内切葡聚糖酶基因、内切葡聚糖酶及其制备方法和应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及内切葡聚糖酶基因macel及相应的重组表达载体、重组表达菌株，以及内切葡聚糖酶macel及其制备方法和应用。

背景技术：

纤维素酶是一种能够将纤维素降解为葡萄糖的复合酶系。纤维素酶根据对底物的作用方式可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶。在纤维素酶系中，内切葡聚糖酶扮演着重要的角色。在纤维素的水解过程中，内切葡聚糖酶随机地切割纤维素内部的β-1,4糖苷键，从而形成小片段纤维多糖，为外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶供作用底物。由于内切葡聚糖酶在纤维素水解过程中发挥着重要作用，因此其在食品工业、纺织工业、造纸工业以及生物质能源等领域具有广泛的应用潜力。

迄今国内外的科研工作者已经研究和报道了许多内切葡聚糖酶。根据物种来源，这些内切葡聚糖酶主要分为细菌葡聚糖酶和真菌葡聚糖酶。其中，来源于嗜热真菌melanocarpusalbomyces的内切葡聚糖酶具有很好的热稳定性并且在中性条件下具有很好的活性，使其在纺织、生物能源以及食品加工等领域具有很好的应用潜力。然而，目前限制该内切葡聚糖酶产业化应用的主要问题是发酵酶活低，生产成本高，因此提高其酶活并降低生产成本是其产业化应用急需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供内切葡聚糖酶基因macel及相应的重组表达载体、重组表达菌株，以及内切葡聚糖酶macel及其制备方法和应用，旨在解决现有来源于嗜热真菌melanocarpusalbomyces的内切葡聚糖酶的酶活低的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种内切葡聚糖酶基因macel，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明另一方面提供了一种内切葡聚糖酶macel，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

本发明再一方面提供了一种重组表达载体，其包括所述的内切葡聚糖酶基因macel。

本发明又一方面提供了一种重组表达菌株，其包括上述的重组表达载体。

本发明还有一方面提供了一种内切葡聚糖酶macel的制备方法，其包括如下步骤：

提供内切葡聚糖酶基因macel、表达载体和表达菌株；

对所述内切葡聚糖酶基因macel进行扩增，所得扩增产物与所述表达载体进行连接，得到重组表达载体；

将所述重组表达载体转入表达菌株，得到重组表达菌株；

对所述重组表达菌株进行培养，得到所述内切葡聚糖酶macel；

其中，所述内切葡聚糖酶基因macel的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明最后一方面提供了上述内切葡聚糖酶macel或上述内切葡聚糖酶macel的制备方法制备得到的内切葡聚糖酶macel在水解纤维素中的应用。

本发明提供的内切葡聚糖酶基因macel，是根据毕赤酵母密码子的偏好性，对来源于嗜热真菌melanocarpusalbomyces的内切葡聚糖酶的序列(genbank:aj515703.1)进行综合优化，将低频密码子转换成高频密码子，同时将其基因表达适应指数从0.51提升至0.79，gc含量从68％调整到50％。通过综合优化，该内切葡聚糖酶基因macel与原始序列的相似性为74％，其序列稳定性和密码子适应性都得到显著提高，可在毕赤酵母表达菌株中进行高效表达，从而降低内切葡聚糖酶macel的生产成本。

本发明提供的内切葡聚糖酶macel不仅丰富了内切葡聚糖酶的种类和来源途径，且其自身具有较高的酶活性，在较高的反应温度下仍可以保持较高的酶活性，可见本发明提供的内切葡聚糖酶macel具有良好的耐热性。此外，该内切葡聚糖酶macel还在较宽的ph范围内表现出良好的稳定性。所以，本发明提供的内切葡聚糖酶macel具有良好的应用前景和产业价值。

本发明提供的重组表达载体包括上述的内切葡聚糖酶基因macel，由于该内切葡聚糖酶基因macel经过密码子优化，具有较好的稳定性和密码子适应性，相应地，本发明包括该内切葡聚糖酶基因macel的重组表达载体也具有较好的稳定性，有利于内切葡聚糖酶基因macel的稳定、高效表达，对降低内切葡聚糖酶macel的生产成本起到重要作用。

