中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-RPA检测引物和探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体地说，涉及中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测引物和探针及试剂盒。

背景技术：

中华蜜蜂是我国特有的蜂种，在我国的农业作物开花授粉及野生植物的多样性具有重要的生态意义。但是自上个世纪70年代以来，中华蜜蜂一直受到中华蜜蜂囊状幼虫病毒病的威胁，给中华蜜蜂的健康发展带来严重的阻碍。中华蜜蜂囊状幼虫病，是由中华蜜蜂囊状幼虫病毒（chinesesacbroodvirus，csbv）引起的一种高致病性、高传染性的病毒性疾病，俗称为“烂子病”，可以造成蜜蜂幼虫的大量死亡。csbv属于小rna病毒科，基因组由长约8.8kb的单股正链rna分子组成，整个基因组有一个大的开放阅读框（orf）。csbv编码四种结构蛋白（vp1~vp4）。中华蜜蜂囊状幼虫病毒的传播分为水平和垂直传播，其水平传播更为广泛，大体可以归纳为群内传播、群间传播、蜂场间传播和地区间传播四个途径。更为严重的是，在发现有典型症状时，蜂群已感染非常严重，一般采取毁巢或焚烧的手段阻止病毒的传播，给蜂农带来巨大经济损失，并严重影响到农作物的开花授粉。开发有效的病毒早期检测与诊断技术，做到早发现、早预防、早控制显得尤为重要。

对csbv的早期、快速和有效检测是预防和控制疫情传播的重要手段之一，目前，已经建立了多种csbv检测方法，主要包括病毒分离鉴定、间接免疫荧光方法、免疫电镜法和elisa等传统方法，但这些传统方法费时费力、灵敏性较低，随着分子生物学的发展，一系列pcr方法也建立起来，如rt-pcr、实时荧光rt-pcr等。rt-pcr方法需要精确度高、操作复杂和价格昂贵的pcr仪，并且需要良好的实验室条件和熟练的技术人员，因此，rt-pcr系列检测方法不适合于在基层开展，更不适合养蜂场的现场检测，现有的用于csbv检测的等温检测方法，主要包括rt-lamp，上述等温方法一般需要45-60min才能完成检测，并且rt-lamp方法需要设计6条引物，且有时难以设计精确的引物，而且需要较长时间才能完成检测。

重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是一种新型等温扩增技术，通过一对引物与模板同源区域特异性结合形成重组酶引物复合体，实现链置换作用，并在dna聚合酶作用下实现延伸。该技术在一定温度条件下可实现对目标产物的扩增从而达到检测目的，无需经历热循环过程，大大简化了对大型仪器的需求，缩短了反应时间，操作简单方便，可满足现场应急对病原体快速诊断的需求，近年来成为分子诊断行业的研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测引物和探针及试剂盒。

本发明的另一目的是提供中华蜜蜂囊状幼虫病毒的rt-rpa检测方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测引物和探针，上、下游引物和探针序列分别如下（seqidno:1-3）：

上游引物：5’-atcacctagtggagcgcccatcaccgtagt-3’

下游引物：5’-cattatcaaatcatcaccgtagcagaacaa-3’

探针：5’-atattttatatgtttttgtagcttgggaga[fam-dt]gc[thf]ag[bhq-dt]aggaagtaaagaa[c3-spacer]-3’。

上述引物和探针是根据已经公开的中华蜜蜂囊状幼虫病毒基因组序列（genbank:hm237361.1），通过分析其保守的rna依赖的rna聚合酶基因序列，设计了若干套rt-rpa检测引物和探针方案，并从中筛选出检测效果最佳（灵敏度和特异性较好）的引物及探针。

第二方面，本发明提供含有seqidno:1-3所示引物和探针的检测试剂或试剂盒。

第三方面，本发明提供中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测试剂盒，所述试剂盒包括seqidno:1-3所示引物和探针，还含有反转录酶（如m-mlv反转录酶）、结合单链核酸的dna重组酶、单链dna结合蛋白、链置换dna聚合酶、磷酸激酶、atp、标准阳性模板（体外转录rna标准分子，其序列参见genbank:mn395732.1）、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、rna酶抑制剂、酶扩增八联管等中的至少一种。

