用于检测水稻HIS1基因是否存在BBC类除草剂抗性的分子标记物及其应用的制作方法

本发明属于分子标记
技术领域：
，尤其涉及一种用于检测水稻his1基因中是否存在28bp缺失的分子标记物，及其该分子标记物在鉴定水稻his1基因中是否存在28bp缺失，和该分子标记物在杂交水稻制种中获得真杂交种后代的应用。
背景技术：
：水稻(oryzasatival.)是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，全球有超过35亿人口以水稻作为主食，在农业生产与实践中占有举足轻重的地位。在水稻整个生活周期中，杂草是影响稻米品质的重要因素，杂草与水稻在稻田中共生，互相竞争生长空间和土壤养分，可导致水稻产量降低10％-20％，严重时甚至使水稻减产90％以上。目前，最为经济、快捷、有效的除草方式是化学除草。一种新型的稻田除草剂：双环磺草酮(bbc)除草剂，由日本sds生物公司研究开发，是一种双环辛烷类白化型三酮类除草剂。作为内吸传导、茎叶喷雾型除草剂，bbc水溶性较低，向下移动性增强，水田外流失减少，对环境的负面影响减轻；其次，bbc具有低毒性、杀草谱宽，药效持久性强的优点，对于防除一年生杂草、多年生杂草以及秋熟杂草具有明显的作用，也可有效防除由畦边延向本田的假稻、难除杂草疣草等。然而bbc只能作用于粳稻，在籼稻田使用该类除草剂会造成部分品种稻苗白化甚至死亡，因此在籼稻田不建议使用。杂交水稻已经由以细胞质雄性不育系为遗传工具的第一代“三系法”，逐渐过渡到以光温敏雄性不育系的“两系法”杂交稻，并在农业生产上应用广泛，效益显著，经久不衰。“三系法”杂交水稻至今种植面积约占杂交稻面积的50％，其不育系育性稳定，但其质量受到保持系与恢复系的制约，恢复系较少，保持系更少，种源稀少宝贵，同时，随着农村劳动力减少，从事杂交水稻种子生产的主要劳动力有限，造成在制种关键时刻劳动力投入不足、除杂不及时，杂株识别难度大，影响种子质量。“两系法”杂交水稻制种不受恢保关系制约，配组自由，能够选育出强优势、好品质、多抗性的杂交水稻组合几率更大。“两系法”杂交水稻遍布全国16个省份，部分省份种植面积已经超过“三系法”杂交水稻，但两系不育系起点温度高、耐受低温时间短，在制种过程中容易遇到低于不育起点温度的天气，导致不育系自交结实、制种失败。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，克服以上
背景技术：
中提到的不足和缺陷，提供一种用于快速、高效检测水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性的分子标记物及其使用方法，并在此基础上，实现bbc类除草剂在籼稻田水稻杂交制种过程中的应用，以及该分子标记物在转育抗/感bbc类除草剂水稻材料中的应用。水稻his1基因(loc_os02g17940)是近期克隆的对bbc类除草剂具有广谱抗性的水稻内源性基因。经过系统分析，我们发现水稻his1基因变异主要在内含子区，在编码区发生变异的只有五个位点：第9位、第968位，第1057位和1548位存在的单碱基变异，以及第831-858位碱基处存在的28bp片段缺失变异，该28bp片段缺失变异存在于水稻his1基因第四外显子。经过进一步研究，对不同单倍型编码的氨基酸序列进行分析，我们发现在第831-858位碱基处存在的28bp片段缺失变异是影响his1基因抗除草剂功能的主要原因，水稻his1基因的bbc类除草剂抗性表型为显性，his1基因28bp片段缺失变异的显隐性类型为隐性，含有隐性纯合子his1基因的水稻对bbc类除草剂抗性丧失，且只存在于部分籼稻品种中，而含有显性纯合子或杂合子his1基因的水稻对bbc类除草剂具有抗性。因此，探索我国常用籼稻育种材料中哪些品种存在28bp片段缺失变异，这对bbc类除草剂在籼稻田大面积推广与利用具有重要意义。进一步的，利用his1基因在第四外显子的28bp片段缺失变异导致bbc类除草剂抗性丧失这一特点设计特异性分子引物，用于鉴定某一籼稻品种中his1基因是否存在上述28bp片段缺失变异，同时利用bbc类除草剂只能在粳稻田中应用的特性，能够在一定程度上提高现阶段水稻杂交制种纯度，以及缓解两系不育系制种过程中“打摆子”的问题，对培育创新种质资源以及解放劳动力具有意义。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：一种用于检测水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性的分子标记物，所述分子标记物包括以下序列的正向引物f(名称为：ccj-cf)和反向引物r(名称为：ccj-cr)：ccj-cf：5’-gtacaacttgacgatgtatcaag-3’(如seq.idno.1所示)；ccj-cr：5’-gttgaatcttgcaaatgcaggagc-3’(如seq.idno.2所示)。