阻断型PD-1纳米抗体及其编码序列和用途的制作方法

阻断型pd-1纳米抗体及其编码序列和用途
技术领域
[0001]
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种阻断型pd-1纳米抗体及其编码序列和用途。


背景技术：

[0002]
程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death-1，pd-1)是一种细胞表面受体，也成为cd279，作为cd28家族成员，在免疫系统中发挥调节t细胞的功能。人pd-1基因位于染色体2q37位置。全长pd-1是一个含有288个氨基酸的i型跨膜蛋白，结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(igv)样结构域(21-170位氨基酸)、疏水的跨膜区(171-191位氨基酸)以及胞内区(192-288位氨基酸)，与鼠pd-1具有60％同源性。在胸腺发育期，pd-1表达于cd4与cd8双阴性的胸腺细胞表面，并主要表达在活化的t细胞，b细胞，nkt细胞和单核细胞表面。
[0003]
pd-1被视为一种共抑制受体。其结合配体包括：程序性细胞死亡配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1，b7-h1)和程序性细胞死亡配体2(programmed cell death 1ligand 2，pd-l2，b7-dc)。通过pd-l1或pd-l2与pd-1结合，pd-1可以下调t细胞的激活水平，抑制t细胞增殖，同时下调免疫细胞中抗凋亡分子bcl-xl、细胞因子的表达和免疫细胞中mtor通路的功能发挥。因此，t细胞在外周组织和肿瘤微环境中激活时诱导表达的pd-1可以响应慢性炎症或肿瘤细胞表面抗原表达，与肿瘤细胞或抗原呈递细胞表面pd-l1结合，起着免疫检查点发挥作用，用于抑制持续的免疫应答并防止对正常组织的潜在损害。
[0004]
t细胞对肿瘤表面抗原的反应可能会受到肿瘤细胞的失调，当肿瘤细胞试图通过劫持和破坏生理稳态免疫检查点信号通路逃避免疫检测，对这些抗原的t细胞反应可能失调。比如，pd-l1与pd-1的结合下调了抗肿瘤t细胞活性并促进免疫逃避。在人黑素瘤中，肿瘤浸润性t淋巴细胞(tils)高度上调pd-1，并且与pd-1-tils和外周血淋巴细胞相比表现出效应细胞因子产生受损，这可能意味着t细胞衰竭状态。此外，t细胞的激活会产生多种细胞因子，例如il-2、tnf-a和ifn-γ等。ifn-γ的产生继续诱导pd-1的表达上调。导致自我抑制，从而诱导免疫抗性。所以成功阻断pd-1与其配体的结合可视为肿瘤治疗的一条有效途径。
[0005]
pd-1/pd-l1免疫疗法通过阻断pd-1/pd-l1信号通路使癌细胞死亡，具有治疗多种类型肿瘤的潜力，实质性改善患者总生存期。截止2018年底，fda批准了6款pd-1/l1单抗药物，3款pd-1抑制剂：默沙东(msd)的keytruda、百时美施贵宝(bms)的opdivo、赛诺菲(sanofi)和再生元(regeneron)联合开发的libtayo。此外，国产pd-1药物：君实生物的特瑞普利单抗(拓益)、信达生物的信迪利单抗(达伯舒)、恒瑞医药的卡瑞利珠单抗(艾立妥)批准上市。
[0006]
作为新兴抗体药物的代表，纳米抗体正被广泛的应用于新药研发，纳米抗体药物具有较多优点，将会在肿瘤的免疫治疗中发挥更加巨大的作用。然而，本领域尚缺乏令人满意的针对pd-1的纳米抗体。因此，本领域迫切需要开发新的有效针对pd-1的纳米抗体，阻断
pd-1与pd-l1的相互结合，从而应用于肿瘤的免疫治疗。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种阻断型pd-1纳米抗体及其编码序列和用途。
[0008]
具体地，本发明的目的在于提供一种有效针对pd-1、能够有效阻断pd-1/pd-l1相互作用、且具有良好抗肿瘤活性的纳米抗体。
[0009]
在本发明的第一方面，提供了一种抗pd-1纳米抗体的vhh链，所述的vhh链包括框架区fr和互补决定区cdr，所述的互补决定区cdr包括seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、和seq id no:3所示的cdr3。
[0010]
在另一优选例中，所述的框架区fr包括：
[0011]
(a)seq id no:4所示的fr1、seq id no:5所示的fr2、seq id no:6所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4；或
[0012]
(b)seq id no:10所示的fr1、seq id no:11所示的fr2、seq id no:12所示的fr3、和seq id no:13所示的fr4。
[0013]
在另一优选例中，所述的抗pd-1纳米抗体的vhh链如seq id no:8或14所示。
[0014]
在另一优选例中，所述的pd-1为人pd-1。
[0015]
此外，还提供一种抗人pd-1抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、和seq id no:3所示的cdr3。
[0016]
本发明第二方面，提供了一种抗pd-1纳米抗体，它是针对pd-1表位的纳米抗体，并且具有如seq id no:8或seq id no:14中所示的氨基酸序列的vhh链。
[0017]
在另一优选例中，所述抗pd-1纳米抗体的ic
50
小于2ug/ml，优选地，小于1.5ug/ml。
[0018]
本发明第三方面，提供了一种抗pd-1多价抗体，所述多价抗体包含2个、3个或4个本发明第一方面所述的抗pd-1纳米抗体的vhh链或本发明第二方面所述的抗pd-1纳米抗体。
[0019]
在另一优选例中，所述多价抗体从n端到c端具有式ii或式iii所示的结构：
[0020]
p-l
’-
p-fc
ꢀꢀꢀ
式ii
[0021]
p-l
’-
p-l
’-
p-fc
ꢀꢀꢀ
式ii
[0022]
其中，
[0023]
“-”
为肽键；
[0024]
l’为接头元件，
[0025]
p为抗pd-1纳米抗体，
[0026]
fc为抗体的fc段。
[0027]
在另一优选例中，所述的l’的序列为(4gs)n，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝2或4。
[0028]
在另一优选例中，所述fc的序列如seq id no.:20的第281-第509位所示。
[0029]
在另一优选例中，所述多价抗体的氨基酸序列如seq id no.:18-20、24-26所示。
[0030]
在另一优选例中，所述多价抗体的氨基酸序列如seq id no.:20或26所示。
[0031]
在另一优选例中，所述多价抗体可以形成二聚体。
[0032]
在另一优选例中，所述的二聚体为四价抗体或六价抗体。
[0033]
本发明第四方面，提供了一种双特异性抗体，所述的双特异性抗体包括：抗pd-1纳米抗体和第二抗体，
[0034]
其中，所述的抗pd-1纳米抗体的互补决定区cdr包括：
[0035]
seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、和seq id no:3所示的cdr3。
