一组新型的FN3类抗体突变体及其应用的制作方法

本发明是关于一个或多个新型fn3支架类抗体及其在试剂检测及医药上的应用。涉及生物蛋白及生物技术的领域。
背景技术：
：fn3支架类抗体是基于人源ⅲ型第十纤连蛋白结构域的类抗体，只有10kda，分子量小，渗透性好，结构稳定。由高度稳定的β折叠区和三个环状可变区构成。类抗体支架蛋白的应用前景广阔，既可以在基础研究中发挥重大作用，又能应用于临床诊断与治疗。与传统的抗体药物相比，它具有很多明显的优势，包括低成本、胞内高稳定性、弱免疫效应以及口服易吸收等重要性质，已成为药物研发的热点领域之一。ha4类抗体是johnwojcik等通过噬菌体展示技术发现的一个fn3支架类抗体，它可以特异性的与人abl1蛋白的sh2亚基结合。(johnwojciketal.apotentandhighlyspecificfn3monobodyinhibitoroftheablsh2domainnaturestructural&molecularbiology.17，519-527(2010))费城染色体(philadelphiachromosome,ph(orph')chromosome)，或称费城染色体易位(philadelphiatranslocation)，是一种与慢性粒细胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia,cml)相关的特殊染色体易位现象。其中细胞的9号染色体长臂与22号染色体长臂进行相互易位，具体定义为t(9；22)(q34；q11)。这一染色体易位现象与慢性粒细胞性白血病有高度的灵敏度，有95％的慢性粒细胞性白血病患者被检测有此染色体易位(剩余的人群则是或存在一种g显带染色体制备过程中的隐形易位，或是存在其他多变的染色体易位情况)。染色体易位是费城染色体中染色体缺失的主要原因。在九号染色体中长链的abl1基因(位置q34)与二十二号染色体上长链的bcr基因(位置q11)发生并列性易位而产生一种新的融合基因(fusiongene)。根据国际人类细胞遗传学术语命名法(英语：internationalsystemforhumancytogeneticnomenclature)，这种染色体易位被称为“t(9；22)(q34；q11)”。这种易位产生了一种致癌的bcr-abl1融合基因，位于因此变短的22号染色体的长链上。此基因产生出一种bcr-abl1融合蛋白。因为该融合基因的分子重量为185至210kda，其也被称为p185或p210。abl1是一种酪氨酸激酶；在正常细胞中，它在细胞分化和细胞周期调控方面发挥重要作用。bcr-abl1融合基因会导致酪氨酸激酶的组成性激活，从而导致不受控制的细胞增殖，从而产生癌变。johnwojcik等试验证实：在细胞内的ha4类抗体通过与abl1的sh2亚基结合从而可以抑制abl1的磷酸化过程，并抑制stat5的活性，抑制酪氨酸激酶的组成性激活。这表明获得ha4抗体有可能成为抗癌候选药物，或用于bcr-abl1导致的癌症的机理的研究等等。在前人研究的基础上，我们经过不懈的科学研究和实验，用生物技术的方法筛选到ha4的突变体，分别命名为kjdl2、kjdl7、kjdl9(以下文中以kjdl指代所有的突变体)，新的突变体与abl1蛋白有更好的亲和力，成为更好的抗癌药物或者检测试剂盒的候选。同时我们的研究也发现，a85e和y87m是影响亲和力的两个关键性的氨基酸突变，当ha4的氨基酸序列上发生a85e和y87m的突变后，再与其他位点的突变组合产生的新的类抗体与abl1蛋白的亲和力均有提高。技术实现要素：本发明的目的是提供一个或者多个突变位点和突变后的氨基酸。包括上述突变的类抗体体与abl1蛋白有更强的亲和力，可成为抗癌药物的候选药物或者应用于其他医药等领域。本发明的另一目的是提供一个在氨基酸序列位点85上发生从a到e的突变和在氨基酸序列位点87上发生从y到m的突变，突变前的氨基酸序列如seqidno：2所述。包括上述突变的类抗体与abl1蛋白有更强的亲和力，可成为抗癌药物的候选药物或者应用于其他医药等领域。优选地，所述抗体的氨基酸序列如序列表中seqidno：4所示。本发明的另一目的是提供一个在氨基酸序列位点56上发生从p到l的突变、在氨基酸序列位点85上发生从a到e的突变、和在氨基酸序列位点87上发生从y到m的突变，突变前的氨基酸序列如seqidno：2所述。包括上述突变的类抗体与abl1蛋白有更强的亲和力，可成为抗癌药物的候选药物或者应用于其他医药等等领域。