基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述分子标记物在检测水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性或检测水稻his1基因显隐性类型的应用。上述的应用，优选的，具体包括如下步骤：s1、采用ctab法提取待鉴定水稻叶片的dna样本；s2、以所述步骤s1的dna样本为模板，用所述的分子标记物进行pcr扩增；s3、取所述步骤s2后得到的扩增产物进行电泳，读取其片段大小；若扩增出的产物片段为单一的一条182bp条带(说明存在28bp片段缺失变异)，表示该水稻his1基因为隐性纯合子，则鉴定该水稻his1基因不存在bbc类除草剂抗性；若扩增出的产物片段为一条单一的210bp条带(说明不存在28bp片段缺失变异)，表示该水稻his1基因为显性纯合子，则鉴定该水稻his1基因存在bbc类除草剂抗性；若扩增出的产物片段包含一条182bp条带和一条210bp条带，表示该水稻his1基因为杂合子，则鉴定该水稻his1基因存在bbc类除草剂抗性。更优选的，用所述的分子标记物进行pcr扩增的具体操作包括如下步骤：将所述的分子标记物稀释为10mm，配置pcr反应体系：20μlpcr反应体系包含50ng/μl基因组dna2μl，5μm/ml前后引物各1μl，1.1×pcrmix16μl；pcr反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述分子标记物在杂交水稻制种中应用，所述应用时，采用混播混收的方式或光温敏雄性不育系的“两系法”进行杂交水稻制种，包括如下步骤：首先，采用所述的分子标记物检测水稻父本、母本的his1基因是否存在bbc类除草剂抗性，选择一方存在bbc类除草剂抗性、另一方不存在bbc类除草剂抗性的父本、母本进行杂交，然后用bbc类除草剂进行均匀喷洒，以除去对除草剂不具抗性的父本、母本或假杂交种，即获得真杂交种后代。一般来说，杂交水稻制种采用的父母本his1基因均为纯合子，且母本都是采用不育系。采用所述的分子标记物检测水稻父本、母本his1基因是否存在bbc类除草剂抗性的方法与前述相同。上述的应用，优选的，采用混播混收的方式进行杂交水稻制种时，具体包括如下步骤：首先，采用所述的分子标记物检测水稻父本、母本的his1基因是否存在bbc类除草剂抗性，选择母本his1基因存在bbc类除草剂抗性、父本his1基因不存在bbc类除草剂抗性的水稻品种进行混播，其中母本为不育系，待水稻完成自然授粉后，用bbc类除草剂对父本、母本水稻植株进行均匀喷洒，以除去对bbc类除草剂不具抗性的父本，存活的母本水稻植株上结出的后代即为真杂交种后代。更优选的，采用混播混收的方式进行杂交水稻制种时，采用的母本中，两系杂交稻母本包括033s、1892s、33s、66s、99s、gd-1s、gd-7s、n111s、n5088s、y58s、创5s、德s、凤s、福龙s2、广湘24s、广占63-4s、华68s、简s、建s、晶4155s、隆科638s、绿敏s、孟s、梦s、培矮64s、深08s、谭农s、天安s、天源6s、望s、新安s、新华s、星光s、宣69s和株1s中的任意一种或几种；三系杂交稻母本：ⅱ-32a、d62a、f32a、k17a、q1a、q4a、q6a、t98a、v20a、安丰a、奥富a、炳1a、博ⅱa、博ⅲa、博a、昌丰a、川106a、川谷a、川农1a、川农2a、川农3a、川农4a、川香29a、春江12a、春江16a、丰田1a、丰源a、福香1a、福伊a、赣香a、冈46a、冈48a、冈901a、冈香1a、谷丰a、广8a、广和a、广抗13a、恒丰a、洪a、沪旱1a、健645a、金23a、金谷a、旌3a、旌7a、旌香1a、科113a、科20a、科金a、龙特浦a、隆香634a、泸98a、泸香618a、泸香618a、珞红3a、珞红4a、绿永a、绵2a、绵5a、绵7a、绵香1a、内香2a、内香3a、内香5a、内香7a、内香8a、荃9311a、荣丰a、蓉18a、深97a、神9a、神农2a、蜀21a、蜀8a、泰3a、泰丰a、天丰a、万23a、万73a、万8a、万9a、万金a、五丰a、湘8a、湘丰70a、协青早a、欣荣a、新iia、宜香1a、元丰a、岳4a、粤泰a、云109a、珍汕97a、中2a、中3a和中9a中的任意一种或几种；采用的父本包括西恢18号、鉴真2号、德恢381、福恢2098、中组3号、ir64、盐恢559、桂582、宜恢3551、成恢727、明恢73、hr1128、苏恢728、珍珠早、宜恢2308、泉恢039、金航丝苗、华恢352、华恢118、叶青伦、宜恢1313、辐恢838、金早47