本发明属于天然色素提取
技术领域：
，具体涉及一种从藻类中提取叶黄素的方法，以及含有提取产物的组合物。
背景技术：
：叶黄素又名3，3’-二羟基-α-胡萝卜素，分子式为c40h56o2，是广泛存在于蔬菜、花卉、水果与某些藻类生物中的一种天然类胡萝卜素，常被用作天然的食品色素和食品营养剂，具有明显的抗氧化、抗衰老和抗突变等生物学效应，在很多方面有着广泛的生物活性，也常被用作家畜禽、动物组织的增色剂而被用于禽畜饲料中。由于其基本结构式2个六元碳环由1个含有十八个碳原子的共轭双键的长链相连接，具有3个手性中心、有多达八种立体异构体，因此很难采用化学方法合成，目前最为常见的天然叶黄素提取来源是万寿菊，然而大规模的万寿菊种植需要占用大面积更低且存在生产效率低下的问题，且容易受到季节、气候及地域等条件的限制，因此应当寻求其它的天然叶黄素提取来源。藻类中含有较高含量的叶黄素，且易于养殖或从海洋中获取，不仅能够提高生物质综合利用度，还可实现“变废为宝”、最大程度提高海洋副产物利用度，实现海洋变“良田”。到目前为止所发现的富含叶黄素的藻类主要为微藻，包括小球藻(chlorella)、muriellopsissp.和栅藻(scenidesmus)等，基本上均属绿藻门(chlorophyta)的微藻，而对于同属绿藻门的石莼科绿藻浒苔关注度和利用度都较低。而实际上，浒苔在我国分布广泛，资源十分丰富，且近年来由于海水富营养化程度提高为浒苔的生长繁殖提供了有利的生存条件，浒苔已经成为严重威胁我国近海生态安全系统的物种，而此时如果能找到一种既能有效利用海阳藻类资源又能获取可用于禽畜饲料的天然色素的两全其美的方法，就显得十分重要了。申请号为cn200510010041.x的申请中公开了一种从万寿菊花中提取叶黄素的工艺，将万寿菊与萃取溶剂按一定比例通过输送机送到平台式旋转浸出器中，浸出后通过三级过滤、水洗、沉淀、脱胶、脱糖、蒸发浓缩等工序制备得到叶黄素，但其存在工序繁杂、叶黄素收率低的问题，并且需要额外添加乙氧基喹啉，而乙氧基喹啉虽然价格较低、也属于常用的饲料抗氧化剂，但由于其制备过程中不可避免地需要使用甲苯、丙酮等溶剂因此会引入不必要的杂质，并且美国fda对其有明确的添加量限制（150mg/kg），因此会极大地限制叶黄素的制备和推广使用。申请号为cn200910010694.6的申请中公开了一种从万寿菊颗粒中提取叶黄素的方法，具体公开了以有机溶剂抽取万寿菊粉末后将提取液蒸馏浓缩，再加入相转移催化剂和碱溶液、加酸调节再用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，后处理后得到叶黄素的方法。但该方法为了避免叶黄素与空气中氧的接触而导致叶黄素降解和出现异构体，采用了全程氮气保护的方法，会导致生产成本较高、不利于工业化生产，并且在生产过程中需要使用相转移催化剂等及大量的碱，会给后续废水处理带来较大的压力。晨光生物科技集团股份有限公司在申请号为cn201210257183.6的申请中公开了由万寿菊花颗粒制备晶体叶黄素的方法，具体为向万寿菊花颗粒中加入碱水溶液进行皂化，再用烷烃类溶剂去脂、四氢呋喃萃取，再经重结晶得到叶黄素晶体。该方法直接向未经处理的万寿菊颗粒加入碱水溶液，存在效率低下以及叶黄素容易降解的问题，其产品得率至高约为82%、其中全反式叶黄素纯度至高为83%。综上所述，目前并无一种以藻类为原材料的提取叶黄素且产物中叶黄素全反式体含量高的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种从藻类中提取叶黄素的方法，本发明技术方案制备得到的色素具有有效体含量高、收率高，且有效体含量稳定、不易转变构型，实现了“变废为宝”、使丰富的藻类资源得到有效合理的利用，同时又能有效改善禽畜产品的色泽和营养度。本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种从藻类中提取叶黄素的方法，具体步骤如下；1）将藻类经前处理后酶解，得酶解产物；2）将步骤1）得到的酶解产物灭活，并加入溶剂经回流提取后得粗品溶液；3）将步骤2）得到的粗品溶液脱溶剂后经后处理即得产品；进一步地，所述步骤1）具体为：将藻类清洗后在低温条件下破碎，加入复合酶溶液，在40-50℃条件下酶解1-10h后静置或离心后取上清液即为酶解产物；再进一步地，加入复合酶溶液前加含有0.01%span-80的水溶液浸泡破碎后的藻类，浸泡温度为5-10℃，浸泡时间为0.5-3h；再进一步地，所述藻类为微藻或浒苔；进一步地，所述复合酶溶液的具体组成为：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶质量比为1-5:1-3:1-3的质量浓度为0.5-3%的水溶液；再进一步地，纤维素酶为45iu/mg、半纤维素酶为45iu/mg、果胶酶为60iu/mg；进一步地，所述步骤2）具体为：将步骤1）得到的酶解产物加入稳定剂后加热至60-80℃并保温5-20min使酶灭活，加入溶剂回流提取2-5h后得粗品溶液；进一步地，所述稳定剂具有酚羟基结构；再进一步地，所述的稳定剂为白藜芦醇和/或茶多酚；再进一步地，所述的稳定剂为白藜芦醇；进一步地，所述溶剂为氯仿、正己烷、乙醇、四氢呋喃、石油醚中的一种或几种；再进一步地，所述溶剂为氯仿、正己烷、四氢呋喃、石油醚与乙醇的混合物或进一步地，步骤3）中粗品溶液脱溶剂前向粗品溶剂中加入碱性试剂；再进一步地，所述碱性试剂为氢氧化钠。