第四方面，本发明提供一种利用rt-rpa技术检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的方法（含非诊断目的），包括以下步骤：

1）提取待测样本（蜜蜂幼虫）总rna；

2）配制含有seqidno:1-3所示引物和探针的rt-rpa反应体系，向反应体系中加入上述提取的总rna，进行rt-rpa扩增；

3）分析扩增产物。

所述rt-rpa反应体系包括（按总体积50ul计）：

再水化缓冲液12.5ul

20umol/l上游引物2ul

20umol/l下游引物2ul

10umol/l探针0.6ul

rna模板1ul

ddh2o29.4ul

280mm醋酸镁溶液2.5ul

rt-rpa扩增条件为：37-42℃，20-30min。优选39℃，20min。

前述的方法，步骤3）包括：根据是否出现扩增曲线，分析待测样本中是否含有中华蜜蜂囊状幼虫病毒；如果有相应的扩增曲线表示待测样本含有中华蜜蜂囊状幼虫病毒，结果为阳性；如果没有扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到中华蜜蜂囊状幼虫病毒，结果为阴性。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明首次采用rt-rpa技术建立快速检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的方法，并通过特异性、灵敏度及稳定性评价，可用于临床现场检测，为csbv现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

（二）本发明的引物和探针组合是根据靶标序列设计多对rpa引物、探针，并经大量实验筛选、反复优化获得的，特异性好，与其他病毒无交叉反应，能将csbv与其他病毒如蜜蜂残翅病毒（dwv）、以色列急性麻痹病毒（iapv）、慢性麻痹病毒（cbpv）有效鉴别开来。

（三）通过rpa反应能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平，本发明所建立的检测方法可检测出单拷贝的核酸。

（四）检测速度快，与常规pcr相比，不经过变温历程，约20min即可完成反应，尤其适于基层实验室和现场快速核酸检测。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中csbv实时荧光rt-rpa方法的特异性分析结果。其中，1和2分别表示不同地区来源的csbv检测结果。

图2为本发明较佳实施例中csbv实时荧光rt-rpa方法的灵敏性分析结果。

具体实施方式

本发明提供一种可以快速检测csbv的逆转录重组酶聚合酶等温扩增（rt-rpa）检测方法，该方法不仅可以快速检测csbv，而且不需要价格昂贵的pcr扩增仪等仪器，节约成本，对蜂群的日常监测、流行病学调查具有重要意义。

本发明提供的技术方案之一：

一种快速检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的引物组，所述引物组的核苷酸序列如下：

csbv-f:5’-atcacctagtggagcgcccatcaccgtagt-3’(seqidno:1)

csbv-r:5’-cattatcaaatcatcaccgtagcagaacaa-3’(seqidno:2)

一种快速检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的probe探针，序列如下：

atattttatatgtttttgtagcttgggaga[fam-dt]gc[thf]ag[bhq-dt]aggaagtaaagaa[c3-spacer](seqidno:3)。

本发明提供的技术方案之二：

一种中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测试剂盒，该试剂盒包含seqidno:1所示的上游引物，seqidno:2所示的下游引物；seqidno:3所示的探针；扩增靶基因序列的重组酶聚合酶试剂。