[0036]
在另一优选例中，所述的第二抗体包括纳米抗体、单链抗体、双链抗体。
[0037]
在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：
[0038]
4-1bb抗体、cd47抗体、vegf抗体、her2抗体、egfr抗体、her3抗体、b7h3抗体、tigit抗体、ox-40抗体、cd40抗体、pd-l1抗体、或其组合。
[0039]
在另一优选例中，所述的双特异性抗体包括2-4个抗pd-1纳米抗体，较佳地，包括2个抗pd-1纳米抗体，更佳地，所述2个抗pd-1纳米抗体形成抗pd-1纳米抗体二聚体。
[0040]
在另一优选例中，所述的第二抗体为纳米抗体，并且所述的双特异性抗体包括2-4个第二抗体，较佳地，包括2个第二抗体，更佳地，所述2个第二抗体形成二聚体。
[0041]
在另一优选例中，所述的第二抗体为单链抗体，并且所述的双特异性抗体包括1-2个第二抗体。
[0042]
在另一优选例中，所述的双特异性抗体还包含fc段，较佳地，所述的fc段包含ch2结构域和ch3结构域。
[0043]
在另一优选例中，所述的fc段为igg4型fc段。
[0044]
在另一优选例中，所述的双特异性抗体从n端到c端具有式i所示的结构：
[0045]
p-l1-p-l2-fc-l3-b-l4-b
ꢀꢀꢀ
式i
[0046]
其中，
[0047]
“-”
为肽键；
[0048]
l1、l2、l3、和l4各自独立地为肽键或接头元件；
[0049]
p为抗pd-1纳米抗体，
[0050]
b为第二抗体(纳米抗体)，和
[0051]
fc为抗体的fc段。
[0052]
在另一优选例中，所述的l1、l3、和l4为接头元件。
[0053]
在另一优选例中，所述的接头元件的序列为(4gs)n，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝4。
[0054]
在另一优选例中，所述的l2为肽键。
[0055]
本发明第五方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的抗pd-1纳米抗体的vhh链、或本发明第二方面所述的抗pd-1纳米抗体、本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体或本发明第四方面所述的双特异性抗体。
[0056]
在另一优选例中，所述多核苷酸具有如seq id no:9或15所示的核苷酸序列。
[0057]
在另一优选例中，所述的多核苷酸包括dna或rna。
[0058]
本发明第六方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第五方面所述的多核苷酸。
[0059]
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、aav病毒、逆转录病毒、或其组合。
[0060]
本发明第七方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第六方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第五方面所述的多核苷酸。
[0061]
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
[0062]
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
[0063]
在本发明的第八方面，提供了一种产生抗pd-1纳米抗体或抗pd-1多价抗体的方法，包括步骤：
[0064]
(a)在合适的条件下，培养本发明第七方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗pd-1纳米抗体的培养物；和
[0065]
(b)对步骤(i)中得到的培养物进行纯化和/或分离，所述的获得所述的抗pd-1纳米抗体。
[0066]
在另一优选例中，所述纯化可以通过蛋白a亲和柱纯化分离获得目标抗体。
[0067]
在另一优选例中，所述经过纯化分离后的目标抗体纯度大于95％，大于96％、大于97％、大于98％、大于99％，优选为100％。
[0068]
在本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
[0069]
(a)第一方面所述的抗pd-1纳米抗体的vhh链、第二方面所述的抗pd-1纳米抗体、本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体或本发明第四方面所述的双特异性抗体；和
[0070]
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或vlp、或其组合。
[0071]
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
[0072]
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：tc-99m、ga-68、f-18、i-123、i-125、i-131、in-111、ga-67、cu-64、zr-89、c-11、lu-177、re-188、或其组合；和/或
[0073]
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：lu-177、y-90、ac-225、as-211、bi-212、bi-213、cs-137、cr-51、co-60、dy-165、er-169、fm-255、au-198、ho-166、i-125、i-131、ir-192、fe-59、pb-212、mo-99、pd-103、p-32、k-42、re-186、re-188、sm-153、ra223、ru-106、na24、sr89、tb-149、th-227、xe-133 yb-169、yb-177、或其组合。
[0074]
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
[0075]
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
[0076]
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、dna小沟结合试剂、dna复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
[0077]
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，dna小沟结合试剂、dna烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如dm1和dm4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(pbds)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
[0078]
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：
