一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法与流程

本发明属于水稻栽培技术领域，尤其涉及一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法。

背景技术：

杂交水稻为我国及世界粮食安全提供了重要保障。目前生产上主要利用的是三系杂交稻和两系杂交稻。三系杂交稻主要利用细胞核质互作型不育系，该类型不育系育性比较稳定，制种相对安全，但需要对应的保持系繁殖，并且受恢保关系限制，恢复系选育比较困难；两系法杂交稻主要利用光温敏型核不育系，在短日低温条件下，不育系可以自己繁殖，一般正常的材料基本都可以恢复其育性，因此配组相对自由，但两系不育系育性受气温影响较大，制种遇异常低温会导致不育系自交结实，从而影响两系杂交稻种子纯度。

双环磺草酮(bbc)是一种新型的稻田除草剂。作为内吸传导、茎叶喷雾型除草剂，bbc水溶性较低，向下移动性增强，水田外流失减少，对环境的负面影响减轻；其次，bbc具有低毒性、杀草谱宽，药效持久性强的优点，对于防除一年生杂草、多年生杂草以及秋熟杂草具有明显的作用，也可有效防除由畦边延向本田的假稻、难除杂草疣草等。由于bbc对粳稻安全，其使用还只限于日本，韩国及中国北方粳稻区，对于不同籼稻品种，bbc表现出不同的抗感特性，因此在籼稻区还不能大面积推广使用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，包括如下步骤：

(1)利用对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本配成两系杂交稻组合，进行杂交制种；

(2)将所述步骤(1)后获得的杂交种子种植，得到的杂交后代植株用所述除草剂对其进行均匀喷洒，以除去因温度不稳定(低温)导致母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。

本发明针对两系法杂交稻制种安全需要以及bbc对籼稻品种不同的抗感特性，提出利用对bbc敏感的两系不育系和对bbc具有抗性的两系恢复系配组，通过常规方法制种，获得杂交种子。由于制种过程中可能会遇到低温天气，导致两系不育系自交结实，从而使杂交种子中混杂了母本自身种子，从而影响杂交稻制种的质量。故而在生产上，在杂交种子幼苗期喷施bbc，不育系自交结实种子由于不具有bbc抗性，会白化死亡，而真正的杂交种子不会受到影响，从而有效提高了杂交制种的纯度。

上述的方法，优选的，所述步骤(1)中，对所述除草剂敏感的两系不育系母本包括安农s-1、标810s、kt27s、华1037s、湘陵628s、准s、龙s、奥龙1s、雁农s、锦4128s、360s、华煜4127s、z9s、h175s、885s和明s中的任意一种或几种。

优选的，所述步骤(1)中，对所述除草剂具有抗性的两系恢复系父本包括玉香油占、r402、p143、粤禾丝苗、中早22、r534、华占和中嘉早32中的任意一种或几种。

优选的，所述步骤(1)中，两系杂交稻组合包括：由准s母本与玉香油占父本组成的准两优香油占组合、由准s母本与r402父本组成的准两优402组合、由明s母本与p143父本组成的明两优143组合、由龙s母本与粤禾丝苗父本组成的龙两优粤禾丝苗组合、由锦4128s母本与中早22父本组成的锦两优22组合、由锦4128s母本与r534父本组成的锦两优534组合、由锦4128s母本与华占父本组成的锦两优华占组合、由华煜4127s母本与中早22父本组成的煜两优22组合或由湘陵628s母本与中嘉早32父本组成的陵两优32组合。以上两系杂交稻组合同时满足母本感、父本抗的要求，且这些组合经过审定能够直接在生产上应用，有较大实际价值。

优选的，所述步骤(1)中，对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本通过以下方法筛选得到：利用所述除草剂对两系不育系母本和两系恢复系父本进行喷施鉴定，筛选出对该除草剂敏感的母本和对该除草剂具有抗性的父本。