优选地，所述抗体的氨基酸序列如序列表中seqidno：8所示。本发明的另一目的是提供一个在氨基酸序列位点35上发生从y到s的突变、在氨基酸序列位点56上发生从p到l的突变、在氨基酸序列位点85上发生从a到e的突变、和在氨基酸序列位点87上发生从y到m的突变，突变前的氨基酸序列如seqidno：2所述。包括上述突变的类抗体与abl1蛋白有更强的亲和力，可成为抗癌药物的候选药物或者应用于其他医药等等领域。优选地，所述抗体的氨基酸序列如序列表中seqidno：6所示。本发明的另一目的是提供一个人源的fn3类抗体突变体，由高度稳定的β折叠区和三个环状可变区组成，该环状可变区包括bcloop、deloop、和fgloop。所述bcloop的氨基酸序列为序列表中seqidno：9的第28-35位氨基酸，其中，x1选自y和s中的任一个；所述deloop的氨基酸序列为序列表中seqidno：9的第57-60位氨基酸；所述fgloop的氨基酸序列为序列表中seqidno：9的第90-102位氨基酸。上述突变的类抗体与abl1蛋白有更强的亲和力，可成为抗癌药物的候选药物或者应用于其他医药等等领域。本发明的另一目的是提供一个人源的fn3类抗体突变体，由高度稳定的β折叠区和三个环状可变区组成，该环状可变区包括bcloop、deloop、和fgloop。所述bcloop的氨基酸序列为序列表中seqidno：10的第28-35位氨基酸，其中，x1选自y和s中的任一个；所述deloop的氨基酸序列为序列表中seqidno：10的第57-60位氨基酸；所述fgloop的氨基酸序列为序列表中seqidno：10的第90-102位氨基酸。上述突变的类抗体与abl1蛋白有更强的亲和力，可成为抗癌药物的候选药物或者应用于其他医药等等领域。本发明的另一目的是提供一个人源的fn3类抗体突变体的氨基酸序列，氨基酸序列如seqidno：4所述。此类抗体与abl1蛋白有更强的亲和力，可成为抗癌药物的候选药物或者应用于其他医药等领域。本发明的另一目的是提供一个人源的fn3类抗体突变体的氨基酸序列，氨基酸序列如seqidno：6所述。此类抗体与abl1蛋白有更强的亲和力，可成为抗癌药物的候选药物或者应用于其他医药等领域。本发明的另一目的是提供一个人源的fn3类抗体突变体的氨基酸序列，氨基酸序列如seqidno：8所述。此类抗体与abl1蛋白有更强的亲和力，可成为抗癌药物的候选药物或者应用于其他医药等领域。本发明的另一目的是提供一个人源的fn3类抗体突变体的制备方法，所述抗体可以人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到包含所述fn3类抗体突变体的细胞，培养所述的细胞，得到所述的fn3类抗体突变体。所述的细胞可为微生物细胞，如大肠杆菌，具体可为大肠杆菌bl21。本发明的另一目的是提供一个用于测试abl1蛋白或abl1蛋白的sh2亚基或abl1融合蛋白的sh2亚基的试剂盒，该试剂盒的组成包含含有上述任一突变组合的类抗体。本发明的另一目的是提供一个用于测试abl1蛋白或abl1蛋白的sh2亚基或abl1融合蛋白的sh2亚基的试剂盒，该试剂盒的组成包含从seqidno：4、seqidno：6、seqidno：8、seqidno：9和seqidno：10中选择的任一的氨基酸，其中：seqidno：9或者seqidno:10中的x1选自y和s中的任一个。本发明的另一目的是提供一个检测abl1蛋白或者其他类型的abl1融合蛋白的方法，包括以下步骤：(具体的步骤可参考实施例5)1)将abl1蛋白或者其他类型的abl1融合蛋白包被放在酶标板上，并用封闭液封闭；2)加入任一上述kjdl类抗体；3)加入酶标二抗；4)加入显色液显色10分钟后加入等体积终止液，将酶标板放入酶标仪在450nm读取吸光值。本发明的另一目的是提供上述突变位点，突变氨基酸，或者他们的组合在制备抗癌药物中或者其他医药领域的应用。本发明的另一目的是提供上述突变位点，突变氨基酸，或者他们的组合在制备试剂盒的应用。本发明的另一目的是提供上述突变位点，突变氨基酸，或者他们的组合在检测abl1蛋白或者其他类型的abl1融合蛋白的应用。本发明的另一目的是提供上述任一类抗体的氨基酸序列在制备抗癌药物中或者其他医药领域的应用。本发明的另一目的是提供上述任一类抗体的氨基酸序列在制备试剂盒的应用。本发明的另一目的是提供上述任一类抗体的氨基酸序列在检测abl1蛋白或者其他类型的abl1融合蛋白的应用。