一种棉花叶蜜腺相关基因GaNEC1及其应用的制作方法

文档序号：21198419发布日期：2020-06-23 19:01阅读：314来源：国知局

本发明涉及一种棉花叶蜜腺相关基因ganec1及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

棉花是世界上最重要的纤维作物，也是世界上最重要的油料作物之一。其生产、流通、加工和消费，均与人民群众的生活和广大棉农的利益息息相关，对国民经济的发展有着重要影响。

棉叶背面叶脉上有凹窝，即蜜腺，窝内有许多棒状突起，分泌蜜汁。观察发现，亚洲棉有蜜腺材料的叶片背面中脉上，离叶基约1cm处有一蜂窝状凹陷，即为蜜腺所在，窝内有许多乳头状突起，可分泌蜜汁，最多时在5条叶脉上可生5个蜜腺。有蜜腺材料叶蜜腺颜色在形成初期呈淡绿色，成熟期呈白色，随着叶片的长大和成熟，蜜腺逐渐变为黑色；无蜜腺材料在叶背面叶脉上缺少蜂窝状的凹陷蜜腺，因而叶片的主脉光滑，无蜜腺材料的叶片除了缺少叶蜜腺外，叶片的其他结构与有蜜腺材料基本一致。有蜜腺材料叶蜜腺呈卵型凹陷，蜜腺所在部位的细胞破裂，细胞呈无序状态，且在凹陷的底部有许多棒锤状蜜腺毛密集其中，在蜜腺毛基部与叶脉维管束之间是亚腺组织，腺毛与亚腺组织共同构成蜜腺无蜜腺材料则没有卵型凹陷，没有蜜腺组织的地方都充满了薄壁组织，排列十分整齐。棉花由于蜜腺多，蜜期长，蜜物多，易发生虫害。培育无蜜腺性状棉花品种，可减轻棉花虫害，因此挖掘与棉花叶蜜腺相关基因成为转基因育种的关键。

gwas(genomewideanalysisstudy)作为一种联系表型与基因型之间的分析方法，已在控制作物(水稻、玉米、谷子、番茄、黄瓜、大豆中)的主要农艺性状的关键基因的定位中发挥着重要作用。中国亚洲棉作为亚洲棉六大地里种系之一，在长期的种植过程中经人工选择和分化形成了众多地方品种，具有一定的多样性，可以作为gwas分析的群体。而中国亚洲棉在地理选择过程中关键基因受到选择，从而提高了植株相关性状的抗性，因此gwas可以作为鉴定棉花相关基因的强有力手段。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种棉花叶蜜腺相关基因ganec1及其应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种棉花叶蜜腺相关基因ganec1，其核苷酸序列如seqidno.6所示。

一种基因ganec1在筛选有、无叶蜜腺棉花品种中的应用。

一种基因ganec1在培育有、无叶蜜腺性状棉花品种中的应用。

一种基因ganec1在调控棉花叶蜜腺形成中的应用。

调控棉花叶蜜腺形成的方法为抑制ganec1基因表达量可阻碍棉花叶蜜腺的形成。

一种含有基因ganec1的重组载体。

一种含有上述重组载体的重组微生物。

一种上述重组载体或重组微生物在调控棉花叶蜜腺形成中的应用。

一种阻碍棉花叶蜜腺形成的方法，抑制基因ganec1表达量。

抑制基因ganec1表达量的物质：

(a)如seqidno.13所示的核苷酸序列；

(b)含有(a)的重组载体；具体为将如seqidno.13所示的核苷酸序列插入表达载体得到重组载体。

本发明的有益效果：

1、通过对棉花高质量snp进行叶片蜜腺的gwas分析遗传分析，从而筛选出与蜜腺相关基因ga12g1409，即基因ganec1。

2、在有叶蜜腺的材料和无叶蜜腺的材料中进行测序，发现基因ganec1具有1个外显子，位置分别为146-233bp。ganec1在两种材料中存在序列差异，在无叶蜜腺材料当中存在一个15bp的碱基缺失以及一个非同义的单核苷酸突变，二者分别位于cds序列的547-561bp处和530bp处。缺失的序列为：catattcagatttac，对应的氨基酸为：hiqiy，突变的碱基为t-g，对应改变的氨基酸为l-r，该片段的缺失和单核苷酸的突变是导致无叶蜜腺棉花形成的根本原因。

