一种LvCTL4基因及编码的蛋白质、蛋白质的获取方法、表达载体、重组菌和应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种lvctl4基因及编码的蛋白质、蛋白质的获取方法、表达载体、重组菌和应用。

背景技术：

从古至今，海产品一直倍受人们青睐，它具体高蛋白、高营养价值及低脂肪的特点，同时，富含许多微量元素。随着渔业的不断发展，目前渔业生产过程中也面临着许多问题，其中人们非常关注的问题便是病害问题：各种细菌或者病毒病经常引起鱼、虾大量死亡，从而给养殖业带来巨大经济损失。为了预防和控制鱼、虾病害的发生，养殖户不得不大量使用化学药物进行池塘消毒或者在饲料中添加抗生素类药物。但是大量使用化学药物或者抗生素类药物会带来严重的生态破坏以及食品安全问题，因此，亟待开发可应用于现代渔业的无污染、无残留、安全有效的新型渔药，使之能够部分甚至全部取代化学或抗生素类药物使用的安全有效的抗菌或抗病毒药，这将具有重要的经济价值和社会意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种lvctl4基因及编码的蛋白、蛋白质的获取方法、表达载体、重组菌和应用，本发明提供的lvctl4基因连接到到载体中，将得到的表达载体电转化到毕赤酵母中，表达得到lvctl4基因编码的蛋白质，代替目前水产饲料中使用的抗生素，以达到既可预防和治疗动物疾病，又可减少滥用素带来的不良后果的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种lvctl4基因，所述lvctl4基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的lvctl4基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了一种表达载体，将上述技术方案所述的lvctl4基因连接到酵母表达载体ppic9k的ecori位点和noti位点之间，得到表达载体。

本发明还提供了一种重组菌，将上述技术方案所述的表达载体转入top10克隆菌株中，提取质粒，将所述质粒电转化到毕赤酵母中，得到重组菌。

优选的，所述毕赤酵母包括毕赤酵母gs115。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的lvctl4基因编码的蛋白质的获取方法，将上述技术方案所述的重组菌进行液体培养，将得到的培养液离心，得到上清液，纯化所述上清液中lvctl4基因编码的蛋白质，得到蛋白质。

本发明还提供了上述技术方案所述的重组菌在制备水生动物抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。

优选的，所述水生动物包括鱼或虾。

本发明提供了一种lvctl4基因及编码的蛋白、蛋白质的获取方法、表达载体、重组菌和应用，所述lvctl4基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明提供的lvctl4基因连接到到载体中，将得到的表达载体电转化到毕赤酵母中，表达得到lvctl4基因编码的蛋白质，代替目前水产饲料中使用的抗生素，以达到既可预防和治疗动物疾病，又可减少滥用素带来的不良后果的目的。

附图说明

图1为酵母表达载体ppic9k结构简图；

图2为lvctl4序列插入ppic9k示意图；

图3为序列比对结果；

图4为质粒ppic9k-ctl4酶切电泳检测，其中m：marker(200,500,800,1200,2000,3000,4500bp)，1：酶切前质粒，2：酶切后质粒；

图5为质粒线性化分析，其中m：dna标准品从下到上2000,3000,4000,5000,6000,8000,10000bp，1：saci酶切，2：回收目的片段；

图6为转化平板图；

图7为基因组提取结果，其中m：dna标准品从下到上1000,2000,3000,4000,5000,6000,8000,10000bp，1-10：提取的基因组；

图8为pcr分析阳性克隆，其中m：dna标准品从下到上100,200,500,750,1000,1500,2000bp，1：阳性质粒，2-11：10株单菌落，12：阴性对照；

图9为蛋白表达鉴定wb分析，其中m：蛋白标准品，1：gs115菌株培养72小时分泌上清，2：4#阳性菌株培养72小时分泌上清，3：4#阳性菌株培养96小时分泌上清，4：5#阳性菌株培养72小时分泌上清，5：5#阳性菌株培养96小时分泌上清，6：6#阳性菌株培养72小时分泌上清，7：6#阳性菌株培养96小时分泌上清，8：7#阳性菌株培养72小时分泌上清，9：7#阳性菌株培养96小时分泌上清；

图10为蛋白sds-page纯化分析，m：蛋白质分子质量标准，1：30mm咪唑洗脱，2：30mm咪唑洗脱，3：80mm咪唑洗脱，4：80mm咪唑洗脱，5：250mm咪唑洗脱，6：250mm咪唑洗脱；

