本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及重组lc3c蛋白在提高绵羊体外胚胎囊胚率的应用方法，主要是将重组lc3c蛋白运用到绵羊卵母细胞中进行处理，进一步证明重组lc3c蛋白在促进绵羊体外胚胎囊胚发育率上有新的用途。
背景技术：
：在酵母中，自噬发生，细胞识别，细胞吞噬和囊泡闭合等过程都是atg8依赖性的。而在高级真核生物中，atg8已进化为lc3/gabarap蛋白家族。其中微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associatedprotein1lighechain3，lc3）包括4个家组蛋白，分别是lc3a（2个剪接变体，lc3a-a和lc3a-b），lc3b和lc3c。而lc3b是研究最多的家族蛋白，与自噬体的发育和成熟有关，可用于监测自噬活性。在消除胞内病原体时，lc3c（map1lc3c）必需与自噬受体ndp52/calcoco2优先发生牢固结合，进一步导致细菌吞噬自噬体，从而参与自噬进程的异体自噬过程。但目前还没有将lc3c用于绵羊体外胚胎的研究报道。技术实现要素：本发明的目的在于：在对绵羊卵母细胞体外成熟培养过程中，利用重组lc3c蛋白对绵羊卵母细胞进行处理，发现重组lc3c蛋白能显著提高绵羊体外胚胎囊胚率，从而证明重组lc3c蛋白的新的用途。实现本发明的目的技术方案如下：重组lc3c蛋白在提高绵羊体外胚胎囊胚率的应用方法，该应用方法包括步骤如下：（1）获取当日宰杀绵羊的卵巢，置入温度在30-35℃，含1000iu/ml青霉素和1000iu/ml链霉素的生理盐水中，3-5小时内带回实验室，用生理盐水清洗3-4次；（2）用吸有2ml抽卵液的注射器抽吸卵巢表面2-5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，加入到添加了重组lc3c蛋白的体外成熟液中，在条件为5%co2，95%空气，温度为38.6℃的co2培养箱内培养22-24小时；（3）将步骤（2）中得到的卵母细胞，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；（4）将解冻后的冻精，加入装有体外受精液的试管底部，co2培养箱中上游20-25分钟，取上层精子混悬液，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟，然后弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×106个/ml的密度加入步骤（3）的体外受精液滴中与卵母细胞共同孵育；（5）将步骤（4）中受精20-22小时的早期胚胎取出，在体外培养液ivc内洗涤3-4次，并在体外培养液中培养24-26小时，将未卵裂的卵母细胞挑出，统计卵裂率，继续培养144-168小时后统计囊胚率。进一步设计，其中重组lc3c蛋白的制备如下：将已构建好的含有lc3c蛋白基因map1lc3c的重组质粒pet28a-map1lc30c转化escherichiacolibl21；转化菌在0.2mmiptg诱导下表达融合蛋白；经sds-page分析表明重组蛋白lc3c在escherichiacolibl21中以包涵体形式高效表达；菌体超声裂解的沉淀经2%tritonx-100、0.2%脱氧胆酸和2m尿素洗涤后，溶解于8m脲中经ni-nta亲和层析纯化后，洗脱缓冲液超滤后替换成tge缓冲液洗脱并保存，其中，所述tge缓冲液配比为50mmtris-hcl、0.5mmedta、50mmnacl以及5%甘油，并调整ph值为8.0；最后纯化后的his-lc3c经过sds-page鉴定为重组lc3c蛋白。进一步优选设计所述的重组lc3c蛋白的浓度为80ng/ml。有益效果：通过在绵羊体外成熟培养液中添加一定量的重组lc3c蛋白，能显著提高绵羊体外胚胎的囊胚率。属于重组lc3c蛋白的新用途发明。具体实施方式实施例1、一种利用重组lc3c蛋白提高绵羊体外胚胎囊胚率的方法，该方法步骤如下：（1）获取当日宰杀绵羊的卵巢，置入温度在30-35℃，含1000iu/ml青霉素和1000iu/ml链霉素的生理盐水中，3-5小时内带回实验室，用生理盐水清洗3-4次；（2）用吸有2ml抽卵液的注射器抽吸卵巢表面2-5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，加入到添加了重组lc3c蛋白的体外成熟液中，在条件为5%co2，95%空气，温度为38.6℃的co2培养箱内培养22-24小时；（3）将步骤（2）中得到的卵母细胞，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；（4）将解冻后的冻精，加入装有体外受精液的试管底部，co2培养箱中上游20-25分钟，取上层精子混悬液，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟，然后弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×106个/ml的密度加入步骤（3）的体外受精液滴中与卵母细胞共同孵育；（5）将步骤（4）中受精20-22小时的早期胚胎取出，在体外培养液ivc内洗涤3-4次，并在体外培养液中培养24-26小时，将未卵裂的卵母细胞挑出，统计卵裂率，继续培养144-168小时后统计囊胚率；其中重组lc3c蛋白的制备：将已构建好的含有lc3c蛋白基因map1lc3c（genbankno.xm012187218）的重组质粒pet28a-map1lc30c转化escherichiacolibl21（de3）。转化菌在0.2mmiptg诱导下表达融合蛋白。经sds-page分析表明重组蛋白lc3c在escherichiacolibl21（de3）中以包涵体形式高效表达。菌体超声裂解的沉淀经2%tritonx-100、0.2%脱氧胆酸和2m尿素洗涤后，溶解于8m脲中经ni-nta亲和层析纯化后，洗脱缓冲液超滤后替换成tge缓冲液（50mmtris-hcl，0.5mmedta，50mmnacl，5%甘油，ph8.0）保存。纯化后的his-lc3c经过sds-page鉴定。用于提高绵羊胚胎发育潜能分析测定的重组lc3c蛋白浓度初始浓度为80ng/ml。其中实验液体的配置：抽卵液：tcm199-hepes+1mg/mlpva+0.7mg/ml肝素钠；体外成熟液（ivm）：tcm199-hco3+10%fbs+0.05iu/mlfsh+0.05iu/mllh+1μg/ml雌二醇＋24.2μg/ml丙酮酸钠+100iu/ml青霉素+100iu/ml链霉素；体外受精液（ivf）：sof+20%fbs+6iu/ml肝素钠+100iu/ml庆大霉素；体外培养液（ivc）：sof+3mg/mlbsa；其中所述合成输卵管液（sof）：6.29mg/mlnacl+0.534mg/mlkcl+0.162mg/mlkh2po4+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/mlmgso4+2.1mg/mlnahco3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlcacl2·2h2o。实验结果及数据验证：用一组数据验证添加重组lc3c蛋白（初始浓度为80ng/ml）的有效性。表1组别卵母细胞数（枚）卵裂率（%）囊胚率（%）对照组22182.13±5.18a44.82±2.36a重组lc3c21485.93±5.82.a56.35±2.79b注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。囊胚率（%）=卵裂数/卵母细胞数。结论：上表结果表明：在绵羊卵母细胞体外成熟液中添加80ng/ml重组lc3c蛋白能显著提高绵羊体外胚胎的囊胚率。当前第1页12