[0079]
耳他汀类(例如，耳他汀e、耳他汀f、mmae和mmaf)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素a-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(pe)a、pe40、相思豆毒素、相思豆毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
[0080]
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
[0081]
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒。
[0082]
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的本发明第一方面所述的抗pd-1纳米抗体的vhh链、本发明第二方面所述的抗pd-1纳米抗体、本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体。
[0083]
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的本发明第一方面所述的抗pd-1纳米抗体的vhh链、本发明第二方面所述的抗pd-1纳米抗体、或本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体。
[0084]
在本发明的第十方面，提供了本发明第二方面所述的抗pd-1纳米抗体或本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体的用途，用于制备(a)用于检测pd-1分子的试剂；(b)用于制备治疗肿瘤的药物。
[0085]
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为诊断用同位素。
[0086]
在另一优选例中，所述的试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。
[0087]
在另一优选例中，所述检测pd-1分子的试剂为(体内)检测pd-1分子的造影剂。
[0088]
在另一优选例中，所述的检测为体内检测或体外检测。
[0089]
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
[0090]
在另一优选例中，所述的药物用于阻断pd-1和pd-l1的相互作用。
[0091]
在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，含有：(i)如本发明第一方面所述的vhh链、如本发明第二方面所述的抗pd-1纳米抗体、如本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体、如本发明第四方面所述的双特异性抗体、或如本发明第九方面所述的免疫偶联物；以及(ii)药学上可接受的载体。
[0092]
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为药物、毒素、和/或治疗用同位素。
[0093]
在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有治疗肿瘤的其他药物，如细胞毒性药物。
[0094]
在另一优选例中，所述的治疗肿瘤的其他药物包括紫杉醇、多柔比星、环磷酰胺、阿西替尼、乐伐替尼、或派姆单抗。
[0095]
在另一优选例中，所述的药物组合物用于阻断pd-1和pd-l1的相互作用。
[0096]
在另一优选例中，所述的药物组合物用于阻断pd-1/pd-l1信号通路。
[0097]
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
[0098]
另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗表达pd-l1蛋白(即pd-l1阳性)的肿瘤。
[0099]
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
[0100]
本发明的第十二方面，提供了本发明第二方面所述的抗pd-1纳米抗体或本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体的一种或多种的用途：(i)用于检测人pd-1分子；(ii)用于流式检测；(iii)用于细胞免疫荧光检测；(iv)用于治疗肿瘤；(v)用于肿瘤诊断；(vi)用于阻断pd-1和pd-l1的相互作用。
[0101]
在另一优选例中，所述的肿瘤为表达pd-l1蛋白(即pd-l1阳性)的肿瘤。
[0102]
在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。
[0103]
在本发明的第十三方面，还提供了一种抗体，所述抗体具有：如本发明第一方面所述的重链可变区vhh。
[0104]
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗pd-1蛋白的抗体。
[0105]
在另一优选例中，所述抗体为纳米抗体。
[0106]
在本发明的第十四方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：(i)如本发明第一方面所述的vhh的序列、如本发明第二方面所述的纳米抗体的序列、或本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体的序列；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[0107]
在另一优选例中，所述的标签序列包括6his标签、ha标签和fc标签。
[0108]
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于pd-1蛋白。
[0109]
在本发明的第十五方面，提供了如本发明第一方面所述的vhh链、如本发明第二方面所述的纳米抗体、如本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体、或如本发明第九方面所述的免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中pd-1蛋白；其中，所述药剂用于治疗或预防表达pd-l1蛋白(即pd-l1阳性)的肿瘤。
[0110]
在另一优选例中，所述肿瘤包括：结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌、胃癌、淋巴瘤、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。
[0111]
在本发明的第十六方面，提供了一种检测样品中pd-1蛋白的方法，所述方法包括步骤：(1)将样品与本发明第二方面所述的纳米抗体或本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体接触；(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在pd-1蛋白。