3、对ganec1的表达模式进行分析，表达谱显示，ganec1在下胚轴和叶片蜜腺中高表达，进一步表明ganec1是与蜜腺发育相关的候选基因。

4、为了进一步验证ganec1的基因功能，从ga0029中克隆了ganec1的3’端片段，并构建了trv156-ganec1，用于病毒诱导的基因沉默，以下调叶片中ganec1的表达。结果表明，和转空载体棉花相比，ganec1沉默棉花叶蜜腺在形状和大小均与空载体有较大的差别，说明ganec1沉默棉花的叶蜜腺形成受到了阻碍，进而说明ganec1基因参与棉花叶蜜腺的形成，与棉花的叶蜜腺密切相关，可作为育种的候选基因。

附图说明

图1为棉花蜜腺的gwas分析结果。图中，a为染色体，b为12号染色体的分化信号，c为12号染色体的snp-cluster。

图2为有叶蜜腺的材料和无叶蜜腺的材料基因ganec1的cds序列比对图。

图3为有叶蜜腺的材料和无叶蜜腺的材料中不同部位的基因ganec1表达量示意图。

图4为注射vigs后，棉花表型及基因ganec1表达量示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1：gwas分析

使用emmax软件(http://genetics.cs.ucla.edu/emmax/)，对1425003个高质量的snp(maf>0.05，缺失率<20％)进行叶片蜜腺的gwas分析遗传分析。全基因组显著性阈值用公式p＝0.05/n(其中n是独立snp的有效数量)进行评估(miao-xinli,juilianm.y.yeung,staceys.cherny,pakc.sham.evaluatingtheeffectivenumbersofindependenttestsandsignificantp-valuethresholdsincommercialgenotypingarraysandpublicimputationreferencedatasets[j].humangenetics,2012,131(5):747-756)。亚洲棉种群显著性的p值为～1.0×10^-6。

蜜腺的gwas分析结果显示，发现在12号染色体(～19.5mb到～20.1mb)上发现了一个强关联信号(图1a)。放大chr12上的分化信号显示，～0.64mb区域(19.57～20.21mb)显示出显著的群体分化，平均fst值为0.40，而全基因组规模的平均fst值为7.8×10^-3(图1b)。在chr12上放大snp-cluster，其起始位置为19.55～20.07mb，与fst区有500kb(19.57～20.07mb)的重叠区域，表明500kb片段是无蜜腺性状的重要候选区域。500kb区域有11个基因，其中ga12g1408、ga12g1409和ga12g1412在外显子区域有snps，ga12g1413、ga12g1416和ga12g1417在内含子区域有snps(图1c)。所有这些基因都是无蜜腺性状的候选基因，对外显子存在snp的候选基因进行测序发现ga12g1409在两种材料上存在明显的序列差异，再一次佐证了ga12g1409为蜜腺相关基因，并将该蜜腺基因命名为ganec1。

实施例2：基因测序比对

基因ganec1在有叶蜜腺的材料和无叶蜜腺的材料中测序结果为：在无蜜腺材料中该基因存在一段15bp的碱基缺失以及一个非同义的单核苷酸突变。具体操作如下：

1、设计基因扩增引物：

cds1409-f：5’-atgctccaccctaaccataaacc-3’(seqidno.1)

cds1409-r：5’-cctattttgaattggcgaagatcaat-3’(seqidno.2)

2、pcr扩增：

pcr扩增的反应体系(50μl)如下：5×primestarbuffer10μl、dntpmixture4μl、cds1409-f(10μm)1μl、cds1409-r(10μm)1μl、cdna1μl，primestarhstaq(5u/μl)1μl，超纯水32μl。

pcr反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火70s，68℃延伸45s，32个循环；最后68℃延伸5min。

3、电泳：

pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用qiagen凝胶纯化试剂盒(qiagen，valencia，ca)进行纯化。

4、pcr纯化产物连接测序载体

按照艾德莱生物有限公司的零背景ppoto-bluntsimple平末端克隆试剂盒(目录号：cv17)将凝胶纯化的pcr扩增子克隆入该载体中，并转化大肠杆菌dh5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落pcr，把阳性克隆进行测序。测序引物为载体通用引物：

m13-f：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’(seqidno.3)

m13-r：5’-caggaaacagctatgacc-3’(seqidno.4)

