一种检测生物制品中异嗜性小鼠白血病病毒的方法与流程

本发明涉及生物试剂盒技术领域，尤其涉及一种检测生物制品中异嗜性小鼠白血病病毒的方法。

背景技术：

为了提高生物制品临床使用的安全性，生产工艺要具有一定的去除或灭活部分病毒的能力，生产过程中应有特定的去除或灭活病毒的方法，而逆转录病毒是生物制品病毒安全性评价的一类重要病毒，异嗜性小鼠白血病病毒作为逆转录病毒的标志病毒，对其进行检测的方法是安全性评价中重要组成部分，传统的检测方法如细胞实验、动物抗体产生实验，方法复杂，耗时长。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够简单、快速的检测生物制品中异嗜性小鼠白血病病毒的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种检测生物制品中异嗜性小鼠白血病病毒的方法，以待检测生物制品中的rna为rna模板，采用上游引物、下游引物和标记有荧光基团的探针进行荧光定量pcr反应，采集荧光信号以确定所述待检测生物制品中的异嗜性小鼠白血病病毒的含量；其中，

所述上游引物的序列为cccttaaagataagattaaccc，或与其具有至少80%同源性的序列，优选具有至少85%的同源性，进一步优选具有至少90%的同源性，更优选具有至少95%的同源性；

所述下游引物的序列为ctctccaagtaacattgaag，或与其具有至少80%同源性的序列，优选具有至少85%的同源性，进一步优选具有至少90%的同源性，更优选具有至少95%的同源性；

所述探针的序列为cgttgtaccgaggctcctgc，或与其具有至少80%同源性的序列，优选具有至少85%的同源性，进一步优选具有至少90%的同源性，更优选具有至少95%的同源性。

优选地，所述上游引物的长度、所述下游引物的长度、所述探针的长度独立地为20~22bp。

优选地，所述上游引物的gc含量为30~40%，优选为36.36%。

优选地，所述下游引物的gc含量为35~45%，优选为40.00%。

优选地，所述探针的gc含量为60~70%，优选为65.00%。

其中，gc含量是指在dna的4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率。

优选地，所述上游引物的tm值为59.99~60.1℃，进一步优选为60℃。

优选地，所述下游引物的tm值为59.6~59.8℃，进一步优选为59.7℃。

优选地，所述探针的tm值为69~72℃，进一步优选为70.4℃。

优选地，所述探针的序列的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。

进一步优选地，所述的荧光报告基团为fam；所述的荧光淬灭基团为tamra或bhq。

优选地，确定所述待检测生物制品中的异嗜性小鼠白血病病毒的含量的方法为将采集的所述荧光信号代入标准曲线中进行确定，其中，所述标准曲线是以多个浓度的异嗜性小鼠白血病病毒rna标准品作为rna模板，采用所述上游引物、所述下游引物和所述探针对所述rna模板进行荧光定量pcr反应，采集荧光信号后建立的。

进一步优选地，所述异嗜性小鼠白血病病毒rna标准品的序列为cccuuaaagauaagauuaacccguggggcccccuaauaguuauggggaucuuggugagggcaggagccucgguacaacgugacagcccucaccagaucuucaauguuacuuggagag。

进一步优选地，所述多个浓度的rna标准品的浓度分别为2×10copies/μl、2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl中的多个。

优选地，进行所述荧光定量pcr反应的反应体系包括10μl2×onesteprt-pcrbufferⅲ、0.4μltakaraextaqhs、0.4μlprimescriptrtenzymemixⅱ、0.4μl所述上游引物、0.4μl所述下游引物、0.8μl所述探针、2μlrna模板、无rna酶水补足至20μl。

优选地，进行所述荧光定量pcr反应的反应条件为42℃/5min；95℃/30sec；95℃/5sec，60℃/30sec，共40个循环的逆转录反应；并在60℃退火延伸时采集所述荧光信号。

本发明的序列的书写方向自左至右为5’端到3’端。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

采用本发明的引物探针对待检测生物制品进行荧光定量pcr检测，具有简单快速，检测灵敏度高，重复性、准确性好，特异性强，回收率高的优点。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的试剂盒的应用的流程示意图；

图2为实施例1得到的扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl）；

图3为对比例1得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl）；

图4为对比例2得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl）；

图5为对比例3得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl）；

图6为对比例4得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl）；

图7为对比例5得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl）；

图8为对实施例2的样品进行扩增得到的扩增曲线示意图；

图9为以第一组引物和探针对标准品进行扩增得到的扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×10copies/μl、2×10²copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁹copies/μl）；

图10为实施例3的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

（1）从ncbi中找到异嗜性小鼠白血病病毒的env基因（人类免疫缺陷病毒膜蛋白基因）序列（基因库登录号为k00011.1）（seqidno.1）：

ccctctctccaagctcacttacaggccctccaagcagtacaacgagaggtctggaagcca

ctggccgctgcttatcaggaccagctggatcagccagtgataccacaccccttccgtgtc

ggtgacgccgtgtgggtacgccggcaccagactaagaacttagaaccccgctggaaagga

ccctacaccgtcctgctgaccacccccaccgctctcaaagtagacggcatctccgcgtgg

atacacgccgctcacgtaaaggcggcgacaactcctccagccggaacagcatggaaggtt

cagcgttctcaaaaccccttaaagataagattaacccgtggggccccctaatagttatgg

ggatcttggtgagggcaggagcctcggtacaacgtgacagccctcaccagatcttcaatg

ttacttggagagttaccaacctaatgacaggacaaacagctaacgccacctccctcctgg

ggacgatgacagacaccttccctaaactatattttgacctgtgtgatttagtaggagact

actgggatgacccagaacccgatattggggatggttgccgcactcccgggggaagaagaa

ggacaagactgtatgacttctatgtttgccccggtcatactgtaccaatagggtgtggag

ggccgggagagggctactgtggcaaatggggatgtgagaccactggacaggcatactgga

agccatcatcatcatgggacctaatttcccttaagcgaggaaacactcctaaggatcagg

gcccctgttatgattcctcggtctccagtggcgtccagggtgccacaccggggggtcgat

gcaaccccctggtcttagaattc。

（2）设计出如表1所示的引物和探针，对探针的5’端连接荧光报告基团fam，3’端连接荧光淬灭基团tamra；该引物和探针由基因合成公司合成。

（3）由基因合成公司直接合成设计好的rna，其长度为117bp，序列为cccuuaaagauaagauuaacccguggggcccccuaauaguuauggggaucuuggugagggcaggagccucgguacaacgugacagcccucaccagaucuucaauguuacuuggagag（seqidno.20），作为rna的标准品。

（4）制作标准曲线

1）将上述rna的标准品（x-mulvrna标准品）稀释至2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl，以制成不同浓度的rna模板；

2）配制反应体系：10μl2×onesteprt-pcrbufferⅲ、0.4μltakaraextaqhs、0.4μlprimescriptrtenzymemixⅱ、0.4μl上游引物、0.4μl下游引物、0.8μl探针、2μlrna模板、无rna酶水补足至反应体系总体积为20μl；

3）将上述反应体系按照一步法进行荧光定量pcr反应，反应条件为42℃/5min；95℃/30sec；95℃/5sec，60℃/30sec，共40个循环的逆转录反应；并在60℃退火延伸时采集荧光信号，并获得各浓度标准品的线性关系扩增曲线图，如图2所示；

4）以每一标准品浓度得到的cq值为纵坐标，以标准品拷贝数的对数为横坐标制作标准曲线，其中，cq值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所需要的循环数。线性关系y=3.5949x+15.88，r²=0.9994。

从图2可见，各浓度下的标准品的扩增结果稳定，扩增效率高，灵敏度高；获得的标准曲线的线性关系达到r²≥0.99。

以2×10copies/μl、2×10²copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁹copies/μl为灵敏度确认模板按照上述步骤（4）制作扩增曲线，扩增曲线如图9所示，其中2×10²copies/μl的样品的cq值≤35，而2×10copies/μl的样品的cq值＞35，可见灵敏度达到2×10²copies/μl。并且，图9中从左至右的曲线分别对应于拷贝数为2×10⁹copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10²copies/μl以及2×10copies/μl的样品对应的扩增曲线，每个浓度样品重复检测10次，可见cv%≤5%。

对比例1

基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表2所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl。

本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图3所示，从图3可见，在模板浓度高时，检测结果不稳定，扩增效率低，线性关系差。

对比例2

基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表3所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl。

本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图4所示，从图4可见，检测结果复孔稳定性差，扩增效率低导致灵敏度不高。

对比例3

基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表4所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl。

本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图5所示，从图5可见，在模板浓度高时，检测结果不稳定，模板浓度低时检测不到，灵敏度差。

对比例4

基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表5所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl。

本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图6所示，从图6可见，检测结果不稳定，扩增效率低，线性关系差。

对比例5

基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表6所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×10²copies/μl、2×10³copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁷copies/μl、2×10⁸copies/μl、2×10⁹copies/μl。

本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图7所示，从图7可见，无明显扩增曲线，特异性差。

结合上述pcr结果得知，第一组引物和探针具有较优的特异性和稳定性，以第一组引物和探针扩增的片段大小为117bp，基因序列位于env包膜核酸序列中，具有高度的保守性。

实施例2

（1）样品rna提取：将mv-1lu细胞传代培养长满培养瓶后，经-35℃反复冻融三次，收集培养液，离心取上清液，使用purelink™viralrna/dnaminikit（invitrogen）核酸提取试剂盒，从该上清液中提取样品rna，核酸量为10μl。

（2）以提取的样品rna为rna模板，以第一组引物和探针按照实施例1的反应体系和反应条件进行一步法荧光定量pcr反应，并按照实施例1的方法采集荧光信号。扩增曲线示意图如图8所示。