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为ha4的表达载体图；图2为kjdl突变体的通用表达载体图；图3为电泳结果图；目的蛋白大小为14.6kda，观察电泳图中条带大小与蛋白分子量标准比较，大小合适，且纯度约为70％左右。其中:1为ha4类抗体的200mm咪唑洗脱峰；3为kjdl7类抗体的200mm咪唑洗脱峰；5为kjdl9类抗体的200mm咪唑洗脱峰；8为kjdl2类抗体的200mm咪唑洗脱峰；图4为kjdl突变体与ha4的氨基酸序列对比图；图5为kjdl7突变体的biacore亲和力曲线；图6为ha4亲和力的曲线图；图7为kjdl2亲和力曲线图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不会限定本发明。下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所有实施例中使用的工程菌株均为大肠杆菌bl21。lb培养基成分为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l。实施例1:ha4蛋白与abl1蛋白的亲和力的测试。1.1构建及表达ha4载体。设计引物(引物序列见表1)扩增ha4编码基因(基因序列见seqidno：1)后，酶切，通过酶切及t4连接的办法将基因编码序列构建到蛋白表达载体pet28a上，如附图1所示，将ha4抗体的基因序列连接到表达载体pet28a上，然后摇菌诱导蛋白表达，将含有表达载体的工程菌株培养表达重组蛋白。1.2培养表达重组蛋白。具体的步骤为将步骤1.1得到的工程菌株于lb液体培养基中37℃振荡过夜培养后，以1:100接种量接种至含1l的lb培养基的摇瓶中，37℃培养2h，加入终浓度为1mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，并降温至16℃过夜培养。8000r/min离心10min收集菌体，用破菌液(20mmpb，150mmnacl，ph8.0)重悬后进行超声破碎，破碎溶液12000r/min离心30min留取上清液，进行下一步的纯化工作。1.3纯化重组蛋白。由于步骤1.2中得到的重组蛋白后端序列中含his融合蛋白，可用his亲和层析柱对其进行纯化。亲和层析所用缓冲液为20mmpb，150mmnacl，ph＝7.5，洗脱所用缓冲液为20mmpb，150mmnacl，500mm咪唑，ph＝7.5。收集洗脱各部分，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测目的蛋白表达情况。(结果中可以显示层析图谱：如附图3所示)目的蛋白大小为14.6kda，观察电泳图中条带大小与蛋白分子量标准比较，选择大小合适的目的蛋白进入下一步。1.4对步骤1.3得到的纯化后的蛋白用biacore仪器进行亲和力的测试。试验方案：所用的仪器biacoret200，生产厂家是ge公司。实验芯片：cm5购于ge公司，货号为br-1005-30。靶点蛋白捕捉试剂盒：gstcapturekit，购于ge公司，货号为br-1002-23。靶点蛋白：c-abl/abl1protein,human,recombinant(gsttag)购于义翘神州，货号：11199-h09b，靶点蛋白sh2是abl1蛋白的一个亚基，是与ha4结合的亚基。按照仪器操作指南，试剂盒实验方案进进行试验，获得以下试验结果：具体的试验步骤分为以下几步：a)开机：设定反应温度为25℃，等待30min，待面板上的黄色指示灯停止闪烁，表明温度已经达到预设温度，可以开始试验。b)打开控制软件，准备缓冲液，量取50ml10ⅹhbs-ep+buffer、450ml去离子水(已经0.22μm滤膜过滤)，混匀后放入500ml缓冲液瓶。c)放入cm5芯片。按照gstcapturekit说明书将anti-gst抗体固定到芯片上，并进行封闭，然后利用anti-gst抗体的捕捉abl1重组蛋白(gsttag)，然后用试剂和中的重组gst蛋白封闭没有用到的anti-gst抗体表位。d)将待测抗体ha4蛋白上样，测定亲和力。e)利用软件拟合亲和力曲线，得到动力学数据ka、kd，亲和力数据kd。因为ha4与abl1的亲和力是与其他样品与abl1的亲和力的比较的基础参考值，所以分别测量了两次，亲和力数值见表2的a和b。实施例2：kjdl7样品与abl1蛋白的亲和力的测试。2.1构建及表达kjdl7的载体。