、镇恢084、镇恢42、泸恢h103、内恢94-11、泉恢131、明恢100、绵恢725、杭959、南丰糯、内恢2539、福恢5138、绵恢2040、绵恢9939、南特号、蜀恢202、多系1号、明恢77、广恢3550、绵恢146、湘早籼13、蜀恢204、宜恢1577、明恢67、广恢312、多系一号、明恢63、雅恢2115、绵恢3724、红410、广恢122、蜀恢498、湘晚籼9号、蜀恢707、绵恢501、晋南晚、青小金早、川恢907、窄叶青8号、锡利贡米、南恢445、明恢2155、余赤231-8、温恢689、团结1号、r527、蜀恢203、明恢82、密阳23、奥r15、成都矮8号、涪恢9801、成恢19、明恢78、湘早籼13号、奥r69、桂朝13、绵恢9937、乐恢188、明恢1273、胜优2号、云恢310、广二104、德恢3485、川航恢1618、南恢115、川农422、云恢68、胜利籼、宜恢3003、泸恢615、亚恢627、广二石、昌丰b、湘晚籼13号、黔恢1385、南恢716、菲恢6号、红南、地谷、七桂早25、黔恢489、南恢1659、闽恢3301、八四矮63、ir36、雷火占、黔恢104、福恢676、常恢117、矮沱谷151、cdr22、鄂中5号、绵恢2009、南恢183、万恢88和ir56中的任意一种或几种。混播混收是杂交制种最为理想途径，传统方法是将同生育期的父母本按一定比例混合播种，然后通过物理或化学等方法将杂交种和父本种子分开，或直接在田间除去父本。但随着农村劳动力减少，从事杂交水稻种子生产的主要劳动力有限，造成在制种关键时刻劳动力投入不足、除杂不及时，杂株识别难度大，影响种子质量。而本发明通过先采用上述分子标记物鉴定水稻父母本his1基因中是否存在28bp缺失变异，进而判断该水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性，当父本his1基因存在28bp缺失变异，而母本his1基因正常时，可在杂交稻制种过程中混播父母本，待授粉后，在稻田喷洒bbc除草剂，从而去除不抗除草剂的父本，只剩下母本真杂交种，大大提高制种纯度与大大解放劳动力。上述的应用，优选的，采用光温敏雄性不育系的“两系法”进行杂交水稻制种时，具体包括如下步骤：首先，采用所述的分子标记物检测水稻父本、母本his1基因是否存在bbc类除草剂抗性，选择母本his1基因不存在bbc类除草剂抗性、父本his1基因存在bbc类除草剂抗性的水稻品种进行杂交，其中父本、母本的his1基因均为纯合子，正常收获f1代种子进行种植，用bbc类除草剂对f1代植株进行均匀喷洒(在幼苗3叶期喷洒效果最佳)，以除去因温度不稳定(低温)导致母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。光温敏雄性不育系的“两系法”制种容易存在大面积制种失败的现象，温度不稳定性改变是导致这种现象的主要原因之一。而本发明通过先采用上述分子标记物鉴定水稻父母本his1基因中是否存在28bp缺失变异，进而判断该水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性，选择父本his1基因正常，母本his1基因存在28bp缺失变异的水稻品种进行种植，即便在制种过程中遇到低温天气，导致母本自交结实，在f1代种子幼苗期喷施bbc除草剂，将母本自交结实的种子除去，只留下可抗除草剂的真杂种，缓解两系不育系制种过程中容易出现的“打摆子”现象。更优选的，采用光温敏雄性不育系的“两系法”进行杂交水稻制种时，采用的母本包括安农s-1、标810s、kt27s、华1037s、湘陵628s、准s、龙s、奥龙1s、雁农s、锦4128s、360s、华煜4127s、z9s、h175s、885s和明s中的任意一种或几种，采用的父本包括玉香油占、r402、p143、粤禾丝苗、中早22、r534和华占中的任意一种或几种。更优选的，采用光温敏雄性不育系的“两系法”进行杂交水稻制种时，采用的父母本组合包括：由准s母本与玉香油占父本组成的准两优香油占组合、由准s母本与r402父本组成的准两优402组合、由明s母本与p143父本组成的明两优143组合、由龙s母本与粤禾丝苗父本组成的龙两优粤禾丝苗组合、由锦4128s母本与中早22父本组成的锦两优22组合、由锦4128s母本与r534父本组成的锦两优534组合、由锦4128s母本与华占父本组成的锦两优华占组合、由华煜4127s母本与中早22父本组成的煜两优22组合或由湘陵628s母本与中早22父本组成的陵两优22组合。上述的应用，优选的，所述bbc类除草剂为双环磺草酮除草剂，施用时将所述双环磺草酮除草剂的浓度稀释为0.4μm-4μm后对目标植株进行喷洒。