图11为蛋白westernblot鉴定分析，其中m：蛋白质分子质量标准，1：纯化后样品；

图12为副溶血弧菌凝集图；

图13为枯草杆菌凝集图。

具体实施方式

本发明提供了一种lvctl4基因，其特征在于，所述lvctl4基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体如下：

gaaagacagaagaggatccatttaagatgaaggccttgtgtctgcttttcgtcgccgttatggccgttggttgccatgggtgttctgatggctggctggatatcaatggcgtctgcttttacttccatcaagaccagagtatgccctgggaggacgcgaagaggttttgtgaaacaagcggagcagttctggccaaggtagcaaatgcacagactctcagggaattttatgagtacatcctaacatatggcctatcaggatcatactggctgggggcctccgatcagtcttatgaaggtgactggctgtgggtagctgataactctagggttaacaagggtacaccctactgggctatccacaatggaatctttggctgggctcatgaacctgcaggtggcgctgacgaaaactgccttctgcttgatgaaactcgcaaatattactttaatgatgccaattgtaacctgattcatcatcccatttgtatggtttaaatgtaaccataaataaagcttggcaataaaataccctgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

本发明还提供了上述技术方案所述的lvctl4基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示，具体如下：

mkalcllfvavmavgchgcsdgwldingvcfyfhqdqsmpwedakrfcetsgavlakvanaqtlrefyeyiltyglsgsywlgasdqsyegdwlwvadnsrvnkgtpywaihngifgwahepaggadencllldetrkyyfndancnlihhpicmv。

本发明还提供了一种表达载体，将上述技术方案所述的lvctl4基因连接到酵母表达载体ppic9k的ecori位点和noti位点之间，得到表达载体。本发明对所述lvctl4基因连接到酵母表达载体ppic9k中的方法没有特殊限定，采用常规基因连接到酵母表达载体中的方法即可。本发明使用毕赤酵母重组表达lvctl4，与大肠杆菌表达相比，利用酵母表达蛋白在生产实践上具有诸多优势。一是毕赤酵母具有生物的来细胞结构，具有糖酰化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能，其表达产物更接近动物体内的蛋白。二是外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失，表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达，表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化。三是酵母菌含有动物生长发育所必需的各种营养物质，可作为优质蛋白质源添加到鸡、猪、反刍、水产等饲料中。

本发明还提供了一种重组菌，将上述技术方案所述的表达载体转入top10克隆菌株中，提取质粒，将所述质粒电转化到毕赤酵母中，得到重组菌。在本发明中，所述毕赤酵母优选包括毕赤酵母gs115。本发明对所述表达载体转入top10克隆菌株的方法没有特殊限定，采用常规方法即可，本发明对所述提取质粒和电转化的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的lvctl4基因编码的蛋白质的获取方法，将上述技术方案所述的重组菌进行液体培养，将得到的培养液离心，得到上清液，纯化所述上清液中lvctl4基因编码的蛋白质，得到蛋白质。在本发明中，所述重组菌进行液体培养使用的培养基优选为bmmy培养基，所述液体培养的时间优选为养96h。本发明优选使用ni-nta层析柱纯化上清液中的lvctl4基因编码的蛋白，利用冷冻干燥机对纯化蛋白溶液进行浓缩，得到蛋白质。

本发明还提供了上述技术方案所述的重组菌在制备水生动物抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。在本发明中，所述水生动物优选包括鱼或虾。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook,j.,russell,davidw.,molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition,2001,ny,coldspringharbor)。所用引物及dna序列均由华大基因(深圳)科技有限公司合成。