设计引物(引物序列见表1)扩增kjdl7编码基因(基因序列见seqidno：3)后，酶切，通过酶切及t4连接的办法将基因编码序列构建到蛋白表达载体pet28a上，如附图2所示，将kjdl7抗体的基因序列连接到表达载体pet28a上，然后摇菌诱导蛋白表达，将含有表达载体的工程菌株培养表达重组蛋白。2.2培养表达重组蛋白。具体的步骤为将步骤2.1得到的工程菌株于lb液体培养基中37℃振荡过夜培养后，以1:100接种量接种至含1l的lb培养基的摇瓶中，37℃培养2h，加入终浓度为1mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，并降温至16℃过夜培养。8000r/min离心10min收集菌体，用破菌液(20mmpb，150mmnacl，ph8.0)重悬后进行超声破碎，破碎溶液12000r/min离心30min留取上清液，进行下一步的纯化工作。2.3纯化重组蛋白。由于步骤2.2中得到的重组蛋白后端序列中含his融合蛋白，可用his亲和层析柱对其进行纯化。亲和层析所用缓冲液为20mmpb，150mmnacl，ph＝7.5，洗脱所用缓冲液为20mmpb，150mmnacl，500mm咪唑，ph＝7.5。收集洗脱各部分，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测目的蛋白表达情况。(结果中可以显示层析图谱：如附图3所示)目的蛋白大小为14.6kda，观察电泳图中条带大小与蛋白分子量标准比较，选择大小合适的目的蛋白进入下一步。2.4对步骤2.3得到的纯化后的蛋白用biacore仪器进行亲和力的测试。试验方案：所用的仪器biacoret200，生产厂家为ge公司。实验芯片：cm5购于ge公司，货号为br-1005-30。靶点蛋白捕捉试剂盒：gstcapturekit，购于ge公司，货号为br-1002-23。靶点蛋白：c-abl/abl1protein,human,recombinant(gsttag)购于义翘神州，货号：11199-h09b，靶点蛋白sh2是abl1蛋白的一个亚基，是与kjdl7结合的亚基。按照仪器操作指南，试剂盒实验方案进进行试验，获得以下试验结果：具体的试验步骤分为以下几步：a)开机：设定反应温度为25℃，等待30min，待面板上的黄色指示灯停止闪烁，表明温度已经达到预设温度，可以开始试验。b)打开控制软件，准备缓冲液，量取50ml10ⅹhbs-ep+buffer、450ml去离子水(已经0.22μm滤膜过滤)，混匀后放入500ml缓冲液瓶。c)放入cm5芯片。按照gstcapturekit说明书将anti-gst抗体固定到芯片上，并进行封闭，然后利用anti-gst抗体的捕捉abl1重组蛋白(gsttag)，然后用试剂和中的重组gst蛋白封闭没有用到的anti-gst抗体表位。d)将待测抗体kjdl7蛋白上样，测定亲和力。e)利用软件拟合亲和力曲线，得到动力学数据ka、kd，亲和力数据kd。亲和力数值见表2。2.5kjdl7与abl1蛋白的亲和力与原ha4与abl1蛋白的亲和力的比较。如表2-a所示，测量ha4的亲和力常数kd为2.73e-08，而kjdl7突变体的亲和力常数kd为1.43e-08，明显低于ha4，亲和力常数越低，亲和力越高，表明关键位点的氨基酸突变后，亲和力明显提高。kjdl7和ha4拟合的亲和力曲线分别如附图5和附图6所示，0秒和180秒出曲线分别有一个陡然的增高和降低，是由于系统缓冲液与待测抗体蛋白的缓冲液不一致造成的，这个陡然的增高和降低不影响亲和力的测定，可以被忽略。两个亲和力曲线上升阶段kjdl7的弧度更大一些，ha4更直一些，kjdl7的斜率更大，斜率代表了结合常数ka。同时在表2-a中结合常数ka也是kjdl7>ha4，表明经过关键位点的氨基酸突变后，结合速度得到明显提高。下降阶段的斜率样品kjdl7的斜率小于ha4，下降的斜率代表了解离常数kd。同时在表2-a中解离常数kd也是kjdl7<ha4，表明与ha4相比kjdl7的解离速度变的更慢，表明该突变体一旦结合到abl1蛋白，更不容易解离下来。以上数据证实经过关键氨基酸位点突变后，kjdl7与ha4相比结合速度更快，且解离速度更慢，亲和力高于ha4。实施例3：kjdl9样品与abl1蛋白的亲和力的测试3.1构建及表达kjdl9的载体。