bbc类除草剂具有在粳稻田中广泛应用，但不适用于籼稻田，部分籼稻品种中his1基因第四外显子存在28bp片段缺失变异导致水稻对bbc类除草剂抗性丧失，利用这一特性，可以在杂交制种过程中，混播混收父母本，授粉后，喷洒bbc，除去不抗除草剂的父本，剩下母本真杂交种，可大大解放劳动力；同时，可有效缓解两系不育系制种过程中“打摆子”状况，提高制种纯度和质量。基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述分子标记物在转育抗/感bbc类除草剂水稻材料中的应用，所述应用包括如下步骤：选择一方存在bbc类除草剂抗性、另一方不存在bbc类除草剂抗性的水稻品种作为供体、受体进行杂交，将获得的杂交后代进行种植，利用所述的分子标记物检测杂交后代群体his1基因的显隐性类型，选择his1基因为杂合子的单株进行自交，或与受体材料回交后得到的回交后代选择杂合子再自交，得到的回交或自交后代群体均利用所述分子标记物进行检测，最后自交分离出纯合的对bbc类除草剂具有抗性或敏感的水稻材料。采用所述的分子标记物检测水稻植株his1基因显隐性类型的方法与前述方法相同。上述的应用，优选的，所述存在bbc类除草剂抗性的水稻品种中，两系不育系包括033s、1892s、33s、66s、99s、gd-1s、gd-7s、n111s、n5088s、y58s、创5s、德s、凤s、福龙s2、广湘24s、广占63-4s、华68s、简s、建s、晶4155s、隆科638s、绿敏s、孟s、梦s、培矮64s、深08s、谭农s、天安s、天源6s、望s、新安s、新华s、星光s、宣69s和株1s中的任意一种或几种；恢复系包括93-11、ir24、ir26、ir28、to463、测235、测253、测258、昌恢121、昌恢851、昌恢871、昌恢891、成恢177、成恢425、成恢448、大粒香15、德恢923、恩恢58、涪恢0724、涪恢9303、涪恢9802、福恢016、福恢964、广恢128、广恢368、广恢998、贵恢985、桂1025、桂44、桂649、桂99、旱恢3号、华占、黄华占、黄华占、江恢151、泸恢1345、泸恢17、泸恢602、泸恢8258、密阳46、明恢07、明恢1259、明恢70、南恢009、南恢125、南恢180、南恢511、南恢辐819、萍恢141、黔恢1388、蓉恢906、蜀恢137、蜀恢257、蜀恢361、蜀恢362、蜀恢538、蜀恢600、泰恢808、泰恢900、五山丝苗、先恢207、湘恢227、湘恢299、新香占、扬恢332、扬恢336、扬恢542、岳恢9113、粤农丝苗、粤香占、浙恢0506、浙恢7954、镇恢129、中413、中恢8006、中恢8012、中恢8015、中莲恢510和中莲恢950中的任意一种或几种；所述不存在bbc类除草剂抗性的水稻品种中，两系不育系包括安农s-1、标810s、kt27s、华1037s、湘陵628s、准s、龙s、奥龙1s、雁农s、锦4128s、360s、华煜4127s、z9s、h175s、885s和明s中的任意一种或几种；恢复系包括ir30、奥r15、昌恢t025、常恢117、成恢149、成恢19、成恢727、川恢907、德恢3485、德恢381、多系1号、多系一号、菲恢6号、涪恢9801、辐恢838、福恢2098、福恢5138、福恢673、福恢676、广恢122、广恢312、广恢3550、桂582、航1号、华恢118、华恢352、乐恢188、泸恢615、泸恢h103、绿稻24、绵恢146、绵恢2009、绵恢2040、绵恢3724、绵恢501、绵恢662、绵恢725、绵恢9937、绵恢9939、闽恢3301、明恢100、明恢1273、明恢2155、明恢63、明恢67、明恢73、明恢77、明恢78、明恢82、明恢86、南恢115、南恢1659、南恢183、南恢445、南恢716、内恢2539、内恢94-11、黔恢1385、黔恢785、泉恢039、泉恢131、蜀恢202、蜀恢203、蜀恢204、蜀恢498、蜀恢527、蜀恢707、苏恢728、泰恢187、万恢88、西恢18号、雅恢2115、亚恢627、盐恢559、宜恢1313、宜恢1577、宜恢2084、宜恢2292、宜恢2308、宜恢3003、宜恢3551、宜恢9号、云恢310、窄叶青8号、镇恢084和镇恢42中的任意一种或几种。与现有技术相比，本发明的有益效果为：1、本发明的分子标记物，及其在检测水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性或检测水稻his1基因显隐性类型的应用，可以快速、高效、准确、方便地鉴定水稻品系his1基因中是否存在28bp片段缺失变异，进而判断该水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性，为bbc除草剂在部分籼稻田的使用提供一定的理论依据，为后续采用bbc类除草剂进行杂交水稻制种以及转育抗/感bbc类除草剂水稻材料打下良好的基础。