的重组杆状病毒rbv-pdcov-s、rbv-pdcov-n和rbv-pdcov-e/m；

(5)、将步骤(4)的3种重组杆状病毒共感染sf9细胞，纯化，得到猪delta冠状病毒病毒样颗粒pdcov-vlp。

<猪delta冠状病毒病毒样颗粒的应用>

本发明的猪delta冠状病毒病毒样颗粒可以在防控pdcov感染引起的猪腹泻病的疫苗中得以应用。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1猪delta冠状病毒结构蛋白(s，e，m，n)基因的设计与合成

根据猪delta冠状病毒的全基因组序列，分别设计了该病毒结构蛋白(s，e，m，n)基因的引物，分别在结构蛋白s，m，n基因的核苷酸序列的起始密码子atg前添加ecorⅰ酶切位点：gaattc，终止密码子后添加hindiii酶切位点：aagctt；在结构蛋白e基因的核苷酸序列的起始密码子atg前添加xhoi酶切位点：ctcgag，终止密码子后添加kpni酶切位点：ggtacc。其中，猪delta冠状病毒结构蛋白s基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，结构蛋白s基因的核苷酸序列的扩增正向引物pdcov-s-pf序列如seqidno.5所示，反向引物pdcov-s-pr序列如seqidno.6所示。结构蛋白e基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，结构蛋白e基因的核苷酸序列的扩增正向引物pdcov-e-pf序列如seqidno.7所示，反向引物pdcov-e-pr序列如seqidno.8所示。结构蛋白m基因的核苷酸序列如seqidno.3所示，结构蛋白m基因的核苷酸序列的扩增正向引物pdcov-m-pf序列如seqidno.9所示，反向引物pdcov-m-pr序列如seqidno.10所示。结构蛋白n基因的核苷酸序列如seqidno.4所示，结构蛋白n基因的核苷酸序列的扩增正向引物pdcov-n-pf序列如seqidno.11所示，反向引物pdcov-n-pr序列如seqidno.12所示。利用猪delta冠状病毒提取的rna，反转录获得cdna作为模板，利用pcr技术扩增并纯化获得4种结构蛋白的基因片段，如图1所示。

实施例2重组穿梭质粒pfbd-pdcov-s，pfbd-pdcov-n，pfbd-pdcov-e/m的构建与鉴定

使用限制性核酸内切酶ecori和hindiii双酶切猪delta冠状病毒结构蛋白(s，m，n)基因的纯化产物和pfastbac^tmdual质粒，37℃反应2h，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收cap蛋白基因片段与线性化的pfastbactmdual；取t4dna连接酶、t4buffer、线性化的pfastbactmdual各1μl加入到7μl的s(或m或n)蛋白基因片段中，轻轻混匀，将混合物加入到刚刚融化的trans5α感受态细胞中，冰上孵育30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，37℃活化1h后均匀地涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的lb培养平板上，37℃倒置培养12h，获得重组穿梭质粒pfbd-pdcov-s、pfbd-pdcov-n和pfbd-pdcov-m菌落。挑取单个菌落，接种在含氨苄青霉素(100μg/ml)的液体lb培养基中，37℃，220rpm震荡培养12h，使用omga质粒小量提取试剂盒提取质粒，将获得的质粒使用ecorⅰ和notⅰ双酶切进行鉴定。

使用限制性核酸内切酶xhoi和kpni双酶切构建成功的重组穿梭质粒pfbd-pdcov-m与e基因的纯化产物，37℃反应2h，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收cap蛋白基因片段与线性化的pfastbactmdual；取t4dna连接酶、t4buffer、线性化的pfastbactmdual各1μl加入到7μl的e蛋白基因片段中，轻轻混匀，将混合物加入到刚刚融化的trans5α感受态细胞中，冰上孵育30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，37℃活化1h后均匀地涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的lb培养平板上，37℃倒置培养12h，获得重组穿梭质粒pfbd-pdcov-e/m菌落。挑取单个菌落，接种在含氨苄青霉素(100μg/ml)的液体lb培养基中，37℃，220rpm震荡培养12h，使用omga质粒小量提取试剂盒提取质粒，将获得的质粒使用ecorⅰ和notⅰ双酶切进行鉴定，重组质粒的酶切鉴定核酸电泳结果。如图2所示，鉴定表明获得构建正确的重组穿梭质粒pfbd-pdcov-s、pfbd-pdcov-n和pfbd-pdcov-e/m。