进一步地，所述的试剂盒还含有阳性对照、醋酸镁溶液（mgoac）、反应管。

优选地，所述反应管内储存有以干粉形式存在的：m-mlv反转录酶、dna重组酶、dna聚合酶、单链结合蛋白、磷酸激酶和atp、rna酶抑制剂。

所述阳性对照为体外转录rna标准分子。其序列参见genbank:mn395732.1。

本发明提供的技术方案之三：

一种快速检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa方法，包括以下步骤：

1)从感染的蜜蜂幼虫中提取总rna

2)rt-rpa：以提取的总rna为模板，使用上述的试剂盒进行rt-rpa反应；

3)结果分析：将反应管置于荧光检测仪中，观察有无明显的扩增曲线。如果有明显的扩增曲线则判定样本阳性；如果没有明显扩增曲线则判定样本阴性。

前述的rt-rpa方法，步骤2)中rt-rpa的反应体系包括（按总体积50ul计）：

再水化缓冲液12.5ul

20umol/l上游引物2ul

20umol/l下游引物2ul

10umol/l探针0.6ul

rna模板1ul

ddh2o29.4ul

280mm醋酸镁溶液2.5ul

rt-rpa的反应程序为：39℃反应20min。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册（sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用twistdx公司生产的twistamp^tmrtexokit试剂盒，包括再水化缓冲溶液、mgoac、m-mlv反转录酶、dna重组酶、dna聚合酶、单链结合蛋白、磷酸激酶、atp等试剂，其中，m-mlv反转录酶、dna重组酶、dna聚合酶、单链结合蛋白、磷酸激酶、atp等试剂以干粉的形式贮存在酶扩增八联管内。

实施例1特异性rpa引物和探针的设计

根据已经公开的中华蜜蜂囊状幼虫病毒基因组序列（genbank:hm237361.1），通过分析其保守的rna依赖的rna聚合酶基因序列，进行引物设计，并对所设计的引物进行初步筛选，获得一对灵敏度和特异性较好的用于扩增csbv特异性序列的引物对csbv-f和csbv-r，序列如下：

csbv-f:5’-atcacctagtggagcgcccatcaccgtagt-3’(seqidno:1)

csbv-r:5’-cattatcaaatcatcaccgtagcagaacaa-3’(seqidno:2)

扩增片段长度为166bp。

进一步设计出与靶基因序列互补的探针，探针序列如下：

atattttatatgtttttgtagcttgggaga[fam-dt]gc[thf]ag[bhq-dt]aggaagtaaagaa[c3-spacer](seqidno:3)。

实施例2用于检测csbv的rt-rpa试剂盒的建立

中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测试剂盒，该试剂盒包含seqidno:1所示的上游引物，seqidno:2所示的下游引物；seqidno:3所示的探针；阳性对照、mgoac、反应管。

所述反应管内储存有以干粉形式存在的：m-mlv反转录酶、dna重组酶、dna聚合酶、单链结合蛋白、磷酸激酶和atp、rna酶抑制剂。

所述的阳性对照为体外转录rna标准分子。其序列参见genbank:mn395732.1。

实施例3rt-rpa检测方法的建立

rt-rpa扩增所采用的反应体系如下（按总体积50ul计）：

再水化缓冲液12.5ul

20umol/l上游引物2ul

20umol/l下游引物2ul

10umol/l探针0.6ul

rna模板1ul

ddh2o29.4ul

280mm醋酸镁溶液2.5ul

rt-rpa的反应程序为：39℃反应20min。

将配置完成的反应管放置于荧光检测仪，根据仪器检测到的荧光信号，观察是否生成荧光信号曲线。

结果判断标准如下：

1)在20分钟内，有明显的扩增曲线生成，判断为阳性样本；

2)在20分钟内，没有明显的扩增曲线生成，判断为阴性样本。

实施例4临床样品的检测

分别将四川、贵州感染中华蜜蜂囊状幼虫病毒的蜜蜂幼虫提取rna作为模板，利用实施例3的方法进行rt-rpa检测。结果如图1所示，四川、贵州感染蜂样都生成荧光曲线，水对照没有扩增曲线，表明该检测方法特异性良好。

实施例5灵敏性分析

将贵州感染中华蜜蜂囊状幼虫病毒的幼虫提取rna作为模板，将总rna分别稀释成1000ng、100ng、10ng、1ng，然后进行rt-rpa检测。结果如图2所示，感染蜂样都生成荧光曲线，且随着rna浓度的降低，起峰越来越晚，水对照没有扩增曲线，说明该检测方法灵敏性良好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院蜜蜂研究所

<120>中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测引物和探针及试剂盒

<130>khp201114230.4

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atcacctagtggagcgcccatcaccgtagt30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cattatcaaatcatcaccgtagcagaacaa30

<210>3

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atattttatatgtttttgtagcttgggagagcagtaggaagtaaagaa48