本发明采用ppic9k载体、赤酵母gs115购自南京钟鼎生物技术有限公司，ppic9k载体的质粒图谱分别如图1所示；oligodt、各种限制性内切酶和taq酶均购自takara公司，t4dna连接酶购自neb公司，胶回收试剂盒和质粒少量抽提试剂盒购自omega公司，质粒大量抽提试剂盒购自nucleobond公司；dmem高糖培养基、胎牛血清均购自hyclone公司；转染试剂magetran购自origene公司；倒置显微镜为olympus产品，荧光倒置显微镜为nikon公司产品。spf南美白对虾(体重10.2±0.33g),取自广西水产研究所南美白对虾国家良种场。ppic9k质粒(南京钟鼎生物科技有限公司)，top10菌株(南京钟鼎生物科技有限公司)，gs115(购自life公司，钟鼎实验保存)，proteinmarker(全式金生物科技有限公司)，pvdf膜(购自美国millipore公司)，x光片(购自美国柯达公司)，ecl显色液(购自中国普利莱公司)，鼠抗his单抗(全式金生物科技有限公司)，兔抗鼠hrp二抗(全式金生物科技有限公司)，acr、bis、tris等(购自sigma公司)，sds(购自amresco公司)，tyrptone、yeastextract(购自oxoid公司)，pcr反应管(购自fisher公司)，0.22μm无菌滤器和透析袋(购自millipore公司)，ni2+ida亲和层析胶(zoonbio公司)agarose(购自上海基因公司)，dna胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(购自axygen公司)，saci(购自宝生物)，常规生化试剂为国产分析纯。若无特别说明，本发明采用的其他试剂均为市售商品。

实施例1

1、对虾组织取样：凡纳滨对虾，平均体重约为12克。取样时，除了血淋巴外，还分别取眼柄、鳃、肝胰腺、心脏、胃、肠、血淋巴、表皮，置于rnalater液(美国anbin公司)中-80℃保存备用。

2、总rna提取：使用trizolreagent提取总rna，参照根据nanodrop1000spectrophotometer和agilent2100bioanalyzer检测提取总rna的质量以及完整性，具体方法参照说明书。

3、lvctl4基因全长扩增：根据凡滨对虾lvctl4序列信息，设计lvctl4蛋白编码区扩增引物，在引物的5′端设置了酶切位点及保护性碱基。使用oligo(dt)引物将凡纳滨对虾总rna逆转录成cdna。以对虾cdna为模板，使用lvctl4特异性引物(上游引物seqidno.3：5＇-atgaaggccttgtgtctgctt-3＇；下游引物seqidno.4：5＇-catttaaaccatacaaatggga-3＇)进行pcr扩增。pcr反应采用25μl体系：模板cdna2.0μl，上下游引物各0.5μl，pcrmix12.5μl，加超纯水pcr反应程序：94℃预变性5mi；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃30s，35sycle；72℃延伸10min。pcr增产物交由华大基因科技有限公司进行测序；利用dnastar软件对测序结果进行分析。

4、ppic9k-ctl4载体构建：本发明实例采用的载体ppic9k质粒图谱如图1所示，该质粒为环状双螺旋质粒，空载质粒9.3kb个碱基，含有氨苄青霉素及卡那霉素筛选基因，多克隆位点可以插入外源基因，多克隆位点上游含有6个组氨酸编码序列，因此所表达的蛋白含有6个组氨酸组成的蛋白标签。如图1所示，利用限制性内切酶ecori、noti分别酶切lvctl4核酸片段以及ppic9k载体，然后胶回收lvctl4及ppic9k片段。使用t4连接酶将lvctl4连接至ppic9k载体的ecori位点(gaattc)和noti位点(gcggccgc)之间，获得的重组质粒ppic9k-ctl4转入top10克隆菌株；挑取阳性克隆子测序，测序结果如图2所示，单划线区域为lvctl4基因区域；黄色区域为酶切位点。

5、ppic9k-ctl4质粒酶切鉴定：按表1反应体系对ppic9k-ctl4质粒进行双酶切。

表1双酶切反应体系

酶切鉴定结果如图4所示，图中：m为核酸分子量标尺marker，由下至上每条条带的大小分别为200,500,800,1200,2000,3000,4500bp。1为酶切前质粒，2为酶切后质粒。

6、质粒提取及线性化：提取质粒20μg左右，使用saci对其进行线性化，冻干浓缩待用，方法如下所示。

表2质粒线性化反应体系

37℃消化3h。取5μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳。

质粒线性化结果如图5所示，图中：m：dna标准品从下到上2000,3000,4000,5000,6000,8000,10000bp，1：saci酶切产物2：回收目的片段。

7、电转酵母细胞gs115：冰浴电转杯，将10μl线性化质粒加入到装有80μl毕赤酵母感受态细胞的1.5mlep管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。电击条件为：电压1.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击时间为4～10msec。电击完成后，将650μl冰上预冷的浓度为1m山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2mlep管中，30℃静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于md平板上，30℃恒温培养3-4d。结果如图6所示。