2、本发明的杂交水稻制种的应用，在杂交制种过程中可大大提高制种纯度，快速、准确、高效的获得真杂交种后代，操作简单，大大解放了劳动力，还可以在“两系法”制种过程中缓解“打摆子”现象，在杂交水稻种子纯度提升以及种质资源创新上都具有重要意义。3、本发明的转育抗/感bbc类除草剂水稻材料的应用，可以根据需要快速、准确、高效的自行选择对bbc类除草剂具有抗性或对bbc类除草剂敏感的水稻材料，遗传性稳定，适用性广，适于推广，操作简单，大大解放了劳动力，在种质资源创新上都具有重要意义。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是实施例1中24份水稻材料的his1基因电泳图；图2是实施例1中日本晴his1基因结构组成图；图3是实施例1中双环磺草酮除草剂对不同水稻抗性鉴定图；图4是实施例3中利用双环磺草酮除草剂对水稻材料的作用效果图；图5是实施例3中两系杂交稻母本、父本及其杂交种喷施bbc除草剂后的效果图(由左至右依次为明s，p143，明两优143)；图6是实施例4中蜀恢527、93-11和回交后代的his1基因电泳图；图7是实施例4中自交后代的his1基因电泳图和对应植株实物图；图8是实施例4中改造前的蜀恢527(左)和改造后的蜀恢527(右)经喷施双环磺草酮除草剂后的效果对比图；图9是实施例5中y58s、明s和回交后代的his1基因电泳图；图10是实施例5中自交后代的his1基因电泳图和对应植株实物图；图11是实施例5中改造前的y58s(左)和改造后的y58s(右)经喷施双环磺草酮除草剂后的效果对比图。具体实施方式为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。实施例1：一种用于检测水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性的分子标记物，包括下表1所示的正向引物f(名称为：ccj-cf)和反向引物r(名称为：ccj-cr)。表1：用于检测水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性的分子标记物名称碱基序列ccj-cfgtacaacttgacgatgtatcaag(如seq.idno.1所示)ccj-crgttgaatcttgcaaatgcaggagc(如seq.idno.2所示)正常水稻his1基因(位点名称：loc_os02g17940)的核苷酸序列如seq.idno.3所示，正常his1基因编码得到的氨基酸序列如seq.idno.5所示。在该his1基因第四外显子(编码区第831-858位碱基处)发生28bp片段缺失变异后，其his1突变型基因的核苷酸序列如seq.idno.4所示，该his1突变型基因编码得到的氨基酸序列如seq.idno.6所示。与正常his1基因编码得到的氨基酸序列对比，对his1突变型基因编码得到的氨基酸序列进行分析，发现该28bp片段缺失变异会移码并且导致提前终止，进而导致了水稻对bbc类除草剂抗性丧失，说明在第831-858位碱基处存在的28bp片段缺失变异是影响his1基因抗除草剂功能的主要原因。如果能够判断水稻his1基因第四外显子处是否存在28bp片段缺失变异，即可判断水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性，还有望进一步检测水稻his1基因显隐性类型。进一步的，利用本实施例的上述分子标记物检测水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性或检测水稻his1基因显隐性类型，其应用方法包括如下步骤：s1、采用ctab法，对水稻新鲜幼嫩叶片提取dna样本：取适量新鲜水稻叶片装入2ml离心管中并加入钢珠，于液氮中速冻，放入高通量组织研磨器(宁波新芝scientz-48)破碎组织，立即加入65℃预热的2×ctab溶液650μl，置于65℃水浴锅中恒温45min，每10min上下均匀颠倒一次，45min结束并待dna样品冷却到室温后置于通风橱中加入650μl氯仿﹕异丙醇(24﹕1)的溶液，上下颠倒混匀，12000rmp离心10min，将500μl上清液转移到1.5ml的离心管中，加入500μl异丙醇溶液混匀并于-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min，弃上清，加入1ml70％乙醇溶液洗除杂质，12000rmp离心5min后倒出上清，加入200μlddh2o于4℃冰箱中过夜溶解，得到提取的水稻样品dna模板。