[0112]
在本发明的第十七方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用本发明二方面所述的纳米抗体、本发明第三方面所述的抗pd-1多价抗体、本发明第四方面所述的双特异性抗体、或本发明第九方面所述的免疫偶联物。
[0113]
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。
[0114]
在本发明的第十八方面，提供了一种pd-1蛋白检测试剂，所述的检测试剂包含本
发明第九方面所述的免疫偶联物和检测学上可接受的载体。
[0115]
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为诊断用同位素。
[0116]
在另一优选例中，所述的检测学上可接受的载体为无毒的、惰性的水性载体介质。
[0117]
在另一优选例中，所述的检测试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。
[0118]
在另一优选例中，所述的检测试剂用于体内检测。
[0119]
在另一优选例中，所述的检测试剂的剂型为液态或粉状(如水剂，针剂，冻干粉，片剂，含服剂，吸雾剂)。
[0120]
本发明的第十九方面，提供了一种检测pd-1蛋白的试剂盒，所述试剂盒含有本发明第九方面所述的免疫偶联物或本发明的第十八方面所述的检测试剂，以及说明书。
[0121]
在另一优选例中，所述的说明书记载，所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的pd-1表达。
[0122]
在本发明的二十方面，提供了一种本发明第九方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备体内检测pd-1蛋白的造影剂。
[0123]
在另一优选例中，所述检测用于癌症的诊断或预后。
[0124]
在本发明的第二十一方面，提供了一种car-t细胞，所述car-t细胞表达嵌合抗原受体car，所述car的抗原结合结构域具有如本发明第二方面所述的抗pd-1纳米抗体。
[0125]
在本发明的第二十二方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第二十一方面所述的car-t细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0126]
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
[0127]
在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。
[0128]
在另一优选例中，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，较佳地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
[0129]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0130]
图1显示了pd-1胞外段融合fc蛋白的凝胶电泳sds-page结果。结果表明：获得的pd-1(ecd)-fc蛋白的纯度达到90％以上。
[0131]
图2显示了构建的pd-1免疫文库的库容检测结果。经过梯度稀释文库，铺板计算该文库的库容为2.2
×
109cfu。
[0132]
图3显示了从pd-1免疫文库中淘选纳米抗体的富集过程。结果表明：经过六轮噬菌体展示筛选，pd-1纳米抗体噬菌体达到21.3倍富集。
[0133]
图4显示了pd-1过表达的chozn细胞构建结果。流式细胞术检测结果表明：构建的chozn稳转细胞株能够高表达人pd-1，可用于后续研究。
[0134]
图5显示了流式细胞术检测阻断型pd-1纳米抗体的结果。结果表明：筛选得到一株纳米抗体能够阻断pd-1/pd-l1相互作用。
[0135]
图6显示了流式细胞术检测pd-1纳米抗体的ic
50
结果。结果表明：pd-1纳米抗体的
i
c50
为1.305ug/ml，对照抗体keytruda的ic
50
为1.339ug/ml。
[0136]
图7显示了流式细胞术检测pd-1纳米抗体的ec
50
结果。结果表明：pd-1纳米抗体的ec
50
为1.064ug/ml，对照抗体keytruda的e
c50
为1.113ug/ml。
[0137]
图8显示了流式细胞术检测人源化pd-1纳米抗体的ic
50
结果。结果表明：人源化pd-1纳米抗体的ic
50
为1.035ug/ml，对照抗体keytruda的ic
50
为1.169ug/ml。
[0138]
图9显示了利用luciferase reporter assay检测人源化抗体的生物活性结果。结果表明：人源化pd-1纳米抗体的生物学活性良好，其ec
50
为0.6986ug/ml。
[0139]
图10显示了利用luciferase reporter assay检测人源化多价pd-1纳米抗体的生物活性结果。结果表明：多价pd-1纳米抗体抗体的阻断活性较二价pd-1纳米抗体抗体具有显著提升。
[0140]
图11显示了人源化抗体在人源化小鼠结肠癌模型中药效研究的肿瘤体积统计结果。结果表明：人源化纳米抗体(抗体c)的肿瘤抑制率为91％，优于对照抗体keytruda的抗肿瘤活性。
[0141]
图12显示了人源化抗体在人源化小鼠结肠癌模型中药效终点的肿瘤重量统计结果。结果表明：人源化纳米抗体(抗体c)和对照抗体keytruda组的肿瘤重量显著低于阴性对照组，且(抗体c)用药后的小鼠肿瘤更小，其药效更显著。
具体实施方式
[0142]
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一类抗pd-1纳米抗体，实验结果表明，本发明的纳米抗体与pd-1分子有较好的结合活性，同时能够阻断pd-1与pd-l1的相互作用，具有良好的抗肿瘤活性。在此基础上完成了本发明。
[0143]
具体地，本发明利用人源的pd-1抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将pd-1蛋白分子偶联在酶标板上，展示pd-1蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了pd-1特异性的纳米抗体基因。再将此基因转至哺乳动物细胞中，从而获得了能在哺乳动物细胞中高效表达的的纳米抗体株。然后通过elisa、流式细胞术、荧光素酶报告基因检测系统等方法鉴定出具有阻断活性的pd-1纳米抗体，通过小鼠肿瘤模型验证该候选抗体具有显著的抗肿瘤活性。
[0144]
术语
[0145]
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
[0146]