8、pcr鉴定阳性克隆菌株：待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500μlypd液体培养基离心管，30℃，180r/min过夜培养。挑选10株克隆，分别提取基因组dna(编号为12345678910)，基因组dna电泳结果如图7所示。以重组酵母基因组dna为模板，使用5’pgappriming和3’aox1priming引物对目的基因进行pcr鉴定，结果显示均为阳性。pcr鉴定阳性克隆子，预期条带大小约1.0k。pcr鉴定如图8所示，图中：m为dnamarker，从下到上各条带分别为100,250,500,750,1000,2000bp；1为阳性质粒pcr条带，2-11为阳性克隆菌pcr条带，12为阴性对照。

9、小试表达：取鉴定的阳性菌株4#、5#、6#、7#，50μl接入装有10mlbmgy培养液(酵母粉：0.1克，蛋白胨：0.2克，ynb：0.134克，0.1mol/lph7.0磷酸缓冲液，甘油：0.1毫升，加蒸馏水到10ml)的锥形瓶中，30℃，220r/min过夜培养，摇至od600＝2～6(对数生长，大约16-18h)；室温离心5000r/min离心5min，收集细胞，去除上清，用10mlbmmy重悬细胞，进行诱导表达；每24h从培养基中取样1ml，并加甲醇至终浓度0.5％继续诱导；以下各时间点0，24，48，72，96h样品10000r/min离心2min上清待检测。

10、wb(westernblot)鉴定分析：取小试表达上清样品25μl上样聚丙烯酰胺凝胶。上样完毕后，先90v跑完浓缩胶，再将电压升至200v直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100v转膜，约为1.5h，恒流250ma。电转结束后，取下膜后先用pbst洗涤4次，每次5min。将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。次日将膜取出后用pbst洗膜4次，每次5min。用含5％牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1h。反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。ecl显影，曝光。

表3一抗以及二抗稀释比例

lvctl4重组蛋白westernblot分析结果如图9所示，4#、5#、6#、7#菌株72及96小时上清液均检测到预期大小目的蛋白，说明lvctl4重组蛋白在重组酵母4#、5#、6#、7#菌株表达成功。图9中，m为蛋白marker；1为gs115菌株培养72小时分泌上清；2为4#阳性菌株培养72小时分泌上清；3为4#阳性菌株培养96小时分泌上清；4为5#阳性菌株培养72小时分泌上清；5为5#阳性菌株培养96小时分泌上清；6为6#阳性菌株培养72小时分泌上清；7为6#阳性菌株培养92小时分泌上清；8为7#阳性菌株培养72小时分泌上清；9为7#阳性菌株培养92小时分泌上清。

11、lvctl4重组蛋白纯化：取4#阳性菌株120小时发酵液5000rpm×10min离心，取上清液进行蛋白纯化。具体方法：将层析柱固定在支架上，关闭层析柱的帽子；轻微混匀ni-nta树脂填料(填料中含有等体积的30％乙醇)，取4-5ml上清液装入层析柱中，静置待填料全部自然沉降至底部后，松开帽子让30％乙醇流出，然后以8倍柱体积的bufferb平衡柱子一次；往平衡好的柱子加入约8倍柱体积的蛋白溶液，调整帽子控制流速，在重力作用下自然过柱；用8倍柱体积用bufferc冲洗柱子2次，收集流出液。用1倍柱体积的用bufferd洗脱柱子4次，收集流出液；用1倍柱体积的buffere洗脱柱子4次，收集流出液；取穿透液以及各梯度流出液进行sds-page电泳，分析重组蛋白质在各管中分布情况。使用蛋白定量试剂盒测定蛋白的浓度。洗脱液sds电泳结果如图10所示：m为蛋白质分子质量标准；1为30mm咪唑洗脱样品；2为30mm咪唑洗脱样品；3为80mm咪唑洗脱样品；4为80mm咪唑洗脱样品；5为250mm咪唑洗脱样品；6为250mm咪唑洗脱样品。lvctl4重组蛋白纯化样品wb(westernblot)鉴定如图11所示：m为蛋白质分子质量标准；1为纯化后的lvctl4样品。