s2、将合成的引物ccj-cf、ccj-cr稀释为10mm；配置pcr反应体系：20μlpcr反应体系包含基因组dna2μl(50ng/μl)，前后引物各1μl(5μm/ml)，1.1×pcrmix(擎科生物技术有限公司)16μl。pcr反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。s3、将得到的扩增产物在3％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，读取扩增出的产物片段大小；若扩增出的产物片段为单一的一条182bp条带，表示该水稻his1基因为隐性纯合子，则鉴定该水稻his1基因不存在bbc类除草剂抗性；若扩增出的产物片段为一条单一的210bp条带，表示该水稻his1基因为显性纯合子，则鉴定该水稻his1基因存在bbc类除草剂抗性；若扩增出的产物片段包含一条182bp条带和一条210bp条带，表示该水稻his1基因为杂合子，则鉴定该水稻his1基因存在bbc类除草剂抗性。本实施例收集了24份水稻材料进行上述分子标记物的检测试验，24份水稻材料的his1基因电泳图见图1。其中，m为dl2000dnamarker，1为ir64，2为对照材料日本晴，3-24依次为：炳1b、地谷、粤泰a、9311、珍籼97b、丰源b、绵恢725、ii-32a、天丰a、丰华占、远恢2、粤泰b、ir36、桂99、丰源a、蜀恢498、密阳46、湘晚籼1号、d62b、g46b、cdr22、五丰a。由图1可知，ir64、地谷、绵恢725、ir36、蜀恢498、湘晚籼1号、cdr22扩增出的产物片段为一条182bp条带，存在28bp片段缺失变异，表示该水稻his1基因为隐性纯合子，则鉴定该水稻his1基因不存在bbc类除草剂抗性。其余水稻材料扩增出的产物片段为一条210bp条带，未存在28bp片段缺失变异，表示该水稻his1基因为显性纯合子，则鉴定该水稻his1基因存在bbc类除草剂抗性。实验室利用粳稻日本晴作为对照(日本晴his1基因结构如图2所示)，明恢82、德恢381、成都矮8号等应用比较广泛的重要籼稻育种材料作为实验组，将双环磺草酮除草剂(bbc)的有效成分浓度用水稀释为0.75μm后对长到3叶期的水稻苗进行均匀喷洒，15天后观察表型，结果如图3所示。结果表明his1基因存在28bp片段缺失变异的三种籼稻育种材料在用双环磺草酮除草剂稀释液处理15天后，稻苗枯黄干萎，最终死亡。而对照材料日本晴稻苗青葱较为健康。这说明bbc除草剂在应用过程中的确会对his1基因存在28bp片段缺失变异的部分籼稻产生致命性的药理作用，同时对his1基因完整的粳稻影响微小。在生产实践过程中，完全可以利用这一特性来缓解两系不育系“打摆子”状况以及解放在混播混收过中的劳动力。本发明的分子标记物及分子标记物的检测应用方法已在部分籼稻育种材料中检测出his1基因存在28bp片段缺失变异，目前已知his1基因存在28bp片段缺失变异的籼稻育种材料如表2所示。表2：我国常用籼稻育种材料中his1基因缺失28bp的材料实施例2：一种本发明实施例1的分子标记物及其应用方法在杂交水稻制种中的应用，采用混播混收的方式进行杂交水稻制种，包括如下步骤：ss1、采用本发明的分子标记物检测水稻父本、母本的his1基因是否存在bbc类除草剂抗性，具体操作方法参见实施例1；ss2、选择母本his1基因存在bbc类除草剂抗性(his1基因不存在28bp片段缺失变异)的水稻品种y58s、父本his1基因不存在bbc类除草剂抗性(his1基因存在28bp片段缺失变异)的水稻品种r527进行混播；ss3、待母本y58s和父本r527完成自然授粉后，将双环磺草酮除草剂的有效成分浓度稀释为4μm(田间成熟期植株，用最大浓度)，对父本、母本水稻植株进行均匀喷洒；父本r527由于不具有bbc抗性，植株开始白化，后渐渐枯死，最后只剩下母本y58s授粉后产生的种子。本实施例中，共混播母本y58s100蔸，父本r52720蔸，最后统计20蔸父本完全死亡。对所收获的种子进行纯度鉴定发现，100％的种子都为杂交种子。相比较传统的杂交水稻制种过程中，父本和母本需要分开种植，待授粉后割除父本材料相比，本方案实现了父本和母本混播混收，大大降低了杂交水稻种子生产成本。本发明利用双环磺草酮除草剂使得不存在bbc类除草剂抗性基因的父本白化死亡的特性，大大解放了劳动力，同时提升优化水稻种质资源。