如本文所用，术语“本发明的纳米抗体”、“pd-1抗体”、“pd-1纳米抗体”具有相同的含义，均指特异性识别和结合于pd-1(包括人pd-1)的纳米抗体。优选地，本发明的纳米抗体的可变区具有seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、和seq id no:3所示的cdr3。更优选地，本发明的纳米抗体的框架区具有(a)seq id no:4所示的fr1、seq id no:5所示的fr2、seq id no:6所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4，或(b)seq id no:10所示的fr1、seq id no:11所示的fr2、seq id no:12所示的fr3、和seq id no:13所示的fr4。
[0147]
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的
异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。存在两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链种类(或同型)，其决定抗体分子的功能活性：igm、igd、igg、iga和ige。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区，可变结构域(vl)和恒定结构域(cl)。重链包括四个结构域，重链可变区(vh)和三个恒定区(ch1、ch2和ch3，统称为ch)。轻链(vl)和重链(vh)的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(cl)和重链的恒定区(ch)赋予重要的生物性质如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合和与fc受体(fcr)的结合。fv片段是免疫球蛋白fab片段的n-末端部分且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(cdr)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(fr)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或cdr指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个cdr，分另称为cdr1-l、cdr2-l、cdr3-l和cdr1-h、cdr2-h、cdr3-h。常规抗体抗原结合位点因此包括六个cdr，包含来自每个重链和轻链v区的cdr集合。
[0148]
如本文所用，术语“纳米抗体vhh”、“纳米抗体nanobody”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(vhh)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(vhh)。
[0149]
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等,nih publ.no.91-3242,卷i，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
[0150]
如本文所用，术语“框架区”(fr)指插入cdr间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个fr，分别称为fr1-l、fr2-l、fr3-l、fr4-l和fr1-h、fr2-h、fr3-h、fr4-h。相应地，轻链可变结构域可因此称作(fr1-l)-(cdr1-l)-(fr2-l)-(cdr2-l)-(fr3-l)-(cdr3-l)-(fr4-l)且重链可变结构域可因此表示为(fr1-h)-(cdr1-h)-(fr2-h)-(cdr2-h)-(fr3-h)-(cdr3-h)-(fr4-h)。优选地，本发明的fr是人抗体fr或其衍生物，所述人抗体fr的衍生物与天然存在的人抗体fr基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0151]
获知cdr的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区fr1-l、fr2-l、fr3-l、fr4-l和/或fr1-h、fr2-h、fr3-h、fr4-h。
[0152]
如本文所用，术语
″
人框架区
″
是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约
85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
[0153]
如本文所用，术语“亲和力”理论上通过完整抗体和抗原间的平衡缔合来定义。本发明纳米抗体的亲和力可以通过kd值(解离常数)(或其它测定方式)进行评估或测定，例如生物膜层干涉技术(bio-layer interferometry bli)，使用fortebiored96仪器测量确定。
[0154]
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗pd-1纳米抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0155]
如本文所用，术语“重链可变区”与“v
h”可互换使用。
[0156]
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determining region,cdr)”可互换使用。
[0157]
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区cdr1、cdr2、和cdr3。
[0158]
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
[0159]
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合pd-1蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
[0160]
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
[0161]
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(cdr)，将该段间隔成4个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了fr或cdr区域。
[0162]
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带cdr的抗体重链可变区的分子，只要其cdr与此处鉴定的cdr具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
[0163]
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
[0164]
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6his标签形成的融合蛋
白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0165]