本发明提供的重组表达菌株包括上述的重组表达载体，因此可用于表达内切葡聚糖酶基因macel编码的内切葡聚糖酶macel。同时，由于内切葡聚糖酶基因macel的序列具有较好的稳定性和密码子适应性，所得重组表达菌株可以稳定、高效表达内切葡聚糖酶macel。

本发明提供的内切葡聚糖酶macel的制备方法中，以异源重组的方式，通过将内切葡聚糖酶基因macel进行扩增，得到相应的重组表达载体、重组表达菌株，再经培养得到内切葡聚糖酶macel，该方法步骤简单，过程容易控制，可稳定、高效地生产内切葡聚糖酶macel，制备得到的内切葡聚糖酶macel具有酶活性高、生产成本低的优点。

本发明上述的内切葡聚糖酶macel或上述内切葡聚糖酶macel的制备方法制备得到的内切葡聚糖酶macel可用于水解纤维素领域，由于该内切葡聚糖酶macel具有耐热性，且在较宽的ph范围内表现出良好的稳定性，因此用于水解纤维素时，可使水解反应高效、稳定地进行。

附图说明

图1为本发明实施例5对重组表达菌株进行高密度发酵培养的曲线图；

图2为本发明实施例6所得内切葡聚糖酶macel的sds-page蛋白电泳图；

图3为本发明实施例6所得内切葡聚糖酶macel的最适反应温度及热稳定性图；

图4为本发明实施例6所得内切葡聚糖酶macel的最适反应ph及ph稳定性图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明的描述中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b的情况。其中a，b可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

需要理解的是，本发明实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

另外，除非上下文另外明确地使用，否则词的单数形式的表达应被理解为包含该词的复数形式。术语“包括”或“具有”旨在指定特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合的存在，但不用于排除存在或可能添加一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合。

需要说明的是，本发明实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；相关试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明实施例提供了一种内切葡聚糖酶基因macel，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

内切葡聚糖酶基因macel的核苷酸序列(seqidno:1)：

atgagatccaccccagtcttgagagctttgttggcagcagctttgccattgggagctttagcagctaacggtcaatccaccagatattgggattgttgcaagccaagttgcggttggagaggtaagggaccagttaaccaaccagtctactcttgcgacgctaacttccagagaatccacgacttcgacgcagtttcaggttgcgaaggaggtccagcttttagttgcgccgatcattctccttgggctattaacgacaacctgtcctacggttttgcagctacagctttgtccggtcaaaccgaagaaagttggtgttgcgcttgctacgctttgactttcacttccggtccagttgcaggtaagaccatggttgtccaatccacttccaccggaggagatttgggttctaaccacttcgacttgaacattccaggaggaggagttggtttgttcgacggttgtactccacagttcggaggtttaccaggagctagatacggaggtatctcctctagacaggagtgcgattctttcccagagcctttgaagccaggttgtcagtggagattcgattggttccagaacgccgataacccatctttcaccttcgagagagtccagtgtccagaagagcttgtcgctagaaccggttgtagaagacacgacgacggaggttttgccgttttcaaggctccatccgcttaa

本发明实施例提供的内切葡聚糖酶基因macel，是根据毕赤酵母密码子的偏好性，对来源于嗜热真菌melanocarpusalbomyces的内切葡聚糖酶的序列(genbank:aj515703.1)进行综合优化，将低频密码子转换成高频密码子，同时将其基因表达适应指数从0.51提升至0.79，gc含量从68％调整到50％。通过综合优化，该内切葡聚糖酶基因macel与原始序列的相似性为74％，其序列稳定性和密码子适应性都得到显著提高，可在毕赤酵母表达菌株中进行高效表达，从而降低内切葡聚糖酶macel的生产成本。

相应地，本发明实施例还提供了一种内切葡聚糖酶macel，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

内切葡聚糖酶macel的氨基酸序列(seqidno:2)：

mrstpvlrallaaalplgalaangqstrywdcckpscgwrgkgpvnqpvyscdanfqrihdfdavsgceggpafscadhspwaindnlsygfaatalsgqteeswccacyaltftsgpvagktmvvqststggdlgsnhfdlnipgggvglfdgctpqfgglpgaryggissrqecdsfpeplkpgcqwrfdwfqnadnpsftfervqcpeelvartgcrrhddggfavfkapsa