实施例3：一种本发明实施例1的分子标记物及其应用方法在杂交水稻制种中的应用，采用光温敏雄性不育系的“两系法”进行杂交水稻制种，包括如下步骤：sss1、采用本发明的分子标记物检测水稻材料his1基因中是否存在bbc类除草剂抗性，具体操作方法参见实施例1；sss2、在两系不育系中筛选到16份his1基因不存在bbc类除草剂抗性(存在28bp片段缺失变异)的水稻材料，对bbc类除草剂敏感，包括安农s-1、标810s、kt27s、华1037s、湘陵628s、准s、龙s、奥龙1s、雁农s、锦4128s、360s、华煜4127s、z9s、h175s、885s、明s；在两系恢复系的正常水稻材料中，筛选到344份his1基因不存在bbc类除草剂抗性(存在28bp片段缺失变异)的水稻材料，对bbc除草剂表现抗性；在这两种类型材料中，已经配组出两系杂交稻品种组合方案的有9种，如表3所示，母本不抗bbc，父本抗bbc，其中父本、母本的his1基因均为纯合子；按照上述10种两系杂交稻品种组合方案分别进行种植，杂交，正常收获f1代种子；sss3、种植f1代种子待其长到3叶期幼苗时，将双环磺草酮除草剂的有效成分浓度稀释为0.75μm，对f1代幼苗进行均匀喷洒；因温度不稳定(低温)导致母本自交接种的母本后代由于其对双环磺草酮除草剂不具抗性，经双环磺草酮除草剂喷洒后枯黄干萎，最终死亡，而经双环磺草酮除草剂喷洒后仍健康存活的即为真杂种后代，双环磺草酮除草剂对水稻材料的作用效果参照图4所示，双环磺草酮除草剂不具抗性的水稻材料叶片枯黄，甚至死亡，而对双环磺草酮除草剂具有抗性的水稻材料生长健康。表3：符合筛选条件的两系杂交稻组合图5中从左至右依次是两系杂交稻母本明s、父本p143及其杂交种明两优143经喷施双环磺草酮除草剂后的效果对比图。由图5可知，母本明s对双环磺草酮除草剂不具抗性，叶片枯黄，而父本p143及其杂交种明两优143对双环磺草酮除草剂具有抗性，植株生长健康。证明即便在制种过程中遇到低温天气，导致母本自交结实，在f1代种子幼苗期喷施双环磺草酮除草剂，将不具抗性的母本自交结实种子除去，只留下可抗除草剂的真杂种，该方法可以缓解两系不育系制种过程中容易出现的“打摆子”现象。其他8种两系杂交稻品种组合方案的效果与图5一致，均表现为母本对bbc类除草剂不具抗性，叶片枯黄，而父本及其真杂交种对bbc类除草剂具有抗性，植株生长健康，筛选的效率可达到100％，效果比较明显，因此能够达到提高杂交稻种子纯度的目的。总的来说，本发明的his1分子标记物，可快速、高效、准确、方便地鉴定水稻his1基因中是否存在28bp片段缺失变异，进而判断该水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性，，为bbc除草剂在籼稻田中大面积推广与应用提供一定的理论依据。另外，利用部分籼稻品种中his1基因第四外显子存在28bp片段缺失变异导致水稻对bbc类除草剂抗性丧失的特性，在杂交稻制种的混播混收以及“两系法”制种过程中采用bbc类除草剂进行除杂，可以大大提高制种纯度，快速、准确、高效的获得真杂交种后代，操作简单，大大解放了劳动力，还可以在“两系法”制种过程中缓解“打摆子”现象，对于杂交水稻种子纯度提升以及种质资源创新上都具有重要意义。实施例4：一种本发明实施例1的分子标记物及其应用方法在转育抗bbc类除草剂水稻材料中的应用，包括如下步骤：ssss1、选择存在bbc类除草剂抗性的水稻品种93-11作为供体，不存在bbc类除草剂抗性的水稻品种蜀恢527作为受体，进行杂交，将获得的杂交后代进行种植；ssss2、利用所述的分子标记物检测杂交后代群体his1基因的显隐性类型，具体操作方法参见实施例1；ssss3、选择his1基因为杂合子的单株与受体材料回交，回交后代利用所述分子标记物进行检测，其his1基因电泳图见图6(泳道m为marker，泳道1为蜀恢527，泳道2为93-11，泳道3-17为蜀恢527//蜀恢527/93-11的回交后代群体)，在回交后代中选择his1基因为杂合子的单株进行自交，自交后代群体利用所述分子标记物进行检测，检测方法同上，自交后代的his1基因电泳图和对应植株见图7(泳道1为蜀恢527，泳道2为93-11，泳道3-13为蜀恢527//蜀恢527/93-11的回交群体中选择的杂合单株自交后代群体)，在自交后代群体中筛选出his1基因为显性纯合子(扩增出的产物片段为一条单一的210bp条带)的单株，即为纯合的抗bbc类除草剂水稻材料。如图6所示，泳道4、6、7、10、12、16的回交后代群体his1基因为杂合子。如图7所示，泳道5、8、9、12的自交后代群体his1基因为显性纯合子(扩增出的产物片段为一条单一的210bp条带)，即纯合的抗bbc类除草剂水稻材料。图8是改造前的蜀恢527(左)和改造后的蜀恢527(右)经喷施双环磺草酮除草剂后的效果对比。由图8所示，改造前的蜀恢527对双环磺草酮除草剂不具抗性，叶片枯黄，而改造后的蜀恢527对双环磺草酮除草剂具有抗性，植株生长健康，说明通过本实施例的分子标记辅助选择，将93-11中的his1基因成功导入蜀恢527背景中，使蜀恢527获得了对bbc的抗性。