本发明抗体指具有pd-1蛋白结合活性的、包括上述cdr区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述cdr区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
[0166]
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0167]
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
[0168]
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0169]
表1
[0170]
最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serphe
val(v)ile；leu；met；phe；alaleu
[0171]
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
[0172]
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0173]
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0174]
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2
×
ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
[0175]
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。
[0176]
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
[0177]
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0178]
本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0179]
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。
[0180]
用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
[0181]
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)
诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0182]
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0183]
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、pk(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
[0184]
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
[0185]
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如il-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
[0186]
药物组合物
[0187]
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
[0188]
本发明的药物组合物可直接用于结合pd-1蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
[0189]
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0190]
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0191]
标记的纳米抗体
[0192]
在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
[0193]
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗pd-1的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。
[0194]
本发明的抗pd-1纳米抗体具有很好的特异性，很高的效价。
[0195]
检测方法
[0196]
本发明还涉及检测pd-1蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中pd-1蛋白的水平。
[0197]
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
[0198]
试剂盒
[0199]
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
[0200]
本发明还提供了用于检测pd-1水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别pd-1蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
[0201]
应用
[0202]
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与pd-1相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对pd-1的临床诊断和靶向治疗，如肿瘤治疗。
[0203]
本发明的主要优点包括：
[0204]
(a)本发明纳米抗体特异性针对人的具有正确空间结构的pd-1蛋白。
[0205]
(b)本发明纳米抗体具有良好的阻断pd-1/pd-l1活性。
[0206]
(c)本发明纳米抗体具有显著的抗肿瘤活性。
[0207]
(d)本发明纳米抗体的生产简便。
[0208]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0209]
实施例1：人pd-1蛋白的表达纯化
[0210]
人pd-1蛋白的表达纯化的方法如下：
[0211]
(1)将人pd-1的核苷酸序列合成在pcdna3.1(-)载体上，然后将其胞外段序列亚克隆至pfuse-igg1载体上；(2)用omega质粒大提试剂盒提取构建的pfuse-igg1-hpd-1(ecd)质粒；(3)培养hek293f细胞至od为2.0
×
106个/ml；(4)将质粒与转染试剂pei 1:3混合均匀后静置20min，然后加入到hek293f细胞中，37℃，6％co2摇床培养箱中培养5-6天；(5)收集细胞上清，与protein a珠子在室温下结合1h；(6)用磷酸盐缓冲液ph 7.0洗涤珠子后，再用0.1m ph3.0 glycine洗脱蛋白；(7)将洗脱的蛋白超滤至pbs中，测定产量后取样进行sds-page检测。