实施例3猪delta冠状病毒结构蛋白(s，e，m，n)重组杆粒构建与重组杆粒的提取

分别取50ng实施例2中的重组穿梭质粒pfbd-pdcov-s、pfbd-pdcov-n和pfbd-pdcov-e/m，然后分别加入到刚刚冰上融化的dh10bac感受态细胞中，轻轻混匀冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，使用无抗生素的soc培养基37℃震荡活化4h，取100μl均匀涂布在含卡那霉素(50μg/ml)、四环素(10μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)、x-gal(100μg/ml)和iptg(40μg/ml)的lb蓝白斑筛选平板上，37℃倒置培养48h，挑取白色菌落进行pcr鉴定，将含有目的条带的菌液采用三线法在上述lb蓝白斑筛选平板上划线，37℃倒置培养36h后，挑取白色菌落进行pcr鉴定，获得rb-pdcov-s、rb-pdcov-n和rb-pdcov-e/m重组载体，选取仅含有目的条带的菌液进行扩大培养。

菌液在37℃，220rpm震荡培养12h后，4000rpm，4℃离心1min收集菌体，使用溶液ⅰ(50mmol/l葡萄糖、25mmol/ltris-hclph8.0、10mmol/ledtaph8.0)重悬沉淀，加入溶液ⅱ(0.2mol/lnaoh、1％sds)轻轻颠倒裂解菌体，加入溶液ⅲ(60％5mol/l乙酸钾、11.5％冰乙酸)，轻轻上下颠倒，12000rpm，4℃离心10min弃掉沉淀，将上清转移至新的ep管中，加入等量的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置20min，12000rpm，4℃离心10min弃掉上清，加入70％无水乙醇，轻轻颠倒，离心弃掉上清，并重复一次。将沉淀使用无菌风吹干，至半透明状，加入适量的无菌水，静置使其自然溶解，即为重组杆粒rb-pdcov-s、rb-pdcov-n和rb-pdcov-e/m。

实施例4表达猪delta冠状病毒结构蛋白的重组杆状病毒rbv-pdcov-s、rbv-pdcov-n和rbv-pdcov-e/m的拯救

将sf9细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁且汇合度达50％以上时，使用双无grace昆虫细胞培养基替换原有培养基(ⅱ)。取8μlⅱ转染试剂加入到100μl双无grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀。

另将分别取3μg实施例3中的重组杆粒rb-pdcov-s、rb-pdcov-n和rb-pdcov-e/m分别加入到100μl双无grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀；将稀释的重组杆粒加入到稀释后的转染试剂中，混合均匀，室温孵育20min，将混合物均匀的滴加到6孔板中。4h后弃掉转染混合物，换为ⅱ完全培养基。27℃继续培养，持续观察直至出现病毒感染征象。

待细胞出现脱落或裂解时，收集培养上清，4000rpm，4℃离心5min去掉上清中的大分子物质，使用0.22μm低蛋白结合滤器过滤，滤出液即为第一代重组杆状病毒rbv-pdcov-s、rbv-pdcov-n和rbv-pdcov-e/m，即分别表达猪delta冠状病毒结构蛋白(s，n，e/m)的重组杆状病毒rbv-pdcov-s、rbv-pdcov-n和rbv-pdcov-e/m。重组杆状病毒盲传至第三代，-80℃保存。

实施例5westernblot鉴定重组杆状病毒rbv-pdcov-s、rbv-pdcov-n和rbv-pdcov-e/m蛋白的表达

将实施例4中剩余的细胞内加入适量的裂解液，冰上裂解30min后，制备蛋白样品。蛋白样品经10％sds-page，半干法将蛋白转印至pvdf膜上，5％脱脂乳室温封闭1h，分别使用猪delta冠状病毒4种结构蛋白的鼠源抗体4℃孵育12h，tbst清洗pvdf膜10min×3次，加入hrp标记的山羊抗鼠igg室温孵育1h，tbst清洗pvdf膜10min×3次，将ecl化学发光液均匀地滴加在pvdf膜上，使用tanon2500进行曝光，如图3所示，重组猪delta冠状病毒的结构蛋白(s，e，m，n)westernblot鉴定结果。

实施例6猪delta冠状病毒样颗粒pdcov-vlp鉴定

按s:e/m:n(5:2:1)实施例4中的重组杆状病毒感染sf9细胞96h。3500rpm，4℃离心20min，取上清，0.45μm低蛋白结合滤器过滤，20％(m:v)蔗糖垫35000rpm，4℃离心2h，使用2mlpbs重悬沉淀，使用pbs稀释至40ml，35000rpm/min，4℃离心2h，去掉蔗糖，使用超纯水重悬沉淀，进行1％磷钨酸负染，透射电镜观察pdcov-vlp的结构，如图4所示，猪delta冠状病毒样颗粒pdcov-vlp电镜图，图中箭头所指为猪delta冠状病毒病毒样颗粒，通过透射电镜可见直径约为150nm左右的猪delta冠状病毒病毒样颗粒。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>上海交通大学

<120>猪delta冠状病毒病毒样颗粒及其制备方法和应用

<141>2020-01-20

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3480

<212>dna

<213>猪delta冠状病毒结构蛋白s基因的核苷酸序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

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<210>2

<211>252

<212>dna

<213>猪delta冠状病毒结构蛋白e基因的核苷酸序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>2

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