实施例5：一种本发明实施例1的分子标记物及其应用方法在转育对bbc类除草剂敏感的水稻材料的应用，包括如下步骤：ssss1、选择不存在bbc类除草剂抗性的水稻品种明s作为供体，存在bbc类除草剂抗性的水稻品种y58s作为受体，进行杂交，将获得的杂交后代进行种植；ssss2、利用所述的分子标记物检测杂交后代群体his1基因的显隐性类型，具体操作方法参见实施例1；ssss3、选择his1基因为杂合子的单株与受体材料回交，回交后代利用所述分子标记物进行检测，其his1基因电泳图见图9(泳道m为marker，泳道1为y58s，泳道2为明s，泳道3-17为y58s//y58s/明s的回交后代群体)，在回交后代中选择his1基因为杂合子的单株进行自交，自交后代群体利用所述分子标记物进行检测，检测方法同上，自交后代的his1基因电泳图和对应植株见图10(泳道1为y58s，泳道2为明s，泳道3-14为y58s//y58s/明s的回交群体中选择的杂合单株自交后代群体)，在自交后代群体中筛选出his1基因为隐性纯合子(扩增出的产物片段为一条单一的182bp条带)的单株，即为纯合的对bbc类除草剂敏感的水稻材料。如图9所示，泳道3、6、8、12、13、15、17的回交后代群体his1基因为杂合子。如图10所示，泳道5、7、13的自交后代群体his1基因为隐性纯合子(扩增出的产物片段为一条单一的182bp条带)，即纯合的对bbc类除草剂敏感的水稻材料。图11是改造前的y58s(左)和改造后的y58s(右)经喷施双环磺草酮除草剂后的效果对比。由图11所示，改造前的y58s对双环磺草酮除草剂具有抗性，植株生长健康，而改造后的y58s对双环磺草酮除草剂不具抗性，叶片枯黄，说明通过本实施例的分子标记辅助选择，将明s中的his1基因成功导入y58s背景中，使y58s对bbc敏感。序列表<110>湖南杂交水稻研究中心<120>用于检测水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性的分子标记物及其应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtacaacttgacgatgtatcaag23<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gttgaatcttgcaaatgcaggagc24<210>3<211>4012<212>dna<213>水稻(oryzasatival.)<400>3cggcagctcacgccgcctccgctagctccccaagtcgaaacgtcgtcgcccctcatcatc60tcctcctcgttgtcgcacccccaaccgcacgctgccgccgctcgcttcctcctctcctcg120tctcactccagaaagccaagctgcaaagcactatggcacatcccatagcaatggcagcat180ggacacacagccatcggagccgaccgtggtaaaagctttcatcgcggtgcctgatatatc240gacgccgacatcgagcacgccccaactccatgtgagttcaccccatctttccttctactt300gctaatccagtgtttggtcttggatgtcagtctgatagttctgctcctgctatgagattg360atgaatttgtttgttgcttcacctgtccgttctcccaaaacatgttgaactcggtgctgc420tcgaataaaacttgtagtgttgatttgattccttagtttagggatagctataagggtcac480caccattgacatggtaaattgtaggtcccaaacgacattacattttagttgtgcagggag540ttatataaacttcgaaataattcattctaatattcagtgaaaaggtttagggtgagaaat600actgcaagttttattttagactaaaagagtctaaaataacaatactctctgcatatctcc660ttgaaaagggggctactgcaacgaagaagtattatggaaccataatggtttgttttactc720agttgtttgagtaattgagtttaatttccataaacatccactattatgatgtaaaatatt780tgaagaccggacaggtgaagatgatctttaccagtagaagccaatagaagacttattcag840tttggccttggtaaaatctgaaacctgaaaacttaatgttctgttttcatatatgcagat900ccaacaaatgcttagttattactccgtatggtggaattccatcgcttatcagcctggtaa960aga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