5、测序结果分析

扩增的cds序列如下：

>ganec1less：

atgctccaccctaaccataaacctaccatcaaattcctctgcagttaccgcggtaaaatccttcctcgttatcctgaccgtaaactctgttatcatggtggcgaaacccgtgtactcgtcgttgatcgctctatttccttctccgagttgtcgttgaagatgggggagatgtgtggaacatcggtgagtttacgttgccagttgccaacagaagacttggacgcgctggtttcgattacttccggtgaagaactcgcctacctcatcgaggaatacgatcggttggcatcgcctgcatcctttttaaagatacgagctttccttgggatgccaaaatcaaccacaaaatcaatttctctatcatcctcgtccttaacgttatcatccacttcatcttcaaattcatcttcatcgtcatcaactccccggtcttcctgcgtacgtcatatccccaggactccccccgtcgctttccctccttgctcctccaagaaatcaaccacaaacaatattccttgctatggttatcgagttcatcatggcaacgttagaactggaaacactggcaattgcaatagcaggaaccagcatcataaactgtttacctattttgaattggcgaagatcaataag(seqidno.5)

>ganec1

atgctccaccctaaccataaacctaccatcaaattcctctgcagttaccgcggtaaaatccttcctcgttatcctgaccgtaaactctgttatcatggtggcgaaacccgtgtactcgtcgttgatcgctctatttccttctccgagttgtcgttgaagatgggggagatgtgtggaacatcggtgagtttacgttgccagttgccaacagaagacttggacgcgctggtttcgattacttccggtgaagaactcgcctacctcatcgaggaatacgatcggttggcatcgcctgcatcctttttaaagatacgagctttccttgggatgccaaaatcaaccacaaaatcaatttctctatcatcctcgtccttaacgttatcatccacttcatcttcaaattcatcttcatcgtcatcaactccccggtcttcctgcgtacgtcatatccccaggactccccccgtcgctttccctccttgctcctccaagaaatcaaccacaaacaatattccttgctatggttatctagttcatcatggcaaccatattcagatttacgttagaactggaaacactggcaattgcaatagcaggaaccagcatcataaactgtttacctattttgaattggcgaagatcaattag(seqidno.6)

测序结果表明：pcr扩增得到的基因组大小为736bp，cds序列大小为648bp，采用dnaman软件对获得的序列进行预测分析，发现该基因具有1个外显子，位置分别为146-233bp。ganec1在两种材料中存在序列差异，在无叶蜜腺材料当中存在一个15bp的碱基缺失以及一个非同义的单核苷酸突变，二者分别位于cds序列的547-561bp处和530bp处。缺失的序列为：catattcagatttac，对应的氨基酸为：hiqiy，突变的碱基为t-g，对应改变的氨基酸为l-r(图2)，该片段的缺失和单核苷酸的突变是导致无叶蜜腺棉花形成的根本原因。

实施例3：ganec1的表达模式分析

1、材料选择

根据有叶蜜腺和无叶蜜腺的表型不同选取ga0029和ga0028进行表达模式分析。其中，ga0029为有叶蜜腺的亲本，ga0028为无叶蜜腺的亲本。

2、引物设计

定量pcr引物如下：

qganec1-f：5’-catcgtcatcaactccccggtc-3’(seqidno.7)

qganec1-r：5’-gctggttcctgctattgcaattgc-3’(seqidno.8)

gahistone3-f：5’-tcaagactgatttgcgtttcca-3’(seqidno.9)

gahistone3-r：5’-gcgcaaaggttggtgtcttc-3’(seqidno.10)

3、材料准备

将上述所示的两种材料的饱满种子种于自然条件下棉花试验田中，1周大定苗，每20cm留1株，幼苗期(3片真叶)开始取样，随着棉花的不断生长分别取棉花的花瓣、花蕾、雄蕊、纤维、根、茎、子叶、下胚轴、真叶、蜜腺的不同组织样品，速冻于液氮中，-80℃冰箱保藏备用。

4、rna提取及cdna的合成

采用液氮冷冻研磨样品，并采用多糖多酚植物总rna提取试剂盒(tiangen，北京，货号dp441)中的方法提取不同组织样品的总rna，随后采用大连宝生物公司的primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser(货号rr047a)试剂盒合成cdna，-20℃保藏备用。