[0212]
检测结果如图1所示，该蛋白hpd-1(ecd)-fc纯度达到90％以上，剩余蛋白保存于-80℃冰箱备用。
[0213]
实施例2：pd-1纳米抗体文库的构建及筛选
[0214]
文库构建方法如下：
[0215]
(1)将1mg hpd-1(ecd)-fc抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激b细胞表达抗原特异性的纳米抗体；(2)7次免疫结束后，提取100ml骆驼外周血淋巴细胞并提取总rna；(3)合成cdna并利用套式pcr扩增vhh；(4)利用限制性内切酶pst i及not i酶切20μg pmecs噬菌体展示载体(biovector供应)及10μg vhh并连接两个片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞tg1中，构建pd-1纳米抗体文库并测定库容。
[0216]
结果如图2所示，库容大小为2.2
×
109cfu。
[0217]
随机挑取24颗克隆进行菌落pcr检测，结果显示所建文库的插入率为95.8％。
[0218]
抗体筛选鉴定方法如下：
[0219]
(1)将溶解在100mm nahco3、ph 8.2中的10μg hpd-1(ecd)-fc抗原(10μg fc in nahco3作为对照)偶联在nunc酶标板上，4℃放置过夜；(2)第二天加入100μl0.1％bsa，室温封闭2h；(3)2h后，加入100μl噬菌体(2
×
10
11
cfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，室温作用1h；(4)用0.05％pbs+tween-20洗5遍，以洗掉非特异的噬菌体；(5)用100mm三乙醇胺将与pd-1特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌tg1细胞，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复6轮使阳性的克隆被富集。(6)从富集后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选200个单个菌落并接种于含有100μg/ml的氨苄青霉素的tb培养基(1l tb培养基中含有2.3g kh2po4，12.52g k2hpo4，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4ml甘油中，生长至对数期后，加终浓度1mm的iptg，28℃培养过夜。(7)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的elisa板中，在室温下放置1h。(8)用pbst洗去未结合的抗体，加入鼠抗ha抗体(covence)，在室温下放置1h。(9)用pbst洗去未结合的抗体，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，在室温下放置1h。(10)用pbst洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于elisa仪上，在405nm波长，读取吸收值。(11)当样品孔od值大于对照孔od值3倍以上时(ratio+/-＞3)，判为阳性克隆孔。(12)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/ml amp的lb液体中以便提取质粒并进行测序。
[0220]
阳性克隆的富集结果如图3所示，结果显示，经过六轮噬菌体展示筛选，pd-1纳米抗体噬菌体达到21.3倍富集。
[0221]
将测序结果不同的抗体菌株保存，并用于后续功能型抗体筛选。
[0222]
实施例3：pd-1过表达细胞株的构建和鉴定
[0223]
构建和鉴定方法如下：
[0224]
(1)复苏chozn细胞，并于co2培养箱培养过夜(5％co2，37℃)。(2)将包装质粒和目的质粒按照合适的比例与转染试剂混匀后加入到chozn细胞中。(3)分别在转染后的48小时和72小时收集病毒上清。(4)用浓缩试剂与病毒上清按照一定的比例混合，每半小时混匀一次，4℃保存过夜。(5)4000rpm离心半小时，去上清，将沉淀用目标培养基重悬后加入到chozn细胞中。(6)48小时后加入合适浓度的puromycin进行筛选。(7)根据细胞的生长情况每隔一天或者两天更换含puromycin的新鲜培养基，直至很少有细胞继续死亡。(8)分别取构建前后的chozn细胞，用hpd-l1-biotin进行染色合适的时间后，再用sa-pe染色一定的时间，最后用bd calibur流式细胞仪道进行检测。
[0225]
结果如图4所示，构建前的chozn细胞不与低浓度的hpd-l1-biotin结合；构建后的chozn/pd-1细胞能够与pd-l1-biotin结合，说明pd-1过表达的chozn细胞构建成功，可以用来后续pd-1纳米抗体的筛选。
[0226]
实施例4：阻断型pd-1纳米抗体细胞水平初筛
[0227]
初筛方法如下:
[0228]
(1)将测序正确的不同克隆株接种于1ml含有合适浓度的氨苄青霉素的tb培养基中，37℃恒温摇床培养至对数生长期时加入iptg诱导剂，28℃诱导16h；(2)16h之后，利用渗透压冲击法破碎菌体，获得纳米抗体粗提液；(3)每个样品取1
×
106个chozn/pd-1细胞重悬于0.5％bsa-pbs buffer中，分别加入上述pd-1纳米抗体粗提液200μl，同时设置阴性对照(gfp nb)，所有样本加入合适浓度的hpd-l1-biotin，4℃孵育20min；(5)1
×
pbs洗涤2次，加sa-pe，4℃避光孵育20min，1
×
pbs洗涤2次细胞后用流式细胞仪(bd caliber)检测。
[0229]
结果如图5所示，初步筛选到一株具有良好阻断效果的pd-1纳米抗体。
[0230]
实施例5：pd-1纳米抗体在真核细胞hek293中的表达纯化及流式细胞术检测纳米抗体的阻断功能
[0231]
在真核细胞hek293f中表达pd-1nb-fc融合蛋白的方法如下：
[0232]
(1)将测序结果正确的pd-1nb序列克隆至pfuse-igg4载体(购自invivogen)，用omega质粒大提试剂盒提取质粒；(2)培养hek293f细胞至od为2.0
×
106个/ml；(3)将质粒与转染试剂pei按照1:3混合均匀后静置20min，然后加入到hek293f细胞中，37℃，6％co2摇床培养箱中培养5-6天；(4)收集细胞上清，与protein a珠子在室温下结合1h；(5)用磷酸盐缓冲液ph 7.0洗涤珠子后，再用0.1m ph 3.0glycine洗脱蛋白；(6)将洗脱的蛋白超滤至pbs中，测定产量后取样进行sds-page检测
[0233]
结果显示，pd-1nb-fc融合蛋白在真核细胞hek293f中成功表达，将剩余蛋白保存于-80℃冰箱备用。
[0234]
流式细胞术鉴定纳米抗体阻断功能的方法如下：
[0235]
(1)每个样品取5
×