本发明实施例提供的内切葡聚糖酶macel不仅丰富了内切葡聚糖酶的种类和来源途径，且其自身具有较高的酶活性，在较高的反应温度下仍可以保持较高的酶活性，可见本发明实施例提供的内切葡聚糖酶macel具有良好的耐热性。此外，该内切葡聚糖酶macel还在较宽的ph范围内表现出良好的稳定性。所以，本发明实施例提供的内切葡聚糖酶macel具有良好的应用前景和产业价值。

相应地，本发明实施例还提供了一种重组表达载体，其包括上述的内切葡聚糖酶基因macel。

本发明实施例提供的重组表达载体包括上述的内切葡聚糖酶基因macel，由于该内切葡聚糖酶基因macel经过密码子优化，具有较好的稳定性和密码子适应性，相应地，本发明包括该内切葡聚糖酶基因macel的重组表达载体也具有较好的稳定性，有利于内切葡聚糖酶基因macel的稳定、高效表达，对降低内切葡聚糖酶macel的生产成本起到重要作用。

相应地，本发明实施例还提供了一种重组表达菌株，其包括上述的重组表达载体。

本发明实施例提供的重组表达菌株包括上述的重组表达载体，因此可用于表达内切葡聚糖酶基因macel编码的内切葡聚糖酶macel。同时，由于内切葡聚糖酶基因macel的序列具有较好的稳定性和密码子适应性，所得重组表达菌株可以稳定、高效表达内切葡聚糖酶macel。

相应地，本发明实施例还提供了一种内切葡聚糖酶macel的制备方法，其包括如下步骤：

s1、提供内切葡聚糖酶基因macel、表达载体和表达菌株；

s2、对内切葡聚糖酶基因macel进行扩增，所得扩增产物与表达载体进行连接，得到重组表达载体；

s3、将重组表达载体转入表达菌株，得到重组表达菌株；

s4、对重组表达菌株进行培养，得到内切葡聚糖酶macel；

其中，内切葡聚糖酶基因macel的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明实施例提供的内切葡聚糖酶macel的制备方法中，以异源重组的方式，通过将内切葡聚糖酶基因macel进行扩增，得到相应的重组表达载体、重组表达菌株，再经培养得到内切葡聚糖酶macel，该方法步骤简单，过程容易控制，可稳定、高效地生产内切葡聚糖酶macel，制备得到的内切葡聚糖酶macel具有酶活性高、生产成本低的优点。

具体地，s1中，内切葡聚糖酶基因macel的核苷酸序列如seqidno:1所示，该序列是对来源于嗜热真菌melanocarpusalbomyces的内切葡聚糖酶的序列(genbank:aj515703.1)进行综合优化得到，具体优化方法及优化后基因的优势如前文所述，此处不再赘述。

表达载体，在本发明实施例中，用于构建表达如seqidno:1所示的内切葡聚糖酶基因macel的重组表达载体。在一些实施例中，选择毕赤酵母表达载体。这是因为本发明实施例提供的内切葡聚糖酶基因macel已根据毕赤酵母密码子的偏好性进行了优化，且毕赤酵母具有表达基因整合稳定性高、培养方便经济、适合扩大工业规模并降低生产成本的优点，因此选择毕赤酵母表达载体可以进一步提高内切葡聚糖酶基因macel的表达稳定性和表达量，同时也降低了内切葡聚糖酶macel的生产成本。具体地，可选择毕赤酵母表达载体ppiczαa用于构建重组表达载体，相应地，将所得重组表达载体命名为ppiczαa-macel。

表达菌株，在本发明实施例中用于构建重组表达菌株。在一些实施例中，选择毕赤酵母表达菌株。这是因为本发明实施例提供的内切葡聚糖酶基因macel根据毕赤酵母密码子的偏好性进行了优化，且毕赤酵母真核表达系统是目前使用较为广泛的真核表达系统，其具有生物安全性好、遗传元件稳定、易于进行基因工程遗传操作、内源蛋白分泌少、可实现高密度发酵、表达水平较高以及易于分离纯化蛋白、适合工业规模化生产等优点，有利于获得酶活性高且生产成本更低的内切葡聚糖酶macel。具体地，可选择毕赤酵母x33作为表达菌株。