5、定量pcr反应

以步骤4中合成的cdna为模板(浓度大于50ng/μl)，采用步骤2中的引物，使用abi7900定量pcr仪，进行定量pcr扩增，每个样品3个技术重复，以gahistone为内参基因，采用2^-△△ct法进行计算。

pcr扩增体系如下：

sybrpremixextaq(tlirnasehplus)(2×)10μl、qganec1-f(10mm)0.5μl、qganec1-r(10mm)0.5μl、roxreferencedyeii(50×)0.4μl、cdna模板2μl、ddh2o6.8μl。

sybrpremixextaq(tlirnasehplus)(2×)10μl、gahistone3-f(内参)(10mm)0.5μl、gahistone3-r(内参)(10mm)0.5μl、roxreferencedyeii(50×)0.4μl、cdna模板2μl、ddh2o6.8μl。

pcr条件如下：95℃30s，1个循环；95℃5s；60℃30s，40个循环。溶解曲线：95℃15s；60℃30s；95℃15s。

对获得的数据进行分析，结果如图3所示。从结果中可以看出：ganec1基因在有蜜腺的材料(ga0029)中叶脉(包含蜜腺)部位，下胚轴和真叶的表达量最高，在无叶蜜腺的材料(ga0028)中并无明显差异。因此得出结论：ganec1基因为蜜腺发育形成相关基因。

实施例4：ganec1基因在棉花中的功能验证

为了进一步验证ganec1的基因功能，从ga0029中克隆了ganec1的3’端片段，并构建了trv156-ganec1，用于病毒诱导的基因沉默(vigs)，以下调叶片中ganec1的表达，具体方法如下：

1、trv156-ganec1载体的构建

(1)引物设计：

vganec1-f：5’-aaggttaccgaattctctagaatgctccaccctaaccataaacc-3’(seqidno.11)

vganec1-r：5’-cgtgagctcggtaccggatccgttcttcaccggaagtaatcgaaacc-3’(seqidno.12)

(2)以有蜜腺材料(ga0029)的cdna为模板，以步骤(1)中引物来扩增，获得目的片段，连接pmd-19t载体，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，菌落pcr鉴定阳性克隆，并将其菌液测序。选择正确的克隆，提取质粒(pmd-19t-ganec1-v)。

(3)采用xbai和saci分别双酶切pmd-19t-ganec1-v和trv156载体，分别回收小片段和大片段，并采用t4连接酶过夜连接，得到trv156-ganec1载体。将其转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在卡那霉素培养基上筛选阳性克隆，采用菌落pcr验证并对其进行测序。

结果表明：trv156-ganec1为将序列如seqidno.13所示的dna片段替换trv156载体的xbai和saci酶切位点间的片段，且保持trv156载体的其他序列不变得到的载体。

>trv156-ganec1

atgctccaccctaaccataaacctaccatcaaattcctctgcagttaccgcggtaaaatccttcctcgttatcctgaccgtaaactctgttatcatggtggcgaaacc(seqidno.13)

2、侵染菌液的制备

(1)重组菌的获得

将步骤1获得的trv156-ganec1载体转化农杆菌gv3103，得到重组菌trv156-ganec1/gv3103。

将trv156载体转化农杆菌gv3103，得到重组菌trv156/gv3103。

将trv156-pds载体转化农杆菌gv3103，得到重组菌trv156-pds/gv3103。

将trv192载体转化农杆菌gv3103，得到重组菌trv192/gv3103。

上述trv156-ganec1/gv3103为实验组；trv156/gv3103为空载体对照；trv156-pds/gv3103为阳性对照，其中，pds基因为干涉棉花的八氢番茄红素脱氢酶基因，影响叶绿素的合成，导致棉花叶片出现白化现象。

(2)重组菌的培养

分别将重组菌trv156/gv3103、trv156-ganec1/gv3103、trv156-pds/gv3103和trv192/gv3103接种于添加25μg/ml利福平，25μg/ml庆大霉素和50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，28℃，180rpm培养至od值为1.5-2.0；离心(5000rpm)收集上述菌体，并采用mma溶液(10mm2-吗啉乙磺酸、10mmmgcl2、200μm乙酰丁香酮)重悬浮至od600等于1.8，室温静置3-6h，分别得到培养后的重组菌。