105个pd-1稳转细胞chozn/pd-1于0.5％bsa-pbs buffer中，加入梯度稀释的pd-1nb，及对照抗体keytruda(抗体稀释梯度为40ug/ml，20ug/ml，10ug/m，5ug/ml，2.5ug/ml，1.25ug/ml，0.625ug/ml，0.3125ug/ml，0.1563ug/ml，0.07813ug/ml，0.0391ug/ml)，每个样品加入100ul，所有样本中同时加入50ug/ml hpd-l1-biotin，4℃孵育20min；(2)pbs洗涤2次细胞，加入sa-pe，4℃孵育20min，pbs洗涤2次细胞后用流式细胞仪(bd calibur)检测，使用graphpad prism 6软件进行数据处理。
[0236]
结果如图6所示，pd-1nb的ic
50
为1.305ug/ml，而对照抗体keytruda的ic
50
为1.339g/ml。pd-1纳米抗体的阻断活性与对照抗体相近。
[0237]
实施例6：pd-1纳米抗体细胞水平结合活性分析
[0238]
分析方法如下：
[0239]
(1)每个样品取5
×
105个chozn/pd-1稳转细胞于0.5％bsa-pbs buffer中，加入梯度稀释的pd-1nb，及对照抗体keytruda(抗体稀释梯度为160ug/ml，80ug/ml，40ug/ml，20ug/ml，10ug/m，5ug/ml，2.5ug/ml，1.25ug/ml，0.625ug/ml，0.3125ug/ml，0.1563ug/ml，0.0781ug/ml)，每个样品加入100ul，4℃孵育20min；(2)pbs洗涤2次细胞，加入anti human igg-fitc，4℃孵育20min，pbs洗涤2次细胞后用流式细胞仪(bd calibur)检测，使用graphpad prism 6软件进行数据处理。
[0240]
结果如图7所示，pd-1nb的ec
50
为1.064ug/ml，而对照抗体keytruda的ec
50
为1.113ug/ml。
[0241]
实施例7：pd-1纳米抗体的人源化改造
[0242]
首先，以seq id no:8所示的pd-1纳米抗体序列为模板在结构数据库中同源结构的搜索，取其中e value＝0.0并且序列等同性≥70％的结构；其次，对这些结构进行结构比对，并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树，最终选取包括3dwt在内的蛋白，进行基于seq id no:8所示的pd-1纳米抗体序列的多模板同源模建，再依据打分函数的高低排序，选取molpdf最低的结构，继续下面的工作；然后对模建的最优结构，利用protsa服务器计算残基的溶剂可接触性，即残基的折叠态相对于去折叠态的溶剂可接触面积的比值为判据，取大于40％的残基为暴露于溶剂外的残基；最后，对模建的最优结构和dp-47进行序列比对，替换相应的暴露于溶剂的残基。
[0243]
最终确定获得一种人源化pd-1纳米抗体，由seq id no:14所示的氨基酸序列编码。人源化前后抗体序列对应如下表1：
[0244]
表1
[0245][0246]
实施例8：人源化pd-1纳米抗体(hunb-fc)细胞水平阻断活性分析
[0247]
将实施例7制备的人源化纳米抗体与人fc蛋白融合，将hunb-fc氨基酸序列(seq id no:16)按照人密码子优化后的碱基序列(seq id no:17)合成至pcdna3.1(-)载体上，然后按照实施例1中的方法表达纯化出hunb-fc抗体。将纯化的抗体用于活性检测实验。
[0248]
具体方法参考实施例5。
[0249]
结果如图8所示，hunb-fc细胞水平的ic
50
为1.169ug/ml，与对照抗体ketytruda的阻断活性相近。
[0250]
实施例9：人源化pd-1纳米抗体(hunb-fc)pd-1/pd-l1报告基因分析
[0251]
分析方法如下
[0252]
(1)取accutase酶消化gs-c2/pd-l1细胞3-5min，用f12k完全培养基中和accutase酶，800rpm，5min离心，弃上清，再用2ml f12k完全培养基重悬，计数，取相应体积到细胞加样槽，终浓度为5
×
105个/ml，充分混匀，将混匀好的细胞溶液用排枪转移到对应的384孔板，37℃，5％co2培养箱孵育过夜。(2)第二天，抗体样品稀释。吸弃gs-c2/pd-l1细胞培养
基，将稀释混匀好的抗体样品用排枪转移到对应的384孔板。(3)计算实验所需的gs-j2/pd-1细胞数目。将gs-j2/pd-1细胞离心，弃上清，1％assay buffer重悬，将混匀好的细胞溶液转移到对应的384孔板，37℃，5％co2培养箱孵育6h。(4)读板：先取适量体积one-glo
tm luciferase assay system的溶液至加样槽，30ul/孔，室温避光孵育5-10min，biotek机器调至生物发光模式检测。
[0253]
结果如图9所示，hunb-fc与keytruda具有相似的生物学活性。
[0254]
实施例10：人源化多价pd1纳米抗体的构建及活性分析
[0255]
为了进一步提高人源化抗体的阻断活性，尝试构建多价体后进行活性分析，其结构如下所示：
[0256]
a：hunb-l1-hunb-fc(氨基酸序列见seq id no:18，碱基序列见seq id no:21)，
[0257]
b：hunb-l2-hunb-fc(氨基酸序列见seq id no:19，碱基序列见seq id no:22)，
[0258]
c：hunb-l3-hunb-fc(氨基酸序列见seq id no:20，碱基序列见seq id no:23)，
[0259]
d：hunb-l1-hunb-l1-hunb-fc(氨基酸序列见seq id no:24，碱基序列见seq id no:27)，
[0260]
e：hunb-l2-hunb-l2-hunb-fc(氨基酸序列见seq id no:25，碱基序列见seq id no:28)，
[0261]
f：hunb-l3-hunb-l3-hunb-fc(氨基酸序列见seq id no:26，碱基序列见seq id no:29)，
[0262]
其中，hunb指实施例7制备的人源化pd1纳米抗体，l1指连接子gs，l2指连接子(4gs)2，l3指连接子(4gs)4。
[0263]
将以上形式多价抗体的碱基序列合成至pcdna3.1(-)载体上，然后利用实施例1中的方法将各种抗体表达纯化，然后利用实施例9的检测方法进行阻断活性分析。
[0264]
结果如图10所示：以上多价抗体的活性较二价抗体hunb-fc(seq id no:16)均具有显著提升，其中c结构的4价抗体及e结构的6价抗体的阻断活性较佳，后续将选择c结构的抗体进行进一步验证。
[0265]
实施例11：人源化pd-1纳米抗体体内药效研究
[0266]
对hpd-1转基因小鼠接种mc38细胞，成瘤后分为三组，每组8只进行给药(阴性对照组：pbs；阳性对照组：keytruda；实验组：实施例10制备的抗体c。给药频率：每三天1次，连续给药7次。给药剂量：10mg/kg。
[0267]
实验结果如图11所示：抗体c有显著的肿瘤抑制效果，其肿瘤抑制率tgi为91％，且有一只小鼠肿瘤完全消退，其肿瘤抑制效果显著优于keytruda(tgi为60％。图12显示了小鼠处死后剥瘤称重的结果，可以看出抗体c组的小鼠瘤重显著低于keytruda组和阴性对照组。
[0268]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。