s2中，通过对内切葡聚糖酶基因macel进行扩增，所得扩增产物与表达载体进行连接，即可得到重组表达载体。在一些实施例中，用于扩增内切葡聚糖酶基因macel的引物包括正向引物macel-f和反向引物macel-r，且正向引物macel-f的核苷酸序列如seqidno:3所示，反向引物macel-r的核苷酸序列如seqidno:4所示。

macel-f的核苷酸序列(seqidno:3)：

agtcgaattcgctaacggtcaatccaccagatatt

macel-r的核苷酸序列(seqidno:4)：

ttctctagaagcggatggagccttgaaaacggca

s3中，将所得重组表达载体转入表达菌株中，得到重组表达菌株，可表达相应的蛋白。本发明实施例对于重组表达菌株的具体构建方法没有特殊要求，采用本领域常规方法即可。

s4中，通过对重组表达菌株进行培养，内切葡聚糖酶基因macel的核苷酸序列随着重组表达菌株的繁殖而复制，然后收集重组表达菌株的培养物，经分离、纯化，得到内切葡聚糖酶macel。在一些实施例中，重组表达菌株进行培养的方法可以是摇瓶发酵培养，也可以是高密度发酵培养，还可以是先摇瓶发酵培养，再高密度发酵培养。其中，摇瓶发酵培养的方法是：先将重组表达菌株接入bmgy培养基中，在30℃、220rpm条件下进行培养24h，然后再接入含有bmmy的培养基中，在30℃、220rpm条件下进行培养，同时加入甲醇进行诱导，得到发酵液。高密度发酵培养的方法是：将重组表达菌株接入含ypg培养基的250ml三角瓶中，在30℃、200rpm条件下进行过夜培养，然后再接入含ypg培养基的500ml三角瓶中，在30℃、200rpm条件下进行振荡过夜培养，直至od600大于10，将二次过夜培养的重组表达菌株接种至含bsm培养基的发酵罐中，在30℃、ph5.0、500rpm、空气流量为40l/min的条件下进行发酵培养；培养初期以甘油作为碳源，甘油被菌体吸收完后开始用甲醇诱导，得到发酵液。最后将摇瓶发酵培养或高密度发酵培养所得发酵液进行纯化，得到内切葡聚糖酶macel。

相应地，本发明实施例还提供了上述内切葡聚糖酶macel或上述内切葡聚糖酶macel的制备方法制备得到的内切葡聚糖酶macel在水解纤维素中的应用。

本发明实施例提供的上述的内切葡聚糖酶macel或上述内切葡聚糖酶macel的制备方法制备得到的内切葡聚糖酶macel可用于水解纤维素领域，由于该内切葡聚糖酶macel具有耐热性，且在较宽的ph范围内表现出良好的稳定性，因此用于水解纤维素时，可使水解反应高效、稳定地进行。

在一些实施例中，本发明实施例提供的内切葡聚糖酶macel在水解纤维素的反应中，其反应温度为60℃-80℃，最适反应温度为70℃。

在一些实施例中，本发明实施例提供的内切葡聚糖酶macel在水解纤维素的反应中，其反应ph为5.0-9.0，最适反应ph为7.0。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例内切葡聚糖酶基因、内切葡聚糖酶及其制备方法和应用的进步性能显著的体现，以下通过实施例来举例说明上述技术方案。

以下实施例中涉及到的实验材料和试剂：

菌株与载体：大肠杆菌菌株top10、毕赤酵母x33、表达载体ppiczαa均从商业途径购买获得。

q5高保真taq酶mix购自neb公司；质粒提取、胶纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司；zeocin购自invitrogen公司。

培养基：大肠杆菌培养基为lb(1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)nacl，ph7.0)。lbz为lb培养基加25μg/mlzeocin(博莱霉素)；

酵母培养基为ypd(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)。酵母筛选培养基为ypdz(ypd+100mg/lzeocin)；

酵母诱导培养基bmgy(1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、1.34％(w/v)ynb、0.00004％(w/v)biotin、1％甘油(v/v))和bmmy培养基(除以0.5％(v/v)甲醇代替甘油，其余成份相与bmgy相同)；

注：ynb为酵母氮源基础(yeastnitrogenbase)；biotin为生物素。

酶活性测定所用试剂：

磷酸盐缓冲液0.1mol/l(ph＝6.0)：分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89g,将其溶解在10l去离子水中。调节溶液的ph到(6.0±0.05)备用。溶液在室温下可保存一个月；