(3)侵染菌液的制备

将培养后的重组菌trv156/gv3103与trv192/gv3103按照1:1的体积比混匀，得到混合菌液1；

将培养后的重组菌trv156-ganec1/gv3103与trv192/gv3103按照1:1的体积比混匀，得到混合菌液2；

将培养后的重组菌trv156-pds/gv3103与trv192/gv3103按照1:1的体积比混匀，得到混合菌液3。

3、ganec1沉默棉花的获得及其表型分析

(1)棉花生长介质的制备及待侵染棉花幼苗的制备

将灭菌后的沙子、砂土和营养土按照2：2：1的质量比均匀混合，得到沙土混合物，混匀，作为棉花生长介质。挑选饱满的含叶蜜腺品种ga0029的种子，分别种植于制备的棉花生长介质中，播种7天后定苗，每个营养钵留1株，25℃，16h光照/8h暗培养进行培养，作为待侵染棉花。

(2)ganec1沉默棉花的获得

分别将混合菌液1、混合菌液2和混合菌液3注射子叶刚平展期的待侵染棉花子叶的下表皮，暗培养24h后在25℃，16h光照/8h暗培养进行培养，分别得到转空载体棉花(trv156)、ganec1沉默棉花(trv156-ganec1)和pds沉默棉花(阳性对照植株)。待阳性对照植株出现白化现象后，随机取转空载体棉花、ganec1沉默棉花的叶片，提取总rna，并进行定量pcr检测基因沉默效率(ganec1沉默棉花中的ganec1基因相对表达量与转空载体棉花中的ganec1基因相对表达量的比值)。检测方法同实施例3步骤5。并于注射混合菌液后的不同时间观察其表型变化。

定量pcr检测基因沉默效率如图4b(#1、#2和#3表示trv2::ganec1三个生物学重复)所示，由图可以看出：和转空载体棉花(trv2::00)相比，ganec1沉默棉花(trv2::ganec1)中的ganec1基因表达量明显下降，说明ganec1基因被沉默，沉默效率在30％左右。

沉默表型统计结果如图4所示。其中图4a第一行两图为基因沉默棉花(trv156-ganec1)的表型，第二行两图为转空载体棉花(trv156)表型，图4c为基因沉默棉花的石蜡切片，图4d为图4c的局部放大图，图4e为转空载体棉花的石蜡切片，图4f为图4e的局部放大图。通过观察发现：和转空载体棉花相比，ganec1沉默棉花叶蜜腺在形状和大小均与空载体有较大的差别，说明ganec1沉默棉花的叶蜜腺形成受到了阻碍，进而说明ganec1基因参与棉花叶蜜腺的形成，与棉花的叶蜜腺密切相关，可作为育种的候选基因。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>一种棉花叶蜜腺相关基因ganec1及其应用

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

atgctccaccctaaccataaacc23

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

cctattttgaattggcgaagatcaat26

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

tgtaaaacgacggccagt18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

caggaaacagctatgacc18

<210>5

<211>633

<212>dna

<213>棉花(gossypiumspp.)

<400>5

atgctccaccctaaccataaacctaccatcaaattcctctgcagttaccgcggtaaaatc60

cttcctcgttatcctgaccgtaaactctgttatcatggtggcgaaacccgtgtactcgtc120

gttgatcgctctatttccttctccgagttgtcgttgaagatgggggagatgtgtggaaca180

tcggtgagtttacgttgccagttgccaacagaagacttggacgcgctggtttcgattact240

tccggtgaagaactcgcctacctcatcgaggaatacgatcggttggcatcgcctgcatcc300

tttttaaagatacgagctttccttgggatgccaaaatcaaccacaaaatcaatttctcta360

tcatcctcgtccttaacgttatcatccacttcatcttcaaattcatcttcatcgtcatca420

actccccggtcttcctgcgtacgtcatatccccaggactccccccgtcgctttccctcct480

tgctcctccaagaaatcaaccacaaacaatattccttgctatggttatcgagttcatcat540

ggcaacgttagaactggaaacactggcaattgcaatagcaggaaccagcatcataaactg600

tttacctattttgaattggcgaagatcaataag633

<210>6

<211>648

<212>dna

<213>棉花(gossypiumspp.)

<400>6