本发明还提供了一种饲料组合物，含有如上所述的方法制备得到的叶黄素；进一步地，还含有白藜芦醇和/或茶多酚；再进一步地，优选为白藜芦醇；再进一步地，白藜芦醇和/或茶多酚的总质量与叶黄素的质量比为1:5-30；再进一步地，所述饲料组合物中全反式构型叶黄素占所有构型叶黄素的90%以上；进一步地，还含有长链不饱和脂肪酸盐；再进一步地，所述长链不饱和脂肪酸盐为亚油酸钠。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：（1）叶黄素所有构型中生物活性相对较高的构型为全反式构型，藻类植物中的叶黄素的全反式构型比例较高，但全反式构型的稳定度欠佳，在传统的叶黄素提取方法中较易出现构型转变的情况（例如加热、搅拌等），申请人意外地发现在叶黄素提取过程中加入具有酚羟基结构的化合物能与叶黄素形成氢键，从而有效提高全反式构型叶黄素的稳定度，且能最大程度地降低叶黄素的氧化损失，并且在回流条件下亦能保持稳定，更有利于叶黄素以全反式构型存在；（2）针对提取原料的特性采用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的复合酶溶液体系使得细胞壁破坏更为充分、细胞内物质可以完全溶出，更有利于后续提取过程的进行；（3）通过采用加入斯盘-80的水溶液浸泡破碎的藻类颗粒，使得细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀等变化，从而更有利于提高后期酶解的效率，而低温浸泡能最大程度避免叶黄素的构型转变；回流提取过程中使用含有乙醇的溶剂，同样有利于叶黄素以全反式构型存在，进一步提高具有生物活性的叶黄素的提取率。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1以浒苔为原料提取叶黄素的方法具体操作如下：取100g浒苔（叶黄素含量经检测为2.23mg/g），清水冲洗并去除泥沙等杂质后，在5℃条件下破碎，加入0.5l配制好的复合酶溶液（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶质量比为5:3:2的质量浓度为3%的水溶液，其中纤维素酶为45iu/mg、半纤维素酶为45iu/mg、果胶酶为60iu/mg），在50℃条件下酶解1h，离心后取上清液，加入5%的白藜芦醇乙醇溶液10ml后轻轻振荡均匀，加热至80℃并保温10min使酶灭活。加入10l由正己烷和乙醇按照体积比1:9混合得到的溶剂加热至回流，提取3h得到粗品溶液。将得到的粗品溶液在-0.05mpa条件下减压蒸干后用无水乙醇淋洗1次，真空干燥得到黄色固体0.217g。经hplc检测，叶黄素收率为95.15%、含量99.48%，全反式叶黄素占全部叶黄素的95.47%。实施例2以浒苔为原料提取叶黄素的方法具体操作如下：取200g浒苔（叶黄素含量经检测为2.20mg/g），清水冲洗并去除泥沙等杂质后，在5℃条件下破碎，加入1.2l配制好的复合酶溶液（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶质量比为5:3:3的质量浓度为2%的水溶液，其中纤维素酶为45iu/mg、半纤维素酶为45iu/mg、果胶酶为60iu/mg），在50℃条件下酶解2h，离心后取上清液，加入5%的白藜芦醇乙醇溶液20ml后轻轻振荡均匀，加热至70℃并保温10min使酶灭活。加入20l由四氢呋喃和乙醇按照体积比1:9混得合到的溶剂加热至回流，提取3h得到粗品溶液。向得到的粗品溶液中加入15%的氢氧化钠水溶液10ml，然后在-0.05mpa条件下减压蒸干后用无水乙醇淋洗1次，真空干燥得到黄色固体0.432g。经hplc检测，叶黄素收率为97.21%、含量99.01%，全反式叶黄素占全部叶黄素的93.63%。实施例3以浒苔为原料提取叶黄素的方法具体操作如下：取100g浒苔（叶黄素含量经检测为2.21mg/g），清水冲洗并去除泥沙等杂质后，在5℃条件下破碎，加入0.6l配制好的复合酶溶液（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶质量比为5:3:3的质量浓度为2%的水溶液，其中纤维素酶为45iu/mg、半纤维素酶为45iu/mg、果胶酶为60iu/mg），在50℃条件下酶解2h，离心后取上清液，加入5%的茶多酚乙醇溶液10ml后轻轻振荡均匀，加热至80℃并保温10min使酶灭活。