设计引物(引物序列见表1)扩增kjdl9编码基因(基因序列见seqidno：5)后，酶切，通过酶切及t4连接的办法将基因编码序列构建到蛋白表达载体pet28a上，如附图2所示，将kjdl9抗体的基因序列连接到表达载体pet28a上，然后摇菌诱导蛋白表达，将含有表达载体的工程菌株培养表达重组蛋白。3.2培养表达重组蛋白。具体的步骤为将步骤3.1得到的工程菌株于lb液体培养基中37℃振荡过夜培养后，以1:100接种量接种至含1l的lb培养基的摇瓶中，37℃培养2h，加入终浓度为1mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，并降温至16℃过夜培养。8000r/min离心10min收集菌体，用破菌液(20mmpb，150mmnacl，ph8.0)重悬后进行超声破碎，破碎溶液12000r/min离心30min留取上清液，进行下一步的纯化工作。3.3纯化重组蛋白。由于步骤3.2中得到的重组蛋白后端序列中含his融合蛋白，可用his亲和层析柱对其进行纯化。亲和层析所用缓冲液为20mmpb，150mmnacl，ph＝7.5，洗脱所用缓冲液为20mmpb，150mmnacl，500mm咪唑，ph＝7.5。收集洗脱各部分，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测目的蛋白表达情况。(结果中可以显示层析图谱：如附图3所示)目的蛋白大小为14.6kda，观察电泳图中条带大小与蛋白分子量标准比较，选择大小合适的目的蛋白进入下一步。3.4对步骤3.3得到的纯化后的蛋白用biacore仪器进行亲和力的测试。试验方案：所用的仪器biacoret200，生产厂家为ge公司。实验芯片：cm5购于ge公司，货号为br-1005-30。靶点蛋白捕捉试剂盒：gstcapturekit，购于ge公司，货号为br-1002-23。靶点蛋白：c-abl/abl1protein,human,recombinant(gsttag)购于义翘神州，货号：11199-h09b，靶点蛋白sh2是abl1蛋白的一个亚基，是与kjdl9结合的亚基。按照仪器操作指南，试剂盒实验方案进进行试验，获得以下试验结果：具体的试验步骤分为以下几步：a)开机：设定反应温度为25℃，等待30min，待面板上的黄色指示灯停止闪烁，表明温度已经达到预设温度，可以开始试验。b)打开控制软件，准备缓冲液，量取50ml10ⅹhbs-ep+buffer、450ml去离子水(已经0.22μm滤膜过滤)，混匀后放入500ml缓冲液瓶。c)放入cm5芯片。按照gstcapturekit说明书将anti-gst抗体固定到芯片上，并进行封闭，然后利用anti-gst抗体的捕捉abl1重组蛋白(gsttag)，然后用试剂和中的重组gst蛋白封闭没有用到的anti-gst抗体表位。d)将待测抗体ha4蛋白上样，测定亲和力。e)利用软件拟合亲和力曲线，得到动力学数据ka、kd，亲和力数据kd。亲和力数值见表2。3.5kjdl9与abl1蛋白的亲和力与ha4与abl1蛋白的亲和力的比较。如表2-b所示，测量ha4的亲和力常数kd为4.92e-07，而kjdl9突变体的亲和力常数kd为4.69e-08，明显低于ha4，且低了一个数量级。亲和力常数越低，亲和力越高，表明关键位点的氨基酸突变后，亲和力明显提高。实施例4：kjdl2样品与abl1蛋白的亲和力的测试。4.1构建及表达kjdl2的载体。设计引物(引物序列见表1)扩增kjdl2编码基因(基因序列见seqidno：7)后，酶切，通过酶切及t4连接的办法将基因编码序列构建到蛋白表达载体pet28a上，如附图2所示，将kjdl2抗体的基因序列连接到表达载体pet28a上，然后摇菌诱导蛋白表达，将含有表达载体的工程菌株培养表达重组蛋白。4.2培养表达重组蛋白。具体的步骤为将步骤4.1得到的工程菌株于lb液体培养基中37℃振荡过夜培养后，以1:100接种量接种至含1l的lb培养基的摇瓶中，37℃培养2h，加入终浓度为1mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，并降温至16℃过夜培养。8000r/min离心10min收集菌体，用破菌液(20mmpb，150mmnacl，ph8.0)重悬后进行超声破碎，破碎溶液12000r/min离心30min留取上清液，进行下一步的纯化工作。4.3纯化重组蛋白。由于步骤4.2中得到的重组蛋白后端序列中含his融合蛋白，可用his亲和层析柱对其进行纯化。亲和层析所用缓冲液为20mmpb，150mmnacl，ph＝7.5，洗脱所用缓冲液为20mmpb，150mmnacl，500mm咪唑，ph＝7.5。