鉴定葡萄白粉病抗性的SCAR标记及其应用的制作方法

本发明属于分子标记辅助育种领域。具体涉及鉴定葡萄白粉病抗性的scar标记及其应用。

背景技术：

葡萄白粉病是一种起源于北美洲的葡萄真菌病害，大多数栽培的欧亚种葡萄品种都容易感染白粉病，最常用的防治白粉病的方法是喷杀菌剂，但经济成本增加，费用几乎占到了葡萄价值的10％，并且对环境不友好。因此从遗传的角度，育种者多年来一直致力于选育抗白粉病的葡萄品种。

圆叶葡萄起源于美洲，对葡萄白粉病表现为免疫或者高抗，研究表明这种抗性是显性单基因遗传的，通过圆叶葡萄与欧亚种葡萄杂交，在后代中能筛选到抗白粉病的植株，如果能使用分子标记在杂交后代植株幼苗期就开展早期筛选和淘汰，可以大量的节省人力物力。

瑞都红玉是由北京市林业果树科学研究院葡萄研究室选育的早熟、红色、玫瑰香型品种。母本为京秀，父本为香妃，平均单粒重5.5g，果皮紫红色，果皮薄，果肉脆硬，属于欧亚种，表现为丰产稳产、不裂果，但对葡萄白粉病表现为高感(张国军，闫爱玲，孙磊等.早熟红色玫瑰香味葡萄新品种‘瑞都红玉的’的选育.果树学报，2016年12期)。

scar标记是在rapd技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域，利用特异性的引物，根据预期条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有特异性、灵敏度高、重现性和稳定性强的特点。

因此，开发出与葡萄白粉病抗性相关的scar标记，有利于抗白粉病葡萄的早期筛选。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是早期如何进行抗白粉病葡萄的筛选，以加快抗白粉病葡萄的选育进程。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于鉴定或辅助鉴定葡萄白粉病抗性的特异引物对。

本发明所提供的特异性引物对所述特异性引物对由seqidno.2所示的单链dna分子和seqidno.3所示的单链dna分子组成。

包含上述特异引物对的试剂盒也在本发明的保护范围之内，所述试剂盒为鉴定或辅助鉴定葡萄白粉病抗性的试剂盒。

本发明所述试剂盒的制备方法，包括将上述引物对的各条引物分别单独包装的步骤。

上述试剂盒还可包括用于pcr扩增的常规试剂等，例如，buffer缓冲液、dntp、taq酶。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种与葡萄白粉病抗性相关的分子标记(即scar标记)。

本发明所提供的分子标记为以葡萄的基因组dna为模板，用上述特异引物对或试剂盒扩增得到的dna片段。

上述分子标记具体为seqidno.1所示的dna分子。

本发明还提供了上述特异引物对或上述试剂盒或上述分子标记的应用。

本发明所提供的上述特异引物对或上述试剂盒或上述分子标记的应用为如下任一种：

1)鉴定或辅助鉴定待测葡萄的白粉病抗性；

2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测葡萄的白粉病抗性的产品；

3)比较或辅助比较待测葡萄的白粉病抗性；

4)制备用于比较或辅助比较待测葡萄的白粉病抗性的产品；

5)葡萄的育种。

为解决上述技术问题，本发明进一步还提供了鉴定或辅助鉴定待测葡萄的白粉病抗性的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测葡萄的白粉病抗性的方法，为如下a1)或a2)所示：

所述a1)包括：以待测葡萄的基因组dna为模板，用上述特异引物对或试剂盒进行pcr扩增，检测pcr扩增结果；

若所述pcr扩增结果是扩增出140-160bp的dna片段且扩增不出其它大小的dna片段，则所述待测葡萄为或候选为抗白粉病的葡萄；若所述pcr扩增结果是扩增不出140-160bp的dna片段且扩增不出其它大小的dna片段，则所述待测葡萄为或候选为感白粉病的葡萄；

所述a2)包括：检测待测葡萄的基因组dna中是否含有上述分子标记；

若待测葡萄的基因组dna中含有上述分子标记，则所述待测葡萄为或候选为抗白粉病的葡萄；若待测葡萄的基因组dna中不含有上述分子标记，则所述待测葡萄为或候选为感白粉病的葡萄。

上述方法中，所述140-160bp的dna片段具体可为150bp的dna片段。

为解决上述技术问题，本发明进一步还提供了比较或辅助比较待测葡萄的白粉病抗性的方法。

本发明所提供的比较或辅助比较待测葡萄的白粉病抗性的方法，为如下b1)或b2)所示：

所述b1)包括：以待测葡萄的基因组dna为模板，用上述特异引物对或试剂盒进行pcr扩增，检测pcr扩增结果；

所述pcr扩增结果是扩增出140-160bp的dna片段且扩增不出其它大小的dna片段的待测葡萄的白粉病抗性高于或候选高于所述pcr扩增结果是扩增不出140-160bp的dna片段且扩增不出其它大小的dna片段的待测葡萄；