15mg/mlcmc溶液：精密称取cmc1.5000g缓慢加入到80ml中性缓冲液(ph＝6.0)中，磁力搅拌至完全溶解，用3m盐酸溶液或3m氢氧化钠溶液调ph值至6.0，再用ph＝6.0的中性缓冲液定容至100ml；

dns试剂：称取氢氧化钠100.0g加水溶解，定容至500ml(a试液)，称取3,5-二硝基水杨酸15.75g缓慢加入2500ml蒸馏水中，不断搅拌，水浴至45℃，逐步加入500mla试液，不断搅拌至溶液清澈透明，再逐步加入四水酒石酸钾钠455g、苯酚12.5g、无水亚硫酸钠12.5g，继续45℃水浴加热，同时补水1500ml，不断搅拌，至上述物质完全溶解后，冷却至室温，并定容至5000ml。

实施例1

本实施例提供了内切葡聚糖酶基因序列分析及密码子优化过程，包括如下步骤：

根据文献报道的ncbi数据库登录号(genbank:aj515703.1)，获得了来源于嗜热真菌melanocarpusalbomyces的内切葡聚糖酶的基因序列，参照毕赤酵母密码子偏好性进行优化，获得了内切葡聚糖酶macel基因。相比原始基因，优化后的内切葡聚糖酶macel基因减少了稀有密码子(如将编码精氨酸的低频密码子cgg转换成高频密码子aga，编码脯氨酸的低频密码子ccg转换成高频密码子cca等)；优化后的内切葡聚糖酶macel基因表达适应指数从0.51提升至0.79；优化后的内切葡聚糖酶macel基因gc含量从68％调整至50％。与原始基因相比，优化后的内切葡聚糖酶macel基因总共优化了184个核苷酸，与原始序列的相似性为74％。优化后的内切葡聚糖酶macel基因全长为708bp，序列如seqidno:1所示，编码的内切葡聚糖酶macel共236个氨基酸，序列如seqidno:2所示。通过信号肽预测软件signalp-5.0server预测分析发现内切葡聚糖酶macel的前21个氨基酸为其信号肽。

实施例2

本实施例提供了一种含内切葡聚糖酶基因macel的重组表达载体的构建过程，具体如下：

(1)根据内切葡聚糖酶基因macel的序列设计一对引物macel-f和macel-r，其核苷酸序列如seqidno:3-4所示，用于扩增内切葡聚糖酶基因macel1(macel1是macel去除了编码信号肽的核苷酸序列)；

(2)通过pcr扩增获得内切葡聚糖酶基因macel1，用限制性内切酶ecori和xbai分别过夜酶切表达载体ppiczαa和内切葡聚糖酶基因macel1，将过夜酶切的表达载体ppiczαa和内切葡聚糖酶基因macel1进行纯化回收后进行连接反应；

(3)采用热激法将连接反应产物转入大肠杆菌top10，采用菌液pcr验证重组转化子；

(4)将验证成功的转化子接入lbz液体培养基，提取质粒，进行测序验证，最终获得重组表达载体ppiczαa-macel1。

实施例3

本实施例提供了一种含实施例2所得重组表达载体的酶活优势菌株的构建及筛选过程，具体如下：

用限制性内切酶saci线性化重组表达载体ppiczαa-macel1后，采用电转化法转入毕赤酵母x33，从而获得不同的阳性转化子。重组毕赤酵母的筛选采用24孔板法，具体步骤如下：将ypdz平板上的重组转化子用牙签逐个挑至每孔含有1.8mlbmgy培养基的24孔板，30℃，200rpm过夜培养24小时后，4000rpm离心去掉上清，加入1.6ml的bmmy培养基，30℃，200rpm培养24小时，测定重组转化子酶活。

酶活测定如下：

(5)取三支比色管各加入1.8mlcmc底物，与待测酶液一起70℃水浴预热3min；

(6)在第一、二支比色管中各加入0.2ml待测酶液，并计时，70℃水浴中反应10min；

(7)反应完后在三支比色管中各加入3.0ml的dns试剂，并在第三支比色管中补加0.5ml的待测酶液；

(8)取出并摇匀三支比色管后，在沸水浴中反应5min；

(9)速冷却至室温，补水5.0ml。以第三支比色管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二支比色管试液的吸光度。