12、lvctl4蛋白的活性分析：用tbs-cabuffer(50mmolltrisehcl,50mmollnacl,10mmollcacl2,ph7.5)将fitc标记的细菌(副溶血弧菌、枯草杆菌)稀释至2.5×10⁹cells/ml，将lvctl4或lvctl4稀释至60mg/ml。实验组取10μl菌液和25μllvctl4混合，阴性对照组取10μl菌液与25μlbsa溶液(60mg/ml)混合。将混合液置培养箱37℃孵育45min。分别取上述混合样品10μl滴至玻片，加以盖玻片覆盖，在荧光显微镜下观察。实验结果见图9和图10，lvctl4蛋白对副溶血弧菌、枯草杆菌具有凝集活性。

13、lvctl4的抗病效果：将lvctl4重组表达毕赤酵母菌种接种到bmmy培养基(含胰蛋白胨2％、酵母提取物1％、ynb1.34％、生物素4×10-5％、1m磷酸钾缓冲液，ph6.0，20％、甲醇1％)，30℃，220r/min培养培养96小时。通过喷洒和搅拌将酵母发酵液与对虾饲混合，酵母菌在饲料的含量为2×10⁶cfu/kg。密封条件下将酵母配合饲料放至温室30℃发酵14天备用。以同样方法将重组6×his标签蛋白的毕赤酵母喷洒至对虾饲料并发酵14天。

动物试验对虾分四组，每组1000尾，体重约为4.5g/尾。各组分别放置于100立方米水体中，盐度为25‰，24小时充气养殖。实验组对虾暂养7天，适应试验环境后，开始进行酵母饲料投喂实验。试验1组每日投喂lvctl4表达酵母发酵饲料，每天饲料投喂量约为对虾体重的5％。试验2组投喂6×his标签蛋白表达酵母发酵饲料，试验3组及试验4组投喂普通对虾饲料，饲料投喂的量与1组相同。差别投喂第7天后进行细菌感染实验：往1、2、3试验组养殖池中添加副溶血弧菌，水体中弧菌终浓度达4×10⁴cfu/l，4组不添加弧菌。攻毒后每日观察发病情况，病统计死亡数据；期间若有死虾，及时捞出，以免腐烂影响水体。攻毒后14天捞出各组剩余对虾进行称重，攻毒试验结束。

实验结果如表4所示，投喂lvctl4表达酵母发酵饲料的实验1组对虾存活率显著高于投喂6×his标签蛋白表达毕赤酵母饲料的试验2组以及投喂普通饲料的试验3组；投喂lvctl4表达酵母发酵饲料的实验1组对虾终期平均体重高于其他实验组。

表4实验对虾死亡情况表

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广西壮族自治区水产科学研究院

<120>一种lvctl4基因及编码的蛋白质、蛋白质的获取方法、表达载体、重组菌和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>563

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaaagacagaagaggatccatttaagatgaaggccttgtgtctgcttttcgtcgccgtta60

tggccgttggttgccatgggtgttctgatggctggctggatatcaatggcgtctgctttt120

acttccatcaagaccagagtatgccctgggaggacgcgaagaggttttgtgaaacaagcg180

gagcagttctggccaaggtagcaaatgcacagactctcagggaattttatgagtacatcc240

taacatatggcctatcaggatcatactggctgggggcctccgatcagtcttatgaaggtg300

actggctgtgggtagctgataactctagggttaacaagggtacaccctactgggctatcc360

acaatggaatctttggctgggctcatgaacctgcaggtggcgctgacgaaaactgccttc420

tgcttgatgaaactcgcaaatattactttaatgatgccaattgtaacctgattcatcatc480

ccatttgtatggtttaaatgtaaccataaataaagcttggcaataaaataccctgaaaaa540

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa563

<210>2

<211>156

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metlysalaleucysleuleuphevalalavalmetalavalglycys

151015

hisglycysseraspglytrpleuaspileasnglyvalcysphetyr

202530

phehisglnaspglnsermetprotrpgluaspalalysargphecys

354045

gluthrserglyalavalleualalysvalalaasnalaglnthrleu

505560

arggluphetyrglutyrileleuthrtyrglyleuserglysertyr

65707580

trpleuglyalaseraspglnsertyrgluglyasptrpleutrpval

859095

alaaspasnserargvalasnlysglythrprotyrtrpalailehis

100105110

asnglyilepheglytrpalahisgluproalaglyglyalaaspglu

115120125

asncysleuleuleuaspgluthrarglystyrtyrpheasnaspala

130135140

asncysasnleuilehishisproilecysmetval

145150155

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgaaggccttgtgtctgctt21

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

catttaaaccatacaaatggga22