收集洗脱各部分，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测目的蛋白表达情况。(结果中可以显示层析图谱：如附图3所示)目的蛋白大小为14.6kda，观察电泳图中条带大小与蛋白分子量标准比较，选择大小合适的目的蛋白进入下一步。4.4对步骤4.3得到的纯化后的蛋白用biacore仪器进行亲和力的测试。试验方案：所用的仪器biacoret200，生产厂家为ge公司。实验芯片：cm5购于ge公司，货号为br-1005-30。靶点蛋白捕捉试剂盒：gstcapturekit，购于ge公司，货号为br-1002-23。靶点蛋白：c-abl/abl1protein,human,recombinant(gsttag)购于义翘神州，货号：11199-h09b，靶点蛋白sh2是abl1蛋白的一个亚基，是与kjdl2结合的亚基。按照仪器操作指南，试剂盒实验方案进进行试验，获得以下试验结果：具体的试验步骤分为以下几步：a)开机：设定反应温度为25℃，等待30min，待面板上的黄色指示灯停止闪烁，表明温度已经达到预设温度，可以开始试验。b)打开控制软件，准备缓冲液，量取50ml10ⅹhbs-ep+buffer、450ml去离子水(已经0.22μm滤膜过滤)，混匀后放入500ml缓冲液瓶。c)放入cm5芯片。按照gstcapturekit说明书将anti-gst抗体固定到芯片上，并进行封闭，然后利用anti-gst抗体的捕捉abl1重组蛋白(gsttag)，然后用试剂和中的重组gst蛋白封闭没有用到的anti-gst抗体表位。d)将待测抗体ha4蛋白上样，测定亲和力。e)利用软件拟合亲和力曲线，得到动力学数据ka、kd，亲和力数据kd。亲和力数值见表2。4.5kjdl2与abl1蛋白的亲和力与ha4与abl1蛋白的亲和力的比较。如表2-a所示，测量ha4的亲和力常数kd为2.73e-08，而kjdl2突变体的亲和力常数kd为7.00e-09，明显低于ha4，亲和力常数越低，亲和力越高，表明关键位点的氨基酸突变后，亲和力明显提高。kjdl2和ha4拟合的亲和力曲线分别如附图7和附图6所示，0秒和180秒出曲线分别有一个陡然的增高和降低，是由于系统缓冲液与待测抗体蛋白的缓冲液不一致造成的，这个陡然的增高和降低不影响亲和力的测定，可以被忽略。两个亲和力曲线上升阶段kjdl2的弧度更大一些，ha4更直一些，kjdl2的斜率也明显更大，斜率代表了结合常数ka。同时在表2-a中结合常数ka也是kjdl2>ha2，表明经过关键位点的氨基酸突变后，结合速度得到明显提高。下降阶段的斜率样品kjdl2的斜率小于ha4，下降的斜率代表了解离常数kd。同时在表2-a中解离常数kd也是kjdl2<ha4，表明与ha4相比kjdl2的解离速度变的更慢，表明该突变体一旦结合到abl1蛋白，更不容易解离下来。以上数据证实经过关键氨基酸位点突变后，kjdl2与ha4相比结合速度更快，且解离速度更慢，亲和力高于ha4。实施例5：利用kjdl7突变体检测abl1蛋白含量本实验所用的仪器：培养箱，洗板机和酶标仪。本实验所用的试剂和来源为：abl1蛋白购于义翘神州，kjdl7单克隆类抗体，hrp标记抗his标签鼠源单克隆抗体和tmb单组分显色液。本实验所使用的试剂：磷酸盐缓冲液(pbs)：称取8.0gnacl,0.2gkh2po4,2.96gna2hpo4·12h2o，用量筒加1000ml蒸馏水，ph为7.5；样品稀释液(pbst)：100mlpbs中加0.1mltween-20。洗涤液(pbst)：1000mlpbs加1mltween-20。终止液：1mol/lh2so4。注意将硫酸加入水中并不停搅拌。此反应会大量放热。包被缓冲液：称取1.5gna2co3,2.93gnahco3,0.2gnan3(可不加),用量筒加1000ml蒸馏水，ph为9.6。封闭液：3g牛血清蛋白溶于100ml包被缓冲液。本实验用kjdl7突变体以elisa方法检测abl1蛋白含量，具体的实验步骤如下:5.1包被：将abl1蛋白0.2mg/ml用包被缓冲液稀释到0孔、1：200、1:1000、1:5000每孔100ul，每个浓度3个重复孔4℃，湿盒内包被过夜。5.2洗板：将样品甩掉，然后用排枪加入洗涤液300ul然后倒掉，洗板4遍，在报纸上摔两下。5.3封闭：每孔加入120ul封闭液，湿盒内37℃，2h，然后甩掉封闭液。