酶活定义为：在70℃，ph为6.0条件下，每分钟从浓度为13.5mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位(u)。通过筛选96个阳性转化子，最终获得3个酶活优势菌株分别命名为m6、m65和m23。

实施例4

本实施例提供了实施例3所得酶活优势菌株的摇瓶发酵培养过程，具体如下：

将实施例3所得酶活优势菌株m6、m65和m23进行摇瓶培养，摇瓶培养在250ml三角瓶中进行，首先将相应的重组工程菌种分别接入含有5mlbmgy培养基的50ml离心管中，30℃，220rpm培养24小时左右，将培养好的重组酵母工程菌种按1％(v/v)的接种量分别接入含有50mlbmmy培养基的250ml三角瓶中。摇瓶培养条件为30℃，220rpm，每隔24小时加入1％(v/v)的甲醇进行诱导，同时取样进行葡聚糖酶活性的测定，通过酶活测定发现，诱导培养96小时后，m6、m65和m23的酶活分别为108u/ml、95u/ml和82u/ml。

实施例5

本实施例提供了将实施例4所得发酵培养后的重组工程菌m6进行高密度发酵培养的过程，具体如下：

将单菌落重组工程菌m6接入含有50mlypg培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养。再将过夜培养的重组酵母工程菌按1％(v/v)的接种量接入含有100mlypg培养基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养，至od600大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌m6按10％(v/v)的接种量接入含有2lbsm培养基的5l发酵罐。重组酵母工程菌m6在5l发酵罐的培养条件为：温度为30℃、ph值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40l/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到一定的量(180g/l左右)，停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后(溶氧迅速上升)开始用甲醇诱导。甲醇的添加量根据溶氧进行调整。培养过程中，每24小时取样测定菌体湿重、酶活和总蛋白浓度，所得高密度发酵培养的曲线图如图1所示。

由图1可知，随着发酵时间的增加，酶活性也逐渐增加，当诱导培养至168小时，发酵酶活达到最大(3185u/ml)，总蛋白浓度最大为7.15g/l。

实施例6

本实施例提供了将实施例5所得发酵液进行纯化，得到内切葡聚糖酶macel的过程，具体如下：

(10)将实施例5所得5l发酵罐的发酵液离心取上清进行纯化回收；

(11)用10kda超滤管将上清酶液进行超滤浓缩；

(12)用ni-ida蛋白纯化试剂盒进行纯化。纯化后的内切葡聚糖酶macel的酶比活为530u/mg。纯化后的sds-page蛋白电泳结果如图2所示。由图2可知，内切葡聚糖酶macel的大小约28kda。

实验例1

在ph5.0条件下测定实施例6所得内切葡聚糖酶macel在30-90℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100％，计算其他温度下的相对酶活；在30-90℃不同温度下水浴热处理30分钟后测定剩余酶活，以没有做热处理样品的酶活为100％，计算其他温度下的相对剩余酶活。

实验结果：内切葡聚糖酶macel的温度特性如图3所示，由图3可知，重组macel的最适反应温度为70℃；热稳定性方面，内切葡聚糖酶macel在30-80℃范围内具有良好的稳定性，热处理30分钟后，剩余酶活均大于81％。

实验例2

在50℃条件下测定实施例6所得内切葡聚糖酶macel在ph4.0-10.0下的酶活，以测定酶活最高ph下的酶活为100％，计算其他ph下的相对酶活；在ph4.0-10.0条件下，室温保存4小时后测定剩余酶活，以没有做任何处理的样品的酶活为100％，计算其他温度下的相对剩余酶活。

实验结果：内切葡聚糖酶macel的ph特性如图4所示，由图4可知，内切葡聚糖酶macel的最适反应ph为7.0，在ph5.0-8.0范围内相对酶活均大于76％；ph稳定性方面，在ph5.0-9.0条件下，室温保存4小时后剩余酶活均大于80％，表明在该ph范围内内切葡聚糖酶macel具有良好的稳定性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>深圳润康生态环境股份有限公司

<120>内切葡聚糖酶基因、内切葡聚糖酶及其制备方法和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>708

<212>dna

<213>嗜热真菌(melanocarpusalbomyces)

<400>1

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<213>嗜热真菌(melanocarpusalbomyces)

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<210>3

<211>35

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>3

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<210>4

<211>34

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>4

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