水稻his1基因(loc_os02g17940)是近期克隆的对bbc类除草剂具有广谱抗性的水稻内源性基因。经过系统分析，我们发现水稻his1基因第四外显子第831-858位碱基处存在的28bp片段缺失变异会影响his1基因抗除草剂功能。水稻his1基因的bbc类除草剂抗性表型为显性，his1基因28bp片段缺失变异的显隐性类型为隐性，含有隐性纯合子his1基因的水稻对bbc类除草剂抗性丧失，且只存在于部分籼稻品种中，而含有显性纯合子或杂合子his1基因的水稻对bbc类除草剂具有抗性。因此，利用his1基因在第四外显子的28bp片段缺失变异导致bbc类除草剂抗性丧失这一特点设计特异性分子引物，用于鉴定水稻品种中his1基因是否存在上述28bp片段缺失变异，进而可以判断该水稻his1基因是否存在bbc类除草剂抗性。进一步的，在两系杂交稻制种过程中利用bbc类除草剂进行针对性筛选除杂，能够明显提高水稻杂交制种的纯度，以及缓解两系不育系制种过程中“打摆子”的问题，对培育创新种质资源以及解放劳动力具有意义。

因此，本发明还提供另外一种筛选对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本的方法：采用ctab法提取待测水稻叶片的dna样本，以该dna样本为模板，用特异的分子标记物进行pcr扩增，取得到的扩增产物进行电泳，读取其片段大小；若扩增出的产物片段为单一的一条182bp条带，表示该水稻his1基因为隐性纯合子，则鉴定该水稻his1基因不存在bbc类除草剂抗性；若扩增出的产物片段为一条单一的210bp条带，表示该水稻his1基因为显性纯合子，则鉴定该水稻his1基因存在bbc类除草剂抗性；若扩增出的产物片段包含一条182bp条带和一条210bp条带，表示该水稻his1基因为杂合子，则鉴定该水稻his1基因存在bbc类除草剂抗性；

所述特异的分子标记物包括以下序列的上游引物和下游引物：

上游引物：5-’gtacaacttgacgatgtatcaag-’3(如seq.idno.1所示)；

下游引物：5-’gttgaatcttgcaaatgcaggagc-’3(如seq.idno.2所示)。

更优选的，用所述特异的分子标记物进行pcr扩增的具体操作包括如下步骤：将所述特异的分子标记物稀释为10mm，配置pcr反应体系：20μlpcr反应体系包含50ng/μl基因组dna2μl，5μm/ml前后引物各1μl，1.1×pcrmix16μl；pcr反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。

优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中，除草剂为双环磺草酮除草剂。

更优选的，所述双环磺草酮除草剂的施用方法为：将所述双环磺草酮除草剂的浓度稀释为0.4μm-4μm后对目标植株进行喷洒。

更优选的，其特征在于，所述除草剂的施用时期为水稻幼苗3叶期。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，在两系杂交稻制种过程中可很好地解决“打摆子”现象，大大提高制种纯度，快速、准确、高效的获得真杂交种后代，筛选的效率可达到100％，操作简单，大大解放了劳动力，在杂交水稻种子纯度提升以及种质资源创新上都具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中利用双环磺草酮除草剂对水稻材料筛选的作用效果图；

图2是实施例1中两系杂交稻母本、父本及其杂交种喷施bbc除草剂后的效果图(由左至右依次为明s，p143，明两优143)；

图3是实施例2中两系杂交稻父本中早22(左)及其杂交种陵两优22(中)、母本湘陵628s(右)经喷施双环磺草酮除草剂后的效果对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，包括如下步骤：

(1)从我国各水稻种植区域，搜集了600份水稻材料，其中包括两系不育系90份，包含两系恢复系的正常水稻材料510份，在以上600份水稻材料苗期3叶期喷施双环磺草酮除草剂(bbc，有效成分浓度稀释为0.75μm)，双环磺草酮除草剂(bbc)对水稻材料筛选的作用效果如图1所示，双环磺草酮除草剂(bbc)不具抗性的水稻材料叶片枯黄，甚至死亡，而对双环磺草酮除草剂(bbc)具有抗性的水稻材料生长健康；在90份两系不育系中筛选到16份材料对bbc敏感，包括安农s-1，标810s，kt27s，华1037s，湘陵628s，准s，龙s，奥龙1s，雁农s，锦4128s，360s，华煜4127s，z9s，h175s，885s，明s；在510份包含两系恢复系的正常水稻材料中，筛选到344份材料对bbc表现抗性；在这两种类型材料中，已经配组出两系杂交稻品种组合方案的有9种，如表1所示，母本不抗bbc，父本抗bbc，其中父本、母本的his1基因均为纯合子；

(2)将步骤(1)筛选出的两系杂交稻品种组合进行杂交，得到的杂交种子种植，得到的杂交后代在苗期3叶期用双环磺草酮除草剂(bbc)对其进行均匀喷洒，以除去因温度不稳定导致母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。