5.4加入his标签的kjdl7抗体以1:200的比例稀释，每孔100ul，置37℃下，湿盒内温育1h。5.5洗板：将样品甩掉，然后用排枪加入洗涤液300ul然后倒掉，洗板4遍，在报纸上摔两下。5.6加入hrp标记抗his标签抗体1:500稀释，每孔100ul，置37℃下，湿盒内温育1h。5.7洗板：将样品甩掉，然后用排枪加入洗涤液300ul然后倒掉，洗板4遍，在报纸上摔两下。5.8加入tmb单组分显色液，每孔100ul，避光显色20min，加入等体积终止液。5.9比色：在酶标仪上检测类型设置为吸收光，波长设置为450nm，然后选择读板。测定样品在450nm处对光吸收的od值。表1：引物序列表表2：实施例子中的样品的biacore测量结果a:第一次测量结果b:第二次测量结果表3：抗体名称和对应的突变位点及氨基酸的变化抗体名称氨基酸的突变位点及氨基酸的变化kjdl2p56l，a85e，y87mkjdl7a85e，y87mkjdl9y35s，p56l，a85e，y87m表4：abl1蛋白浓度的od值elisa检测结果来看，abl1蛋白浓度在200ng/ml时，测得od值为0.255，而未包被abl1蛋白测得od只有0.129，经方差分析两者有极显著差异，可以判定，最低检出浓度为200ng/ml。证明该kjdl7类抗体可以用于abl1蛋白的检测。该检测方法只是举例说明，并不限于这一个检测方法。实施例6：ha4与kjdl类抗体的氨基酸序列对比如附图四所示，三个突变体序列比对来看，三个突变体都有的突变位点是a85e和y87m，研究证实：第87位氨基酸为关键氨基酸位点，只要将87位氨基酸突变成丙氨酸，突变体ha4-y87a将完全失去亲和力。但将87位氨基酸突变成甲硫氨酸，尚属首次。再加上将85位氨基酸由丙氨酸变成谷氨酸，kjdl7就具有这两个突变位点，亲和力得以明显提升，kjdl2在kjdl7两个突变位点的基础上又增加了56位氨基酸由脯氨酸变成了亮氨酸，亲和力得以进一步增强。而kjdl9又在kjdl2三个突变位点的基础上增加了35位氨基酸由酪氨酸变成了丝氨酸。这一突变体亲和力同时也高于ha4。kjdl类抗体的突变点总结如表3所示。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对此作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。----sequenceinfo------->seq1-ha4-dna>seq2-ha4gssvssvptklevvaatptslliswdapmssssvyyyritygetggnspvqeftvpyssstatisglspgvdytitvyawgedsagymfmyspisinyrtc>seq3-kjdl7>seq4-kjdl7(a85e+y87m)gssvssvptklevvaatptslliswdapmssssvyyyritygetggnspvqeftvpyssstatisglspgvdytitvyawgedsegmmfmyspisinyrtc>seq5-kjdl9>seq6-kjdl9(y35s+p56l+a85e+y87m)gssvssvptklevvaatptslliswdapmssssvsyyritygetggnspvqeftvlyssstatisglspgvdytitvyawgedsegmmfmyspisinyrtc>seq7-kjdl2>seq8-kjdl2(p56l+a85e+y87m)gssvssvptklevvaatptslliswdapmssssvyyyritygetggnspvqeftvlyssstatisglspgvdytitvyawgedsegmmfmyspisinyrtc>seq9-general-seqidno:9(x2-p)gssvssvptklevvaatptslliswdapmssssvx1yyritygetggnspvqeftvpyssstatisglspgvdytitvyawgedsegmmfmyspisinyrtc>seq10-generalseqidno:10(x2-l)gssvssvptklevvaatptslliswdapmssssvx1yyritygetggnspvqeftvlyssstatisglspgvdytitvyawgedsegmmfmyspisinyrtc。