所述b2)包括：检测待测葡萄的基因组dna中是否含有上述分子标记；

所述基因组dna中含有上述分子标记的待测葡萄的白粉病抗性高于或候选高于所述基因组dna中不含有上述分子标记的待测葡萄。

上述方法中，所述140-160bp的dna片段具体可为150bp的dna片段。

为解决上述技术问题，本发明进一步还提供了一种葡萄的育种方法。

本发明所提供的葡萄的育种方法，为如下c1)或c2)：

所述c1)包括：按照上述鉴定或辅助鉴定待测葡萄的白粉病抗性，选择所述pcr扩增结果是扩增出140-160bp的dna片段且扩增不出其它大小的dna片段的待测葡萄作为亲本进行育种；

所述c2)包括：按照上述鉴定或辅助鉴定待测葡萄的白粉病抗性，选择所述基因组dna中含有上述分子标记的待测葡萄作为亲本进行育种。

上述方法中，所述140-160bp的dna片段具体可为150bp的dna片段。

本发明中将病情指数0≤si≤25定义为抗白粉病，将病情指数25＜si≤100定义为感白粉病。

本发明中所述待测葡萄可为以抗白粉病的含圆叶葡萄血统的葡萄为亲本杂交得到的后代。在本发明具体的实施方式中，所述待测葡萄可为以抗白粉病的葡萄品种r39做母本，不抗白粉病的品种瑞都红玉为父本，进行杂交得到的后代。

利用本发明提供的scar标记及特异性引物对可直接根据预期dna片段的有无来辅助鉴定或辅助比较待测葡萄的白粉病抗性，与田间鉴定的匹配度达到了100％。将本发明scar标记及特异性引物对应用于葡萄育种，可大大降低表型鉴定的工作量，且在早期(如苗期)就可以辅助鉴定葡萄的白粉病抗性以淘汰非目标植株，简单方便，节约育种成本，可大大提高育种效率，提高品种改良的选择效率，具有重大的应用价值。

附图说明

图1为以亲本及杂交葡萄幼苗的基因组dna为模板进行pcr扩增后的电泳检测结果；其中，m为dnamarker，r39为亲本r39的pcr扩增后的结果，s1-s4为四个阳性杂交葡萄幼苗的pcr扩增后的结果，s5为阴性杂交葡萄幼苗的pcr扩增后的结果，红玉为亲本瑞都红玉的pcr扩增后的结果。

图2为以380个杂交葡萄幼苗基因组dna为模板进行pcr扩增后的电泳检测，96孔板共做了4板(第1板、第2板、第3板和第4板，第4板后四个孔没有上样)，每孔代表一个杂交葡萄幼苗样本的pcr扩增后的结果，共380个样本。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中用到的葡萄品种r39购自北京科博星源科技有限公司。

实施例1与葡萄白粉病抗性相关的scar标记的开发及葡萄白粉病抗性的检测

一、与葡萄白粉病抗性相关的scar标记的开发

本发明发明人经过大量实验，开发了与葡萄白粉病抗性相关的分子标记(即scar标记)，所述分子标记的核苷酸序列如seqidno.1所示。

扩增该分子标记的scar引物序列如下所示：

f引物：5’-cctgaagcggaaattctcag-3’(seqidno.2)

r引物：5’-tgcatggaaatcacaagcatct-3’(seqidno.3)

二、葡萄白粉病抗性的检测

以抗白粉病的具有圆叶葡萄血统的葡萄品种r39做母本，不抗白粉病的葡萄品种瑞都红玉为父本，进行杂交，当年收获种子650粒，冬季沙藏，次年春天播种于塑料穴盘内(播种基质购买自北京绿顺原经济作物有限公司)，播种后获得杂交葡萄幼苗380株，定植于北京市林业果树研究院内。

1、葡萄基因组dna的提取

380株杂交葡萄幼苗的基因组dna的提取采用北京艾德莱生物科技有限公司生产的新型植物基因组dna快速提取试剂盒dn1501。具体步骤如下：

取葡萄幼苗幼嫩叶片组织100mg，约0.5cm²，置于2ml离心管中，液氮充分预冷后，加载到mm400组织研磨仪上破碎研磨成细粉，迅速加入400ul缓冲液ap1和4ulrnasea，旋涡振荡，充分混匀帮助裂解。65℃水浴10分钟，在水浴过程中颠倒离心管2-3次，混合样品。加入130ul缓冲液ap2，充分混匀，冰上放置5分钟，14000rpm离心5-10分钟，小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管。计算上清量，加入1.5倍体积的ap3缓冲液立即吹打混匀得到的混合物加入一个吸附柱ac中，15000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，加入700ul漂洗液wb，12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500ul漂洗液wb，12000rpm离心30秒，弃掉废液。将吸附柱ac放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱放到一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100ul洗脱缓冲液eb，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，获得dna。