加入10l由四氢呋喃和乙醇按照体积比1:9混合得到的溶剂加热至回流，提取3h得到粗品溶液。将得到的粗品溶液在-0.02mpa条件下减压蒸干后用无水乙醇淋洗1次，真空干燥得到黄色固体0.217g。经hplc检测，叶黄素收率为96.45%、含量为98.22%，全反式叶黄素占全部叶黄素的90.68%。实施例4以小球藻为原料提取叶黄素的方法具体操作如下：取100g小球藻（叶黄素含量经检测为3.68mg/g），清水冲洗并去除泥沙等杂质后，在5℃条件下破碎，加入0.5l配制好的复合酶溶液（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶质量比为3:3:3的质量浓度为2%的水溶液，其中纤维素酶为45iu/mg、半纤维素酶为45iu/mg、果胶酶为60iu/mg），在50℃条件下酶解2h，离心后取上清液，加入5%的白藜芦醇乙醇溶液10ml后轻轻振荡均匀，加热至70℃并保温10min使酶灭活。加入10l由四氢呋喃和乙醇按照体积比1:9混合得到的溶剂加热至回流，提取3h得到粗品溶液。将得到的粗品溶液在-0.05mpa条件下减压蒸干后用无水乙醇淋洗1次，真空干燥得到黄色固体0.362g。经hplc检测，叶黄素收率为97.36%、含量为98.97%，全反式叶黄素占全部叶黄素的94.25%。对照例1以浒苔为原料提取叶黄素的方法具体操作如下：取100g浒苔（叶黄素含量经检测为2.19mg/g），清水冲洗并去除泥沙等杂质后，在5℃条件下破碎，加入0.6l配制好的复合酶溶液（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶质量比为5:3:3的质量浓度为2%的水溶液，其中纤维素酶为45iu/mg、半纤维素酶为45iu/mg、果胶酶为60iu/mg），在50℃条件下酶解2h，离心后取上清液，加热至70℃并保温10min使酶灭活。加入10l由四氢呋喃和乙醇按照体积比1:9混合得到的溶剂加热至回流，提取3h得到粗品溶液。将得到的粗品溶液在-0.02mpa条件下减压蒸干后用无水乙醇淋洗1次，真空干燥得到黄色固体0.211g。经hplc检测，叶黄素收率为95.21%、含量为98.83%，全反式叶黄素占全部叶黄素的72.49%。对照例2以浒苔为原料提取叶黄素的方法具体操作如下：具体操作与对照例1相同，区别之处在于以正己烷萃取6h代替四氢呋喃和乙醇的混合溶剂加热至回流，真空干燥得到黄色固体0.208g。经hplc检测，叶黄素收率为90.64%、含量95.43%，全反式叶黄素占全部叶黄素的69.67%。对照例3以浒苔为原料提取叶黄素的方法具体操作如下：具体操作与对照例1相同，区别之处在于回流溶剂为乙醇，真空干燥得到黄色固体0.188g。经hplc检测，叶黄素收率为83.37%、含量97.12%，全反式叶黄素占全部叶黄素的71.22%。实施例5蛋鸡试验：选取200羽36周龄的伊莎褐蛋鸡随机分为4组，每组5个重复，每重复10羽。设置预混料i组、预混料ii组，预混料iii组、对照组，均饲喂以基础日粮，基础日粮组成如下：小麦68.4%，豆粕17%，豆油4%，石粉6%，氨基酸0.50%，防霉剂0.03%，抗氧化剂0.03%，酶制剂0.04%，预混料4%。预混料i-iii组及对照组的预混料均由正大预混料(天津)有限公司研发中心提供，预混料i组的预混料中额外添加有250μg/g叶黄素，预混料ii组的预混料中额外添加有250μg/g叶黄素+50μg/g叶黄素白藜芦醇，预混料iii组的预混料中额外添加有250μg/g叶黄素+5μg/g叶黄素白藜芦醇+100μg/g亚油酸钠。预饲期为28d，在试验第5周的周末每个重复随机抽取5个鸡蛋，煮熟后用罗氏比色扇和日本柯尼卡美能达cr-10plus型色差仪测定蛋黄颜色。试验结果采用spss软件进行分析，用lsd法（leastsignificantdifference）做多重比较，数据用平均值±标准差表示。表1各试验组蛋鸡蛋蛋黄色泽对照试验结果分组rcfl值红度值黄度值预混料i组12.75.±1.46a55.47±3.85a12.97±1.93a60.75±2.86a预混料ii组15.43±0.32a53.89±2.66a15.48±2.33a63.13±3.25a预混料iii组16.57±1.35a52.31±4.54a16.45±2.86a64.27±4.48a对照组2.00±1.00b77.63±1.71b-3.15±0.15b42.45±1.64b由以上试验结果可见，预混料i、ii、iii组的rcf值、红度、黄度值均有明显提高，亮度值均有明显降低（p＜0.05），且各组间无显著差异。上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本
发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页12