序列表<110>科稷达隆生物技术有限公司<120>一组新型的fn3类抗体突变体及其应用<141>2020-05-15<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>306<212>dna<213>artificialsequence<400>1ggcagctctgtgagtagcgttccgaccaaactggaagtggttgcagcaaccccgacgagc60ctgctgatttcttgggatgccccgatgtctagtagctctgtgtattactatcgtatcacc120tacggtgaaacgggcggtaacagcccggtgcaggaatttacggttccgtatagtagctct180accgcgacgattagtggcctgagcccgggtgtggattacaccatcacggtttatgcatgg240ggcgaagatagcgcgggttatatgttcatgtattctccgattagtatcaattaccgcacc300tgctaa306<210>2<211>101<212>prt<213>artificialsequence<400>2glyserservalserservalprothrlysleugluvalvalalaala151015thrprothrserleuleuilesertrpaspalaprometserserser202530servaltyrtyrtyrargilethrtyrglygluthrglyglyasnser354045provalglngluphethrvalprotyrserserserthralathrile505560serglyleuserproglyvalasptyrthrilethrvaltyralatrp65707580glygluaspseralaglytyrmetphemettyrserproileserile859095asntyrargthrcys100<210>3<211>306<212>dna<213>artificialsequence<400>3ggcagctctgtgagtagcgttccgaccaaactggaagtggttgcagcaaccccgacgagc60ctgctgatttcttgggatgccccgatgtctagtagctctgtgtattactatcgtatcacc120tacggtgaaacgggcggtaacagcccggtgcaggaatttacggttccgtatagtagctct180accgcgacgattagtggcctgagcccgggtgtggattacaccatcacggtttatgcatgg240ggcgaagatagcgagggtatgatgttcatgtattctccgattagtatcaattaccgcacc300tgctaa306<210>4<211>101<212>prt<213>artificialsequence<400>4glyserservalserservalprothrlysleugluvalvalalaala151015thrprothrserleuleuilesertrpaspalaprometserserser202530servaltyrtyrtyrargilethrtyrglygluthrglyglyasnser354045provalglngluphethrvalprotyrserserserthralathrile505560serglyleuserproglyvalasptyrthrilethrvaltyralatrp65707580glygluaspsergluglymetmetphemettyrserproileserile859095asntyrargthrcys100<210>5<211>306<212>dna<213>artificialsequence<400>5ggcagctctgtgagtagcgttccgaccaaactggaagtggttgcagcaaccccgacgagc60ctgctgatttcttgggatgccccgatgtctagtagctctgtgtcttactatcgtatcacc120tacggtgaaacgggcggtaacagcccggtgcaggaatttacggttctgtatagtagctct180accgcgacgattagtggcctgagcccgggtgtggattacaccatcacggtttatgcat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