（3）根据实施例1以第一组引物探针对各浓度标准品进行扩增得到的标准曲线，准确定量检测样品中异嗜性小鼠白血病病毒的核酸含量。

实施例3

将mv-1lu细胞分别培养1天、2天、3天，并按照实施例2的方法收集培养1天、2天、3天的培养上清液提取rna，作为样品rna。

以实施例1稀释的浓度为2×10⁹至2×10⁴copies/ul的标准品作为标准品模板rna。

采用第一组引物对和探针分别对上述样品rna以及标准品模板rna按照实施例1的方法进行扩增，并以培养基为阴性对照，检测结果如图10所示，其中，“○”为标准品模板rna的检测结果，“×”为样品rna的检测结果，培养不同天数的样品rna分别检测多次，对多次检测结果取平均值，其中，培养1天的细胞上清检测结果cq值＞35，268copies/μl，培养2天的细胞上清检测结果cq值为30.23，8.80×10⁴copies/μl，培养3天的细胞上清检测结果cq值29.12，1.91×10⁵copies/μl。

本发明具有以下优点：

本发明采用一步法，相较于传统的两步法，可降低污染的概率，减少检测时间，反应体系添加时，可根据反应孔数将除模板rna外的其他成分制成预混液后分装至八连管或96孔板，以减小每孔之间的误差。

简单快速：在病毒去除效果验证中，对异嗜性小鼠白血病病毒的检测通常使用的是细胞实验，存在感染风险，需要时间长（8天左右），而本发明从核酸角度对异嗜性小鼠白血病病毒进行检测，从样品rna提取开始到获得只需4小时左右。且在操作前可对样品进行适当的灭活处理，减少污染与感染的风险。

灵敏度高：现有的检测方法，病毒含量在少量情况下，检测不到的情况有极大概率发生，但病毒含量少仍存在一定感染风险，本发明检测异嗜性小鼠白血病病毒时，rna标准品在10³~10⁸copies/μl浓度范围内，线性关系很好r²≥0.99，灵敏度达到2×10²copies/μl。重复性好、准确性高、特异性强：本发明在用于检测时，重复性sd≤0.5，以rna标准品制作标准曲线，定量样品rna量，体系模板一致，准确性高，以异嗜性小鼠白血病病毒env核酸序列设计引物和探针，特异性强。

回收率高：本发明从提取开始，荧光定量pcr方法回收率≥80%。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110>苏州良辰生物医药科技有限公司

<120>一种检测生物制品中异嗜性小鼠白血病病毒的方法

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>863

<212>dna

<213>异嗜性小鼠白血病病毒的env基因(murineleukemiavirusnfs-th-1xenotropicproviralpol&envgenes)

<400>1

ccctctctccaagctcacttacaggccctccaagcagtacaacgagaggtctggaagcca60

ctggccgctgcttatcaggaccagctggatcagccagtgataccacaccccttccgtgtc120

ggtgacgccgtgtgggtacgccggcaccagactaagaacttagaaccccgctggaaagga180

ccctacaccgtcctgctgaccacccccaccgctctcaaagtagacggcatctccgcgtgg240

atacacgccgctcacgtaaaggcggcgacaactcctccagccggaacagcatggaaggtt300

cagcgttctcaaaaccccttaaagataagattaacccgtggggccccctaatagttatgg360

ggatcttggtgagggcaggagcctcggtacaacgtgacagccctcaccagatcttcaatg420

ttacttggagagttaccaacctaatgacaggacaaacagctaacgccacctccctcctgg480

ggacgatgacagacaccttccctaaactatattttgacctgtgtgatttagtaggagact540

actgggatgacccagaacccgatattggggatggttgccgcactcccgggggaagaagaa600

ggacaagactgtatgacttctatgtttgccccggtcatactgtaccaatagggtgtggag660

ggccgggagagggctactgtggcaaatggggatgtgagaccactggacaggcatactgga720

agccatcatcatcatgggacctaatttcccttaagcgaggaaacactcctaaggatcagg780

gcccctgttatgattcctcggtctccagtggcgtccagggtgccacaccggggggtcgat840

gcaaccccctggtcttagaattc863

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>2

cccttaaagataagattaaccc22

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>3

ctctccaagtaacattgaag20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>4

cgttgtaccgaggctcctgc20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>5

tggggatcttggtgagggca20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>6

tgtcatcgtccccaggaggg20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>7

gcctcggtacaacgtgacagcc22

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>8

ccagccggaacagcatggaa20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>9

tgccctcaccaagatcccca20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>10

aacccgtggggccccctaat20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>11

gaaccccgctggaaaggacc20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>12

tgccctcaccaagatcccca20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>13

tcctgctgaccacccccacc20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>14

cacccccaccgctctcaaag20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>15

tgccctcaccaagatcccca20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>16

cgctcacgtaaaggcggcga20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>17

aaaggcggcgacaactcctc20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>18

tgccctcaccaagatcccca20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>19

aacccgtggggccccctaat20

<210>20

<211>117

<212>rna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>20

cccuuaaagauaagauuaacccguggggcccccuaauaguuauggggaucuuggugaggg60

caggagccucgguacaacgugacagcccucaccagaucuucaauguuacuuggagag117