表1：符合筛选条件的两系杂交稻组合

本发明对上述两系杂交稻品种组合的真杂种后代及其母本、父本进行喷施双环磺草酮除草剂实验(有效成分浓度稀释为0.75μm)，图2中从左至右依次是两系杂交稻父本p143及其杂交种明两优143、母本明s经喷施双环磺草酮除草剂后的效果对比图。由图2可知，母本明s对双环磺草酮除草剂不具抗性，叶片枯黄，而父本p143及其杂交种明两优143对双环磺草酮除草剂具有抗性，植株生长健康。其他8种两系杂交稻品种组合方案的效果与图2一致，均表现为母本对bbc类除草剂不具抗性，叶片枯黄，而父本及其真杂交种对bbc类除草剂具有抗性，植株生长健康。结果证明母本死亡，杂交种及父本存活，筛选的效率可达到100％，效果比较明显，因此能够达到提高杂交稻种子纯度的目的。

实施例2：

一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，包括如下步骤：

(1)采用分子标记法筛选对双环磺草酮除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本，具体包括如下步骤：

s1、采用ctab法，对水稻新鲜幼嫩叶片提取dna样本：取适量新鲜水稻叶片装入2ml离心管中并加入钢珠，于液氮中速冻，放入高通量组织研磨器(宁波新芝scientz-48)破碎组织，立即加入65℃预热的2×ctab溶液650μl，置于65℃水浴锅中恒温45min，每10min上下均匀颠倒一次，45min结束并待dna样品冷却到室温后置于通风橱中加入650μl氯仿﹕异丙醇(24﹕1)的溶液，上下颠倒混匀，12000rmp离心10min，将500μl上清液转移到1.5ml的离心管中，加入500μl异丙醇溶液混匀并于-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min，弃上清，加入1ml70％乙醇溶液洗除杂质，12000rmp离心5min后倒出上清，加入200μlddh2o于4℃冰箱中过夜溶解，得到提取的水稻样品dna模板；

s2、将合成的特异的分子标记物(包括上游引物和下游引物)稀释为10mm；配置pcr反应体系：20μlpcr反应体系包含基因组dna2μl(50ng/μl)，前后引物各1μl(5μm/ml)，1.1×pcrmix(擎科生物技术有限公司)16μl。pcr反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min；其中，

上游引物：5-’gtacaacttgacgatgtatcaag-’3(如seq.idno.1所示)；

下游引物：5-’gttgaatcttgcaaatgcaggagc-’3(如seq.idno.2所示)；

s3、将得到的扩增产物在3％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，读取扩增出的产物片段大小；若扩增出的产物片段为单一的一条182bp条带，表示该水稻his1基因为隐性纯合子，则鉴定该水稻his1基因不存在bbc类除草剂抗性；若扩增出的产物片段为一条单一的210bp条带，表示该水稻his1基因为显性纯合子，则鉴定该水稻his1基因存在bbc类除草剂抗性；若扩增出的产物片段包含一条182bp条带和一条210bp条带，表示该水稻his1基因为杂合子，则鉴定该水稻his1基因存在bbc类除草剂抗性；筛选出杂交稻品种组合：母本湘陵628s不存在bbc类除草剂抗性，父本中早22存在bbc类除草剂抗性；

(2)将步骤(1)筛选出的两系杂交稻品种组合进行杂交，得到的杂交种子种植，得到的杂交后代在苗期3叶期用双环磺草酮除草剂(bbc)对其进行均匀喷洒，以除去因温度不稳定导致母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。

图3从左至右依次是两系杂交稻父本中早22及其杂交种陵两优22、母本湘陵628s经喷施双环磺草酮除草剂后的效果对比图。由图3可知，母本湘陵628s对双环磺草酮除草剂不具抗性，叶片枯黄，而父本中早22及其杂交种陵两优22对双环磺草酮除草剂具有抗性，植株生长健康。其他8种两系杂交稻品种组合方案的效果与图3一致，均表现为母本对bbc类除草剂不具抗性，叶片枯黄，而父本及其真杂交种对bbc类除草剂具有抗性，植株生长健康。结果证明母本死亡，杂交种及父本存活，筛选的效率可达到100％，效果比较明显，因此能够达到提高杂交稻种子纯度的目的。

序列表

<110>湖南杂交水稻研究中心

<120>一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtacaacttgacgatgtatcaag23

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gttgaatcttgcaaatgcaggagc24