通过上述方法，最终获得了380个杂交葡萄幼苗的基因组dna。

取亲本r39和瑞都红玉的叶片，通过上述方法最终获得r39和瑞都红玉的基因组dna。

2、pcr扩增

分别以步骤1提取380个杂交葡萄幼苗及其亲本的基因组dna为模板，利用下述scar引物进行pcr扩增，获得pcr扩增结果，即pcr扩增产物；

其中，反应体系为：总体积20ul，其中2xpcrmix10ul，模板2ul，正反向引物各1ul，超纯水6ul。

扩增程序为94℃预变性5min,30个循环，94℃15sec,60℃30sec,72℃30sec,最后72℃延伸10min。

scar引物：

f引物：5’-cctgaagcggaaattctcag-3’(seqidno.2)

r引物：5’-tgcatggaaatcacaagcatct-3’(seqidno.3)

该引物由上海生工有限公司合成，稀释到储存浓度为10um。

取10ul的pcr扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，经genegreen染色(北京金百特生物科技有限公司，货号e14-500)后于凝胶成像系统判断pcr扩增结果。根据电泳结果进行判断：若所述pcr扩增结果是扩增出140-160bp的dna片段且扩增不出其它大小的dna片段，则所述待测葡萄为或候选为抗白粉病的葡萄；若所述pcr扩增结果是扩增不出140-160bp的dna片段且扩增不出其它大小的dna片段，则所述待测葡萄为或候选为感白粉病的葡萄。

结果如图1和2所示，在380株葡萄幼苗中有221株能扩增出150bp的dna片段且没有扩增出其他大小的dna片段，与抗白粉病的亲本r39的扩增结果一致；其余159株没有扩增出150bp的dna片段且没有扩增出其他大小的dna片段，与不抗白粉病的亲本瑞都红玉的扩增结果一致。因此根据上述判断得到以下结论：380株葡萄幼苗中有221株为抗白粉病的葡萄，而159株为感白粉病的葡萄。

3、葡萄白粉病田间调查与验证

利用田间自然鉴定法，在发病盛期(7～8月)对380株葡萄及亲本r39和瑞都红玉植株叶片进行调查分析。每个植株调查10枚以上叶片。同时根据叶片病斑面积占全叶面积的百分率，将发病叶片分级记录，分级标准如下：

将上述调查结果按下式换成病情指数：

病情指数(si)＝σ(病级代表值×该级病叶数)/(调查总叶数×最高级代表值)×100，根据叶片病情指数，评价对白粉病的抗性程度：免疫(si＝0)；高抗(0.1≤si≤5)；抗病(5＜si≤25)；感病(25＜si≤50)；高感(50＜si≤100)。将病情指数0≤si≤25定义为抗白粉病，将病情指数25＜si≤100定义为感白粉病。

田间调查结果如表1和表2所示：亲本r39的病情指数为0，瑞都红玉的病情指数为52.85。221株扩增出150bp的dna片段且没有扩增出其他大小的dna片段的葡萄植株(即pcr检测阳性的植株)的病情指数均0≤si≤25范围内，全部表现为抗白粉病，检测的准确率达到了100％。对于159株没有扩增出150bp的dna片段且没有扩增出其他大小的dna片段的葡萄植株(即pcr检测阴性的植株)的病情指数均大于25，因此全部表现为感白粉病，检测的准确率达到了100％。

以上结果表明，因此本发明scar标记及引物可以用于白粉病抗性的早期筛选。

表1pcr检测阳性的植株的病情指数结果

注：1-b01对应图中第1板b01孔的样本，2-b01对应图中第2板b01孔的样本，3-d01对应图中第3板d01孔的样本，4-c01对应图中第4板c01孔的样本，其他依次类推。

表2pcr检测阴性的植株的病情指数结果

注：1-a01对应图中第1板a01孔的样本，2-a01对应图中第2板a01孔的样本，3-a01对应图中第3板a01孔的样本，4-a01对应图中第4板a01孔的样本，其他依次类推。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

sequencelisting

<110>北京市林业果树科学研究院

<120>鉴定葡萄白粉病抗性的scar标记及其应用

<130>gncfy200644

<160>3

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cctgaagcggaaattctcagtgtgcttaaacgaagctatgatggattaggtcgtacagaa60

aaaagcatatttcttgatgttgcatgtttttttaaaggtgaagatagagattttgtgtca120

aaaatattagatgcttgtgatttccatgca150

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<212>dna

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tgcatggaaatcacaagcatct22